短梗大參多酚的提取及體外抗氧化性研究

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010)

短梗大參(Macropanaxrosthornii),屬五加科(Araliaceae)、大參屬(Macropanax),又名七角風(fēng)、七葉蓮、節(jié)梗大參,是我國特有的一種小喬木或者常綠灌木,在四川、江西、湖北、貴州、廣西、廣東、湖南、甘肅、福建等地均有分布[1]。文獻(xiàn)記載該植物的根、皮具有驅(qū)風(fēng)除濕、化瘀生新的功效,臨床可用于治療骨折、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性損傷、嬰兒營養(yǎng)不良等疾病[2]。短梗大參的樹枝韌皮部含有豐富的膳食纖維和多酚,風(fēng)味清香,在西昌當(dāng)?shù)赜兄苯邮秤玫牧?xí)慣。

多酚是具有多個(gè)酚羥基化合物的次生代謝產(chǎn)物,廣泛分布于植物的根、皮、葉中,它具有多種生物活性功能,如抗氧化[3-4]、抑菌[5-6]、美容養(yǎng)顏[7]等。多酚常見的提取方法有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和超臨界流體萃取法[8-11]。與傳統(tǒng)的溶劑提取法相比,超聲波輔助提取能夠縮短反應(yīng)時(shí)間和減少溶劑使用量,增加植物中活性物質(zhì)的溶出量和提取效率;但超聲過程中產(chǎn)生的空化效應(yīng)能使多酚發(fā)生氧化,導(dǎo)致活性喪失。超臨界流體萃取法對(duì)設(shè)備的要求高、成本昂貴,在現(xiàn)階段不適合用于大規(guī)模的實(shí)際生產(chǎn)。

目前,國內(nèi)大部分的研究著眼于短梗大參的生理學(xué)、植物學(xué)方面的特性,關(guān)于短梗大參多酚的相關(guān)報(bào)道幾乎沒有。因此,本研究通過對(duì)短梗大參多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化和抗氧化性測定,以期為短梗大參保健食品的初步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

短梗大參 2019年3月采自四川省涼山州西昌市(樹皮的水分、灰分、纖維素含量分別為4.5%、10.6%和15.7%);沒食子酸 上海邁坤化工有限公司;福林-酚 合肥博美生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Phygene(飛凈)生物科技有限公司;水楊酸 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;抗壞血酸 天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)有限公司;無水乙醇、甲醇、無水碳酸鈉、30% H2O2等 均為國產(chǎn)分析純。

DHG-9620B恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩 浙江上虞華豐五金儀器有限公司;HSJ-4 A數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 金壇科析儀器有限公司;5840R高速冷凍離心機(jī) Eppendorf中國有限公司;UV 2400型紫外-可見分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 新鮮短梗大參樹皮→切碎→干燥(50 ℃恒溫烘干)→粉碎→過篩(60目)→篩下物→加入提取劑→恒溫水浴振蕩(150 r/min)→離心(5000 r/min、10 min)→定容至50 mL→總酚測定

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考康超等[12]的方法,采用福林酚法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱量0.0050 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,用60%乙醇溶液溶解、并定容至10 mL,得到濃度為0.5 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。用移液槍分別量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL離心管,加入1 mL Folin-Ceocalteu試劑,混勻靜置3 min后加入3 mL 10% Na2CO3溶液,并用蒸餾水補(bǔ)齊至5 mL,40 ℃水浴20 min后在760 nm處測定吸光值,同時(shí)做空白對(duì)照調(diào)零。以沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程y=9.185x+0.004(R2=0.9995)。

1.2.3 提取液中總酚含量測定 用移液器移取1.0 mL短梗大參提取液,按1.2.2的方法處理后測定吸光度值,并由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得提取液中的總多酚含量,結(jié)果以每1 g短梗大參中當(dāng)量沒食子酸的含量(mEq GA/g)來表示:

式(1)

式中:C為短梗大參多酚質(zhì)量濃度,mg/mL;V為提取液體積,mL;n為稀釋倍數(shù),m0為短梗大參質(zhì)量,g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取0.500 g短梗大參樹皮粉末于50 mL 燒杯中,按料液比1∶20 (g/mL)加入提取溶劑,在40 ℃恒溫水浴下振蕩60 min后于5000 r/min離心10 min,取上清液定容至50 mL。量取0.2 mL提取液,稀釋5倍后置于試管中,測定多酚的提取量,操作步驟同1.2.2。

1.2.4.1 提取溶劑對(duì)短梗大參總酚提取量的影響 固定料液比1∶20 (g/mL)、提取溫度40 ℃、提取時(shí)間60 min,設(shè)定提取溶劑為水、無水乙醇、60%甲醇、60%乙醇,研究提取溶劑對(duì)短梗大參總酚提取量的影響。

1.2.4.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)短梗大參總酚提取量的影響 固定料液比1∶20 (g/mL)、提取溫度40 ℃、提取時(shí)間60 min,設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%和80%,研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)短梗大參總酚提取量的影響。

1.2.4.3 料液比對(duì)短梗大參總酚提取量的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度40 ℃、提取時(shí)間60 min,設(shè)定料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 (g/mL),研究料液比對(duì)短梗大參總酚提取量的影響。

1.2.4.4 提取溫度對(duì)短梗大參總酚提取量的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30 (g/mL)、提取時(shí)間60 min,設(shè)定提取溫度為30、40、50、60、70 ℃,研究提取溫度對(duì)短梗大參總酚提取量的影響。

1.2.4.5 提取時(shí)間對(duì)短梗大參總酚提取量的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30 (g/mL)、提取溫度50 ℃,設(shè)定提取時(shí)間為40、50、60、70、80 min,研究提取時(shí)間對(duì)短梗大參總酚提取量的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間為試驗(yàn)因素,總酚提取量為響應(yīng)值,采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn),其因素水平表如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.6 抗氧化活性的測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測定 參考盛周煌等[13]的方法,具體如下:準(zhǔn)確稱取0.0060 g DPPH,用無水乙醇溶解并定容到200 mL,得到濃度為75 μmol/L的DPPH溶液,避光保存?zhèn)溆?。? mL不同濃度梯度的短梗大參多酚提取液于試管中,加入4 mL DPPH溶液,搖勻后在暗處避光放置反應(yīng)30 min,于波長517 nm處測吸光度值A(chǔ)1。用等量無水乙醇代替DPPH,和樣品液反應(yīng)測吸光度值A(chǔ)2,空白組以等量提取溶劑代替樣品液,和DPPH反應(yīng)后測得吸光度值A(chǔ)0,陽性對(duì)照用VC代替提取液。 DPPH自由基清除率的計(jì)算如式2所示:

式(2)

式中:A1為1 mL 樣品液+4 mL 75 μmol/L DPPH溶液的吸光度值;A2為1 mL 樣品液+4 mL無水乙醇吸光度值;A0為1 mL 提取溶劑+4 mL 75 μmol/L DPPH溶液吸光度值。

1.2.6.2 羥基自由基清除率的測定 羥基自由基清除能力是抗氧化劑還原力、供氫能力和活性氧清除能力的綜合體現(xiàn),其大小反映了抗氧化劑延緩氧化誘導(dǎo)期開始的能力[14]。羥基自由基清除率的測定參考Zhou等[15]的方法,并加以修改,向25 mL試管中依次加入1.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2.0 mL去離子水或不同濃度樣液、1.0 mL 6 mmol/L H2O2溶液,混勻并靜置10 min后加入0.60 mL 6 mmol/L水楊酸乙醇溶液,混勻、靜置10 min后于510 nm處測定吸光值A(chǔ)0、Ai,同時(shí)將H2O2用去離子水代替,測得吸光值A(chǔ)m,陽性對(duì)照用VC代替提取液。羥基自由基清除率計(jì)算如式3所示:

式(3)

式中:A0為1.0 mL 6 mmol/L FeSO4+1.0 mL 6 mmol/L H2O2溶液+0.6 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL去離子水的吸光度值;Ai為1.0 mL 6 mmol/L FeSO4+1.0 mL 6 mmol/L H2O2溶液+0.6 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL樣品液的吸光度值;Am為1.0 mL 6 mmol/L FeSO4+1.0 mL 去離子水+0.6 mL水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL樣品液的吸光度值。

1.2.6.3 半清除濃度(EC50)值的計(jì)算 利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行回歸分析,在軟件參數(shù)設(shè)置中,觀測值匯總選擇100%,模型選擇Logit,響應(yīng)頻率為清除率,協(xié)變量為濃度,選擇對(duì)數(shù)底為10的轉(zhuǎn)換,分析處理即可得到EC50值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)平行重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)的形式表示。數(shù)據(jù)顯著性(P<0.05)分析采用SPSS 21.0,圖形的繪制采用Origin軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取溶劑對(duì)總酚提取量的影響 從圖1可以看出,不同的提取溶劑對(duì)短梗大參多酚的提取效果有所不同,其中60%甲醇對(duì)短梗大參多酚的提取效果最好,60%乙醇和水次之,無水乙醇的提取效果最差,這與鄭翠萍等提取苦菜多酚的結(jié)果(提取效果:乙醇>甲醇>丙酮>水)相反,可能是原料的差異引起[16]。就本次試驗(yàn)而言,60%甲醇和60%乙醇對(duì)短梗大參多酚的提取量分別是0.272和0.265 mEq GA/g,差異不顯著(P>0.05),出于操作安全和成本的綜合考慮,選擇60%乙醇溶液作為短梗大參多酚的后續(xù)提取溶劑。

圖1 提取溶劑對(duì)總多酚提取量的影響Fig.1 The effect of different solventon extraction yield of total polyphenols

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總多酚提取量的影響 從圖2可以看出,多酚提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%時(shí),短梗大參多酚提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而升高,60%乙醇溶液提取時(shí)提取量最大;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于60%時(shí),多酚提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加逐漸下降,可能是醇溶性物質(zhì)、色素等在乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)溶解度較高,多酚和乙醇-水分子的結(jié)合被這些物質(zhì)抑制。同時(shí),植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也會(huì)因乙醇體積分?jǐn)?shù)過高發(fā)生失水現(xiàn)象,通透性變低,多酚的滲出受到影響,導(dǎo)致多酚提取量下降[17-18]。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總多酚提取量的影響Fig.2 The effect of volume fraction ofethanol on extraction yield of total polyphenols

2.1.3 料液比對(duì)總多酚提取量的影響 如圖3,料液比在1∶10～1∶30 (g/mL)區(qū)間時(shí),短梗大參多酚的提取量隨著提取溶劑用量的增加而升高,料液比為1∶30 (g/mL),短梗大參多酚的提取量最高,為0.318 mEq GA/g,原因可能是固液間的質(zhì)量濃度梯度是提取物發(fā)生轉(zhuǎn)移的動(dòng)力,溶劑用量的增加有利于提高質(zhì)量濃度梯度,提取物的溶出因此得到增加[18],但當(dāng)料液比達(dá)到某一極限時(shí),溶液和原料中的多酚達(dá)到平衡狀態(tài),多酚的滲出受到抑制。料液比過高會(huì)增加后續(xù)的濃縮以及純化成本,所以選擇1∶30 (g/mL)的料液比較為適宜。

圖3 料液比對(duì)總多酚提取量的影響Fig.3 The effect of ratioof material to liquidon extraction yield of total polyphenols

2.1.4 提取溫度對(duì)總多酚提取量的影響 如圖4所示,在一定溫度范圍內(nèi),總多酚提取量隨溫度增加而增加,原因可能是隨著溫度升高,顆粒充分溶脹,分子運(yùn)動(dòng)加劇,結(jié)合的多酚類化合物易于溶出;另外一方面,過高的溫度會(huì)破壞多酚的結(jié)構(gòu),或使多酚發(fā)生氧化[19-20]。因此選擇50 ℃作為之后因素的固定條件。

圖4 提取溫度對(duì)總多酚提取量的影響Fig.4 The effect of temperatureon extraction yield of total polyphenols

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)總多酚提取量的影響 從圖5可以看出,總多酚提取量隨提取時(shí)間的變化呈現(xiàn)先逐漸上升再平緩下降的趨勢。提取時(shí)間在40～70 min時(shí),多酚提取量隨著時(shí)間的增加而升高,提取時(shí)間越長,多酚提取量越高。在70 min時(shí)多酚提取量最高,為0.322 mEq GA/g;在60 min時(shí)多酚提取量為0.318 mEq GA/g,與70 min下的提取量無顯著性差異(P>0.05);在80 min時(shí),多酚提取量下降,可能是長時(shí)間的提取破壞了多酚結(jié)構(gòu)。因此選擇提取時(shí)間60 min作為較優(yōu)水平。

圖5 提取時(shí)間對(duì)總多酚提取量的影響Fig.5 The effect of time on extraction yield of total polyphenols

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 極差分析結(jié)果 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)L9(34)正交表進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)。通過EXCEL和SPSS軟件進(jìn)行分析,利用極差分析法和方差分析法確定最優(yōu)工藝條件,結(jié)果如表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

根據(jù)極差值R的大小,對(duì)因素進(jìn)行主次排序,R值越大,表明該因素對(duì)多酚提取量的影響越大。由表2比較本試驗(yàn)中4 個(gè)因素的R值,主次從大到小的排序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>料液比>提取時(shí)間>提取溫度。

2.2.2 方差分析結(jié)果 由表3可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間對(duì)短梗大參多酚提取量都具有顯著(P<0.05)的影響,實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的提取溫度無顯著(P>0.05)影響。綜合極差分析結(jié)果得出,短梗大參多酚提取的最優(yōu)條件為A1B3C1D1,即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶40 (g/mL)、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間50 min為理論上提取短梗大參多酚的最優(yōu)工藝條件,此組合未在正交表組合里,需做驗(yàn)證試驗(yàn),用于判斷理論最佳組合是否最優(yōu)。在上述最佳水平組合條件下,重復(fù)提取3次,多酚提取量為(0.320±0.02) mEq GA/g,說明最佳工藝條件具備可行性、且重現(xiàn)性好,為提取短梗大參多酚的最優(yōu)工藝條件。

表3 正交試驗(yàn)的方差分析Table 3 Analysis of variance for the orthogonal test

2.3 抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 短梗大參多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果 從圖6中可看出,短梗大參多酚對(duì)DPPH自由基的清除率隨著溶液的質(zhì)量濃度升高而增加,并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。在質(zhì)量濃度在12.5～87.5 μg/mL時(shí),短梗大參多酚對(duì)DPPH自由基的清除率略高于等量的VC溶液,繼續(xù)增加質(zhì)量濃度,多酚樣品與VC對(duì)DPPH自由基的清除率基本相當(dāng)。利用SPSS計(jì)算出短梗大參多酚和VC對(duì)DPPH自由基清除的EC50,分別是43.4和60.6 μg/mL,說明短梗大參多酚具有良好的DPPH自由基清除效果。

圖6 短梗大參多酚對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polyphenols extractedfrom Macropanax rosthornii on DPPH free radical

2.3.2 短梗大參多酚對(duì)羥基自由基清除效果 如圖7所示,短梗大參多酚和VC對(duì)羥基自由基的清除率都隨著質(zhì)量濃度升高而增加,在質(zhì)量濃度12.5～100 μg/mL的區(qū)間時(shí),多酚樣品液與VC的清除率并無顯著差異(P> 0.05),兩者的EC50值分別為37.6 和43.7 μg/mL。

圖7 短梗大參多酚對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polyphenols extractedfrom Macropanax rosthornii on hydroxy radical

3 結(jié)論

單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化得出短梗大參多酚的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶40 (g/mL)、提取時(shí)間50 min、提取溫度45 ℃,在該工藝條件下多酚提取量為(0.320±0.02) mEq GA/g。短梗大參多酚對(duì)DPPH和羥基自由基均具有良好的清除效果,其EC50值分別為43.4和37.6 μg/mL,與VC的EC50值60.6和43.7 μg/mL相比,短梗大參多酚活性略強(qiáng)于VC。此文仍采用傳統(tǒng)的浸提法,在保護(hù)多酚活性不受影響的前提下,尚需開發(fā)短梗大參多酚的高效提取方法。本實(shí)驗(yàn)得到的樣品為粗提物,尚需進(jìn)一步的分離純化以提高有效成分的活性,若作為工業(yè)用抗氧化劑,還需開展相關(guān)毒性實(shí)驗(yàn)。