銀杏葉總黃酮超聲輔助提取條件優(yōu)化及其清除羥自由基能力

閆旭宇1,2,李 玲

(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心,陜西延安 716000; 2.湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,湖南永州 425199)

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬植物,在我國絕大部分地區(qū)均有分布。我國為世界銀杏的主產(chǎn)地[1]。銀杏葉的活性成分包括黃酮、萜內(nèi)酯、銀杏酸等主要成分,以及蛋白、多糖、維生素等其他物質(zhì)[1-2]。其中,黃酮和萜內(nèi)酯是發(fā)揮藥效的主要成分,具有抗氧化、抑制血小板活化因子、擴張血管、調(diào)血脂等藥理作用,在臨床上用來治療血栓、炎癥和心血管疾病[3-4]。我國擁有世界70%以上的銀杏資源,可見,開發(fā)與利用銀杏葉資源意義重大。

目前,從銀杏葉中已鑒別出40多種黃酮類化合物。由于黃酮類化合物大多都含有游離羥基,易溶解于極性較大的有機溶劑[5],有機溶劑提取法是常用提取方法之一。尤其是有機溶劑乙醇無毒且易回收,乙醇浸提法是當前國內(nèi)外采用最廣泛的提取銀杏葉總黃酮的方法,得率在2%左右[5]。雖然乙醇浸提法操作簡單,但其存在得率偏低、耗時費材料等缺陷,研究發(fā)現(xiàn)采用微波、超聲波、加酶等輔助手段可以明顯提高得率[6-8]。利用超聲波破壞植物的細胞壁,提高溶劑進入細胞的速度,縮短提取時間,提高活性成分溶解率和得率[5,9]。同時,黃酮類化合物含有的游離羥基結(jié)構(gòu)決定了其較強的捕獲活性氧等自由基的能力,可作為一種天然安全有效抗氧化劑,減輕過量自由基對機體的損害,進而降低心血管疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生[10-11]。因此,在考慮成本情況下,采用超聲輔助乙醇提取銀杏葉總黃酮,有助于提高黃酮得率。

本研究以銀杏葉為材料,以總黃酮得率為指標,利用超聲輔助乙醇提取銀杏葉總黃酮,用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化銀杏葉總黃酮的提取工藝條件,并初步研究總黃酮對羥自由基的清除作用,以期為進一步開發(fā)利用銀杏葉資源提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏葉 采自延安大學(xué)校園內(nèi),選取新鮮、健康、無病蟲害的葉片;無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、水楊酸、過氧化氫、抗壞血酸 所用試劑均為國產(chǎn)分析純,陜西和平化玻有限公司;蘆丁標準品(HPLC≥98%) 上海一基生物試劑有限公司。

FW-100D型植物粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司;WG-71型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;AUX220型分析天平 日本島津公司;KQ500B型超聲波清洗儀 昆山超聲儀器有限公司;RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器責任有限公司;UV-2600型紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏葉總黃酮的提取工藝流程 銀杏葉→清洗→60 ℃烘干至恒重→粉碎→過篩(80目)→超聲輔助乙醇回流提取(300 W)→提取兩次合并粗提液→室溫減壓抽濾→濾液減壓旋蒸→定容→提取液

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制 以蘆丁為標準品,在已配制好的不同濃度的標準溶液中,加入NaNO2、Al(NO3)3、NaOH溶液,發(fā)生顯色反應(yīng)[12]。以不加蘆丁對照品溶液為參比,在510 nm處測吸光度,以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標,繪制標準曲線,得線性回歸方程y=12.816x+0.0053,R2=0.9981。

1.2.3 銀杏葉黃酮含量的測定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定總黃酮[12]。根據(jù)回歸方程計算出提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度,然后計算銀杏葉中總黃酮的得率(%):

式(1)

式中:Y為總黃酮得率(%),C為提取液中總黃酮濃度(mg/mL),V為定容體積(mL),N為稀釋倍數(shù),M為稱量的銀杏葉粉末質(zhì)量(g)。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 乙醇濃度的選擇 準確稱取2.0 g干燥的銀杏葉粉末5份,分別按料液比1∶25 (g/mL)加入濃度為70%、75%、80%、85%、90%的乙醇,在70 ℃的條件下超聲回流50 min,研究乙醇濃度對銀杏葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.2 料液比的選擇 準確稱取2.0 g干燥的銀杏葉粉末5份,分別加入料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)的濃度為75%的乙醇,在70 ℃的條件下超聲回流50 min,研究料液比對銀杏葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.3 提取溫度的選擇 準確稱取2.0 g干燥的銀杏葉粉末5份,分別加入料液比為1∶25 (g/mL)的濃度為75%的乙醇,分別在65、70、75、80、85 ℃的條件下超聲回流50 min,研究提取溫度對銀杏葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.4 提取時間的選擇 準確稱取2.0 g干燥的銀杏葉粉末5份,分別加入料液比為1∶25 (g/mL)的濃度為75%的乙醇,在70 ℃的條件下超聲回流30、40、50、60、70 min,研究提取時間對銀杏葉總黃酮得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,以總黃酮得率為響應(yīng)值,對影響總黃酮得率的乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間4個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗,確定超聲波輔助提取銀杏葉總黃酮的最佳工藝條件。各因素的水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table ofresponse surface methodology

1.2.6 銀杏葉總黃酮清除羥自由基試驗 銀杏葉總黃酮及VC對羥基自由基的清除率,采用水楊酸法[11]進行測定。其中,總黃酮濃度(mg/mL)是以總黃酮含量計算的。羥基自由基的清除率計算公式如下:

式(2)

式中,E為羥基自由基清除率(%),A0為空白對照液的吸光值,Am為加入黃酮后的吸光值,An為不加H2O2時黃酮的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用響應(yīng)面分析軟件Design Expert V 8.0.6.1的Box-Behnken Design進行實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析,以及采用Microsoft Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標準差”形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度的確定 如圖1可知,隨著乙醇濃度的提高,銀杏葉總黃酮得率逐漸增加,當乙醇濃度超過75%后,總黃酮得率緩慢增加,在80%時達到最高,之后總黃酮得率緩慢降低。由此表明,乙醇濃度高于適宜提取濃度不僅會增加其它脂溶性物質(zhì)的溶出量,降低總黃酮的相對溶出量,而且提高了投料成本[13]。考慮到提取效果及成本,最終確定乙醇的適宜濃度為80%。

圖1 不同乙醇濃度下總黃酮的得率Fig.1 The yield of total flavonoidsunder different ethanol concentrations

2.1.2 料液比的確定 由圖2可知,隨著提取液體積的增加,銀杏葉總黃酮得率先升后降。在料液比為1∶25 g/mL時,總黃酮得率達到最大值;料液比為1∶35 g/mL時的得率略低于1∶20 g/mL時的得率,但高于1∶15 g/mL時的得率。由此表明,料液比為1∶25 g/mL時銀杏葉總黃酮已經(jīng)充分提取出來;繼續(xù)增加提取液提高了其他物質(zhì)的溶出,降低了總黃酮的相對比率。因此,料液比的適宜取值為1∶25 g/mL。

圖2 不同料液比條件下總黃酮的得率Fig.2 The yield of total flavonoidsunder different material-to-liquid ratios

2.1.3 提取溫度的確定 如圖3可知,隨著提取溫度由65 ℃上升到80 ℃,銀杏葉總黃酮得率直線上升,在80 ℃時得率最大,85 ℃時得率明顯下降。這表明溫度較低時,總黃酮溶出較慢,但高于80 ℃的溫度時,不僅提取溶劑乙醇易揮發(fā),而且會破壞部分黃酮物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其降解,加之雜質(zhì)溶出也會增多,導(dǎo)致總黃酮的提取效果降低[14]。故最終提取的適宜溫度為80 ℃。需要指出的是提取溫度水平的設(shè)定,單因素實驗結(jié)果最佳溫度是80 ℃,但是當溫度為70和85 ℃時,得率相近,考慮到提取效果及成本,特選取70、75、80 ℃作為響應(yīng)面試驗溫度的三個水平。

圖3 不同提取溫度下總黃酮的得率Fig.3 The yield of total flavonoidsunder different extraction temperatures

2.1.4 提取時間的確定 如圖4可知,隨著超聲回流提取時間的延長,銀杏葉總黃酮得率先升后降,在50 min時達到最大值,之后繼續(xù)延長超聲時間,總黃酮得率明顯下降。這可能是由于超聲回流提取超過一定時間,提取溶劑損失量增加,黃酮穩(wěn)定性變差,同時引起其他物質(zhì)溶出,使總黃酮含量相對下降[11,14]。故控制提取時間在50 min左右時,提取效果較好。

圖4 不同超聲時間下總黃酮的得率Fig.4 The yield of total flavonoidsunder different ultrasonic time

2.2 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上,以總黃酮得率為響應(yīng)值,對影響得率的乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間四個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。各因素水平優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 銀杏葉總黃酮提取響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and experiment results of response surfacemethodology of total flavonoids extraction rate from Ginkgo biloba leaves

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析 基于響應(yīng)面試驗結(jié)果(表2),采用Design Expert 8. 0. 6軟件進行多元擬合回歸分析,得到以銀杏葉總黃酮得率為響應(yīng)值的四元二次回歸模型方程:

Y=3.46+0.1A+0.087B+0.062C+0.057D+0.085AB+0.032AC+0.038AD+0.02BC+0.032BD-0.02CD-0.093A2-0.049B2-0.077C2-0.08D2。

由方程一次項可知,影響銀杏葉總黃酮得率的因素順序為:乙醇濃度>料液比>提取溫度>提取時間。由回歸模型方差分析結(jié)果(表3)可知,模型的P<0.0001,極顯著,該模型有意義;失擬項P>0.05,不顯著,說明模型與試驗的差異值較小,由決定系數(shù)R2可知響應(yīng)值的變化有93.97%來源于四個試驗因素,回歸模型擬合度良好,預(yù)測值與實測值之間相關(guān)性較好,試驗誤差較小,可很好的描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[15]。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

回歸模型方差分析中一次項的PA、PB、PC、PD、PAB、PA2、PC2、PD2值均小于0.01,PB2小于0.05,說明四個因素的一次項和二次項、乙醇濃度和料液比的交互項均存在顯著性,而因素間的交互項及失擬項顯著性相對較差。表明四個因素對響應(yīng)值總黃酮得率均存在顯著影響,其關(guān)系是一種非線性關(guān)系[15-16]。

由方差分析可知,乙醇濃度和料液比的交互作用對銀杏葉總黃酮得率影響達到極顯著水平(P<0.01)。為更直觀形象地說明其交互影響作用,利用Design Expert 8. 0. 6軟件對交互項作響應(yīng)曲面圖和等高線圖(圖5)。可以看出,乙醇濃度和料液比相互作用的響應(yīng)面曲面坡度較陡峭,等高線圖基本呈扁平橢圓狀,表明乙醇濃度和料液比交互作用較強,對銀杏葉總黃酮得率的影響顯著[15-17]。

圖5 乙醇濃度和料液比對銀杏葉總黃酮得率的交互影響Fig.5 Effect of interaction of ethanol concentrationand material-to-liquid ratio on total flavonoidsyield from Ginkgo biloba leaves

2.2.3 最佳提取條件的確定與驗證 用Design Expert 8. 0. 6軟件進一步分析回歸方程,得出銀杏葉總黃酮提取的最適條件為:乙醇濃度80.66%、料液比1∶25.58 g/mL、提取溫度75.47 ℃、提取時間50.57 min,預(yù)測得率為3.606%。考慮到實際操作的局限性,提取工藝最終修正為:乙醇濃度81%、料液比1∶26 g/mL、提取溫度75 ℃、提取時間51 min。此條件下進行試驗驗證,重復(fù)試驗3次,銀杏葉總黃酮實際得率為3.58%,與預(yù)測值(3.606%)接近,其相對誤差為0.72%。本實驗超聲輔助乙醇提取銀杏葉總黃酮的得率高于乙醇浸提法的得率2.20%[18],以及高于利用該法的張光輝等的得率2.82%[7],并且略高于霍銀強等的得率3.51%[19],這可能是由于本實驗中乙醇濃度81%高于張光輝等的75%,以及超聲功率300 W高于霍銀強等的100 W,相對較高的乙醇濃度和超聲功率會導(dǎo)致短時間內(nèi)總黃酮的最大溶出,以及與選取材料不同及總黃酮得率計算方法不同有關(guān)[20]。

2.3 銀杏葉總黃酮對羥自由基的清除作用

銀杏葉總黃酮對羥自由基(·OH)的清除結(jié)果見圖6。銀杏葉總黃酮和VC對羥自由基的清除率均隨濃度的增加而逐漸增加,清除羥自由基能力與濃度存在一定的量效關(guān)系[11]。在相同濃度下,銀杏葉總黃酮對·OH的清除率高于VC,說明銀杏葉總黃酮具有一定的抗氧化能力。

圖6 銀杏葉總黃酮對羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging ability oftotal flavonoids extracted from Ginkgo biloba leaves

3 結(jié)論

本研究采用超聲輔助乙醇提取銀杏葉總黃酮,根據(jù)單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化分析得到銀杏葉總黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度81%、料液比1∶26 g/mL、提取溫度75 ℃、提取時間51 min,銀杏葉總黃酮得率為3.58%。由方差分析和因素間交互作用分析得出,四個因素對銀杏葉總黃酮提取均有顯著影響(P<0.05),順序為:乙醇濃度>料液比>提取溫度>提取時間,且乙醇濃度和料液比對銀杏葉總黃酮得率的交互影響較強。本研究采用的超聲輔助乙醇法可靠,適宜于在省時間、低耗能的條件下提取銀杏葉總黃酮,并在提取時要優(yōu)先考慮乙醇濃度和料液比對總黃酮得率的交互影響。在相同質(zhì)量濃度下,本實驗提取的銀杏葉總黃酮對羥自由基的清除效果高于VC,具有較強的抗氧化活性,可以作為一種羥基自由基的天然清除劑進行開發(fā)應(yīng)用。