綠豆蛋白降血脂水解物的制備及純化工藝

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(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134; 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津 301617)

綠豆原產(chǎn)于中國,又名青小豆、植豆,富含蛋白質(zhì)、淀粉、各種維生素及礦物質(zhì),其中蛋白質(zhì)的含量為22%～26%[1],是小麥、小米和大米的2～3倍。此外,綠豆中賴氨酸含量是禾谷類的2～5倍[2]。近年來,針對綠豆的研究逐漸從綠豆淀粉和多糖轉(zhuǎn)移到綠豆蛋白及其蛋白水解肽上[3],已有研究表明綠豆蛋白及其水解肽具有抗氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功效[4]。馬詩文等[5]用復(fù)合酶協(xié)同水解法制備綠豆抗氧化活性多肽,得到的多肽具有良好的抗氧化活性;Xie等[6]研究了不同分子量綠豆蛋白水解物的抗氧化活性和對血管緊張素-I轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制作用,結(jié)果顯示分子量小于3 kDa的部分具有較好的抗氧化活性和對ACE更好的抑制作用;Diao等[7]發(fā)現(xiàn)綠豆蛋白水解物對促炎因子有較強的抑制作用,從而減弱炎癥反應(yīng),起到免疫調(diào)節(jié)作用。

高血脂癥是由于體內(nèi)脂質(zhì)代謝或者轉(zhuǎn)運異常導(dǎo)致的一種慢性疾病,主要指標(biāo)是體內(nèi)甘油三酯或者膽固醇水平高于正常值[8]。血脂水平與冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的形成密切相關(guān),已經(jīng)成為現(xiàn)代社會的高發(fā)病率之一的疾病[9-11]。傳統(tǒng)降血脂藥物往往具有一定副作用,例如他汀類藥物對肝腎功能會造成一定的損傷,還會引起橫紋肌溶解癥等[12];而作為需要長期服用的降血脂類藥物,價格昂貴也是限制其發(fā)展的一個重要原因,因此尋找合適有效的藥品替代物成為當(dāng)前研究熱點[13]。目前已有研究證實綠豆具有降血脂的作用,Ruvini等用生綠豆、煮熟的綠豆和發(fā)芽的綠豆分別喂食高膽固醇大鼠,發(fā)現(xiàn)煮熟和發(fā)芽的綠豆均可使高膽固醇大鼠血清中非高密度脂蛋白膽固醇濃度降低和高密度脂蛋白膽固醇濃度增加[14];Swee等研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵綠豆在高膽固醇小鼠體內(nèi)有抗氧化和降血脂的作用[15];王沛發(fā)現(xiàn)綠豆水醇提取物對高脂血癥家兔有良好的降血脂效果[16]。膽汁酸是人體中含量豐富的一種固醇物質(zhì),包括初級膽汁酸(如膽酸)和次級膽汁酸(如脫氧膽酸),一般以鹽的形式存在,其在脂肪和膽固醇合成中起到重要作用。目前關(guān)于綠豆蛋白水解物的降血脂作用的研究還鮮有報道,因此以與膽酸鹽結(jié)合能力為出發(fā)點,研究綠豆蛋白水解物體外降血脂的作用。

本文采用酶水解的方法,以水解物對膽酸鹽的絡(luò)合能力為考察指標(biāo),在單因素實驗的基礎(chǔ)上,使用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計進行水解工藝優(yōu)化,并進行超濾純化得到綠豆蛋白降血脂水解物,篩選出降血脂作用較強的水解部分,為進一步開發(fā)利用綠豆蛋白提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆 津早綠一號綠豆,采購于天津市靜海區(qū);考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白 天津德思化學(xué)試劑有限公司;濃硫酸 分析純,永飛化學(xué)試劑有限公司;中性蛋白酶(100 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、胰蛋白酶(250 USPu/mg)、復(fù)合蛋白酶(120 U/mg)、脫氧膽酸鈉(>98%)、膽酸鈉(>98%)、?；悄懰徕c(>98%) 源葉生物科技有限公司;8×USP豬胰酶 生工生物工程有限公司;其他試劑 購于天津市化學(xué)試劑供銷公司;所有試劑 均為國產(chǎn)級分析純；實驗用水 均為去離子水。

DH-101電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;FW100型高速萬能粉碎機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;ME204型電子天平 梅特勒托利多(上海)有限公司;TDA-8002型恒溫水浴鍋 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;KQ-500B型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Heraeus Megafuge 8R型離心機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;多功能讀板機 美國Molecular Devices SpectraMax-M5;pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;ALPHA1-4LD真空冷凍干燥機 德國Marin Christ;超濾管 Sartorius;AKTA Start蛋白質(zhì)層析系統(tǒng) 美國GE;Sephacryl S-100 High Resolution凝膠層析柱(長600 mm,直徑26 mm,填料粒徑為47 μm) GE Healthcare;SHZ-CD型循環(huán)式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的處理制備 綠豆洗凈烘干,用粉碎機磨成粉,過80目篩儲存?zhèn)溆谩０凑?∶15的料液比在綠豆粉里加入PBS緩沖液(pH=10.0),40 ℃超聲輔助提取8 min。將提取液離心(4 ℃,500 r/min,20 min),取上清液,用0.05 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)其pH=4.6,攪拌使沉淀均勻。隨后離心(4 ℃,500 r/min,15 min)棄上清,經(jīng)冷凍干燥后得綠豆粗蛋白[17]。

1.2.2 理化指標(biāo)的測定 蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[18]。多糖含量的測定采用苯酚硫酸法[19]。

1.2.3 蛋白酶的篩選 采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶5種蛋白酶分別水解綠豆蛋白。控制底物濃度為1 g/100 mL,加酶量10000 U/g,在5種酶的最適pH和最適溫度下水解120 min。隨后,100 ℃水浴加熱5 min滅酶,將各水解液離心(5000 r/min,10 min)取上清液凍干后儲存?zhèn)溆?。將凍干的水解物配制? g/100 mL,以水解物對膽酸鹽的吸附能力為考察指標(biāo),篩選出制備水解物的最佳蛋白酶。

1.2.4 膽酸鹽吸附實驗 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定[20]:配制0.4 mmol/L的膽酸鈉、脫氧膽酸鈉和?；悄懰徕c標(biāo)準(zhǔn)液備用。分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL帶蓋玻璃瓶中,用0.1 mol/L的PBS補充至2.5 mL。然后加入7.5 mL 60%的硫酸溶液,于70 ℃水浴加熱反應(yīng)50 min后冰浴5 min。分別對同濃度的3種膽酸鹽進行全波長掃描(200～1000 nm)得到其最大吸收波長。在最大波長處測定反應(yīng)后溶液的OD值,計算得到3種膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

人工胃液的制備:取1 mol/L鹽酸16.4 mL,加入800 mL純水,再加入10 g胃蛋白酶,搖勻溶解后加水定容至1000 mL。

人工腸液的制備:準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀6.8 g,溶解于500 mL純水中,用0.4%的NaOH溶液將pH調(diào)制6.8,加入豬胰酶5 g溶解后定容至1000 mL。

綠豆蛋白水解產(chǎn)物對膽酸鹽絡(luò)合能力的測定[21]:分別取不同條件下的水解產(chǎn)物1 mL(1 g/100 mL),加入1 mL人工胃液,在37 ℃水浴鍋中恒溫水浴60 min。隨后,加入5 mL人工腸液模擬腸環(huán)境,加入4 mL 0.02 mmol/L的膽酸鹽溶液繼續(xù)37 ℃恒溫水浴60 min。底物空白組用0.1 mol/L的PBS代替膽酸鹽。膽酸鹽空白組只加入4 mL 0.02 mmol/L的膽酸鹽溶液,其他用0.1 mol/L的PBS代替。反應(yīng)結(jié)束后將樣品倒入離心管,8500 r/min離心15 min后取上清液2.5 mL,加入7.5 mL 60%的硫酸溶液,于70 ℃水浴加熱反應(yīng)50 min后冰浴5 min。冷卻后在膽酸鹽最大波長處測定吸光值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得上清液中膽酸鹽的濃度。并按下述公式進行計算:

式中:W為膽酸鹽結(jié)合率,%;C0為膽酸鹽空白組的濃度,mmol/L;C1為上清液中膽酸鹽的濃度,mmol/L。

1.2.5 單因素實驗設(shè)計 選取水解時間(min)、加酶量(U/g)、底物濃度(g/100 mL)、水解溫度(℃)作為考察因素,設(shè)計單因素實驗。每個因素設(shè)置5個水平的實驗,以水解物與脫氧膽酸鈉結(jié)合率為指標(biāo)分別對這四個因素的影響進行分析。

1.2.5.1 水解時間對水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響 控制加酶量為10000 U/g,底物濃度為1 g/100 mL,水解溫度固定為45 ℃,考察水解時間分別為60、90、120、150和180 min時水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力。

1.2.5.2 加酶量對水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響 控制水解時間為120 min,底物濃度為1 g/100 mL,水解溫度固定為45 ℃,考察加酶量分別為6000、10000、14000、18000和22000 U/g時水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力。

1.2.5.3 底物濃度對水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響 控制水解時間為120 min,加酶量為10000 U/g,水解溫度固定為45 ℃,考察底物濃度分別為1、2、3、4和5 g/100 mL時水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力。

1.2.5.4 水解溫度對水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響 控制水解時間為120 min,加酶量為10000 U/g,底物濃度為1 g/100 mL,考察水解溫度分別為35、45、55、65和75 ℃時水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力。

1.2.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)之上,選取水解時間(min)、底物濃度(g/100 mL)、加酶量(U/g)、水解溫度(℃)為影響因素,綠豆蛋白水解物與脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力為考察指標(biāo),使用Design-Expert.V8.0.6軟件進行表1所示的四因素三水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計,優(yōu)化綠豆蛋白水解的工藝條件。

表1 響應(yīng)面試驗因素和水平表Table 1 Factors and levels table of response surface test

1.2.7 水解物超濾分級和純化 綠豆蛋白水解物離心后的上清液經(jīng)過5 kDa的超濾管分級[22]、超濾后分別測定截留液和透過液結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力,選取結(jié)合脫氧膽酸鈉能力較好的部分進行后續(xù)實驗。

Sephacryl S-100 High Resolution凝膠層析柱對水解物的純化分離[23],使用超純水做洗脫液進行純化收集?？刂葡疵摿魉贋?.8 mL/min,上樣濃度為40 mg/mL,上樣量為1 mL,檢測波長為280 nm。收集得到的水解物進行冷凍干燥后測定其與脫氧膽酸鈉的結(jié)合率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3次,使用GraphPad prism軟件、SPSS 統(tǒng)計軟件進行繪圖和數(shù)據(jù)分析,Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面分析。*表示顯著差異,P<0.05;**表示非常顯著差異,P<0.01;***表示極顯著差異,P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆蛋白理化指標(biāo)測定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如表2所示。由標(biāo)準(zhǔn)曲線測得提取的綠豆粗蛋白的蛋白含量為78.27%,多糖含量為9.83%。

表2 蛋白和多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Table 2 Protein and polysaccharidestandard curve regression equation

此外,對綠豆粗蛋白中黃酮類和皂苷類物質(zhì)進行了檢測,檢測結(jié)果表明綠豆粗蛋白中沒有黃酮類和皂苷類物質(zhì)的存在?；谝陨辖Y(jié)果,猜測剩余11.90%的成分可能是灰分、脂肪、水分等物質(zhì)[24]。

2.2 水解酶的篩選

根據(jù)表3膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算可以得到綠豆蛋白水解產(chǎn)物結(jié)合膽酸鹽的能力,結(jié)果如表4所示。可以看出中性蛋白酶水解綠豆蛋白得到的水解物結(jié)合膽酸鈉、?；悄懰徕c的能力最強,與脫氧膽酸鈉的結(jié)合率僅次于堿性蛋白酶,且差異不顯著(P>0.05),說明使用中性蛋白酶得到的綠豆蛋白水解產(chǎn)物降血脂能力優(yōu)于其他四種蛋白酶。而這五種蛋白酶水解綠豆蛋白得到的水解產(chǎn)物與脫氧膽酸鈉的結(jié)合率又高于膽酸鈉和?；悄懰徕c,便于后續(xù)實驗的測定,綜合考慮后,選擇中性蛋白酶作為水解綠豆蛋白的最佳酶進行后續(xù)實驗,并將水解物與脫氧膽酸鈉結(jié)合能力作為考察指標(biāo)。

表3 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Table 3 Choline standard curve regression equation

表4 不同水解酶水解物的膽酸鹽結(jié)合率Table 4 Percentage of cholate binding ofdifferent hydrolase hydrolysates

2.3 單因素實驗結(jié)果

圖1結(jié)果表明,水解時間(min)、底物濃度(g/100 mL)、加酶量(U/g)、水解溫度(℃)對水解產(chǎn)物膽酸鹽結(jié)合率均具有一定影響。采用中性蛋白酶進行單因素實驗,在水解時間逐漸增大時(60～180 min),綠豆蛋白水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉的能力逐漸增大,之后隨著水解時間的延長又減小,這可能是由于水解時間過長水解物活性降低導(dǎo)致的;底物濃度為3 g/100 mL時水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力較好,增大底物濃度結(jié)合脫氧膽酸鈉能力反而降低,可能是因為底物濃度過高影響了底物與酶的接觸面積,從而降低了水解效果,阻礙了降血脂水解物的產(chǎn)生;當(dāng)加酶量為10000 U/g時,水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力較好,加酶量較低時,可能是酶結(jié)合底物的能力較弱,而過量的酶又使蛋白過度水解,從而導(dǎo)致水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力下降;溫度的升高使得水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力隨之增加,當(dāng)溫度升高到55 ℃后,水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力最好,之后隨著溫度的升高反而降低。其原因可能是45～55 ℃為中性蛋白酶的最適水解溫度,在此溫度范圍內(nèi)酶活力最高,此外,分子熱運動隨著溫度的升高而加快并且溶劑的溶解力也增大,更有利于溶劑滲透與溶質(zhì)擴散,從而使水解物活性更好。而溫度過高會導(dǎo)致酶活力降低甚至失活,影響蛋白水解。

圖1 各單因素對水解物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響Fig.1 Effect of single factor on the ability of hydrolysate combined with sodium deoxycholate注:不同的字母表示具有顯著性差異,P<0.05。

綜上所述,在單因素實驗的基礎(chǔ)上選取水解時間120、150、180 min,底物濃度2、3、4 g/100 mL,加酶量6000、10000、14000 U/g,水解溫度45、55、65 ℃進行響應(yīng)面試驗。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化水解工藝

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果見表5,每個實驗做3組平行,取其平均值。采用Design-Expert 8.0.6軟件對表5中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到水解時間(A)、底物濃度(B)、加酶量(C)、水解溫度(D)四個影響因素與響應(yīng)值膽酸鹽結(jié)合率(Y)之間的二次多項回歸擬合方程:

表5 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 5 Design and results of response surface experiment

Y=0.61-0.034A+0.020B+3.472E-003C-0.045D-0.030AB+0.029AC-0.038AD+0.028BC+0.037BD+0.022CD-0.091A2-0.061B2-0.064C2-0.063D2

上述方差分析表中的F值可以用來描述各個因素對水解產(chǎn)物結(jié)合膽酸鹽的影響大小。F值越大,則此因素的影響效果就越強[29]。所以由表6可知各個因素對得率的影響大小順序為:水解溫度(D)>水解時間(A)>底物濃度(B)>加酶量(C)。

2.4.3 響應(yīng)等高線圖與曲面圖分析 兩個因素之間交互作用明顯時等高線形狀趨向橢圓并且其軸線與坐標(biāo)軸之間形成一個明顯的角度[30]。兩個因素之間交互作用相對較弱時等高線趨向于圓形或者橢圓的軸線與坐標(biāo)軸之間形成的角度相對較小;響應(yīng)值對實驗條件的變化非常敏感時其對應(yīng)的響應(yīng)曲面坡度陡峭,等高線密集排列;響應(yīng)值對實驗條件的變化相對來說沒那么敏感時其對應(yīng)的響應(yīng)曲面坡度平緩,等高線疏松排列[31]。因此,由圖2可以分析看出,四個因素之間均存在顯著的交互作用。

圖2 各因素交互作用對水解產(chǎn)物結(jié)合脫氧膽酸鈉能力的影響Fig.2 Effect of interaction of various factors on the ability of hydrolysate combined with sodium deoxycholate

2.4.4 最佳水解工藝條件的確定與驗證 軟件分析得出綠豆蛋白水解產(chǎn)物最佳提取條件為:水解時間146 min,底物濃度3.1 g/100 mL,加酶量9861 U/g,水解溫度52.1 ℃。在此工藝條件下,軟件預(yù)測水解物與脫氧膽酸鈉結(jié)合率為61.86%。進行結(jié)果驗證,得到實際結(jié)果為60.46%,與理論值相接近,說明響應(yīng)面法具有可行性。

2.5 綠豆蛋白水解物純化

Sephacryl S-100 High Resolution凝膠層析柱對水解物的純化分離。將經(jīng)超濾管超濾后的截留液和透出液分別收集,測定其與脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力,結(jié)果表明截留液與脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力高于透出液。隨后,將截留液過層析柱進一步分離純化,得到洗脫峰,結(jié)果如圖3所示。每4 mL收集一管,水解物集中在第26～36管。將洗脫峰收集測定與脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力,其活性明顯提高,與脫氧膽酸鈉結(jié)合率為70.54%,說明此部分綠豆蛋白水解物是發(fā)揮降血脂活性的主要基礎(chǔ)物質(zhì)。純化后活性升高可能是由于純化后一些影響活性的雜質(zhì)被去除,說明Sephacryl S-100 High Resolution凝膠層析對水解物有一定的純化分離效果。

圖3 凝膠色譜圖Fig.3 Gel chromatography

3 結(jié)論與討論

本實驗以綠豆蛋白為原料,從多種蛋白酶中篩選出中性蛋白酶進行水解,以其對膽酸鹽的結(jié)合能力為指標(biāo),得到具有較好降血脂作用的綠豆蛋白水解物。使用中性蛋白酶水解綠豆蛋白得到的水解物降血脂作用更好,可能是因為其酶切位點更有利于降血脂水解物的生成。之后采用單因素實驗與響應(yīng)面試驗相結(jié)合的方法優(yōu)化水解工藝,結(jié)果表明最佳水解條件為:水解時間146 min,底物濃度為3.1 g/100 mL,加酶量為9861 U/g,水解溫度為52.1 ℃,在此條件下得到的水解產(chǎn)物與脫氧膽酸鈉結(jié)合率為60.46%,與模型預(yù)測值61.86%的相對誤差僅為2.26%,說明該模型可以較好地描述與預(yù)測水解綠豆蛋白的最佳工藝條件。

同時發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)條件下制備的綠豆蛋白水解物經(jīng)超濾后能得到降血脂活性較好的截留液,說明分子量大于5 kDa以上的水解物保留的降血脂活性較好,一方面可能是5 kDa以上的水解物有更大的分子結(jié)構(gòu),能夠吸附更多的膽酸鹽,另一方面,可能是因為5 kDa以上水解物的氨基酸排列順序能夠更好地起到降血脂的作用。使用Sephacryl S-100 High Resolution凝膠層析柱對截留液進一步分離純化,結(jié)果顯示純化后的水解物降血脂活性更強,可能是由于純化后的水解物分子量更集中,更利于與膽酸鹽的結(jié)合。

本實驗為綠豆蛋白水解物降血脂作用的研究提供了一定的理論參考,但關(guān)于綠豆蛋白降血脂水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)以及具體的作用機制有待進一步深入的研究。