荷葉離褶傘多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

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(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

食用菌味道鮮美,不僅是一種受歡迎的蔬菜,也是一種功能性食品,我國有食用菌350多種,具有廣闊的消費(fèi)市場。食用菌中含有多種氨基酸、微量元素以及多糖,早在明朝時期它們的營養(yǎng)以及藥用價(jià)值就受到了人們的關(guān)注[1]。食用菌的一些代謝產(chǎn)物具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗過敏的作用[2]。自1968年第一次報(bào)道食用菌子實(shí)體水提物中具有抗腫瘤的活性物質(zhì)后,科學(xué)家們開始對食用菌中的抗腫瘤物質(zhì)產(chǎn)生了興趣,后來研究發(fā)現(xiàn)該水提取物中大部分物質(zhì)為食用菌多糖[3]。食用菌多糖廣泛存在于食用菌細(xì)胞膜中,是食用菌中最豐富的生物聚合物,也是最主要的活性物質(zhì),具有多種生物學(xué)功能[4-5]。眾多報(bào)道表明食用菌多糖能有效預(yù)防腫瘤的發(fā)生,在降低血糖、血脂、抗血栓等方面同樣起著重要作用,且不產(chǎn)生毒副作用,被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”[6-7]。食品及醫(yī)學(xué)界研究人員發(fā)現(xiàn),自由基以及氧化劑會分解細(xì)胞,干擾人體正常的代謝途徑而威脅到人體健康,食用菌多糖具有較好的抗氧化活性,可以通過抗氧化作用減緩運(yùn)動性疲勞,有助于機(jī)體的快速恢復(fù)[8]。目前天然抗氧化劑的開發(fā)以及應(yīng)用受到了極大的關(guān)注,也是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[9],作為一種天然抗氧化劑,食用菌多糖在健康安全性方面遠(yuǎn)高于人工合成抗氧化劑。

荷葉離褶傘又稱鹿茸菇、泥窩、荷葉蘑,屬于傘菌目、口蘑科、離褶傘屬,是一種非常珍貴的藥食兩用的食用真菌,主要分布在我國中南部等地,研究者在荷葉離褶傘中分離得到11種多糖[10]。目前對荷葉離褶傘的研究大都集中在人工培育方面,對于其生物活性物質(zhì)的研究并不多見[11],僅甘肅河西學(xué)院團(tuán)隊(duì)對荷葉離褶傘多糖發(fā)酵以及抗腫瘤方面進(jìn)行了相關(guān)研究。本文采用水提醇沉法來提取荷葉離褶傘多糖,并且優(yōu)化該提取工藝,為制定科學(xué)、經(jīng)濟(jì)的荷葉離褶傘多糖制備工藝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時對提取出來的多糖進(jìn)行抗氧化活性研究,為將來研發(fā)有關(guān)荷葉離褶傘的保健以及藥用產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荷葉離褶傘 江蘇江南生物科技公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司;2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 上海麥克林生化科技有限公司;過硫酸鉀(K2S2O8) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醇(分析純)、十二水合磷酸氫鈉、二水合磷酸二氫鈉、抗壞血酸(VC)、葡萄糖、濃硫酸、苯酚 南京化學(xué)試劑股份有限公司。

TG16-WS臺式高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海江星儀器有限公司;DNM-9602G酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 荷葉離褶傘預(yù)處理 將荷葉離褶傘切成段后于55 ℃烘箱中干燥至恒重,用粉碎機(jī)粉碎成粉末過60目篩,按1∶20料液比加入85%乙醇(w/v),在70 ℃條件下封口水浴8 h,重復(fù)處理至溶液無顏色,將浸泡過的樣品粉末于50 ℃烘箱中烘干至恒重備用[12]。

1.2.2 多糖提取 取上述乙醇浸泡過后的荷葉離褶傘干粉,按一定的溫度、時間、液料比、提取次數(shù)進(jìn)行熱水浸提,浸提結(jié)束后6500 r/min離心10 min,收集并合并上清液。將上清液按體積比1∶3加入80%乙醇進(jìn)行醇沉,封口后4 ℃放置過夜,6500 r/min離心10 min得沉淀物。加入一定體積超純水使多糖復(fù)溶,進(jìn)一步去除其他雜質(zhì),上清液冷凍干燥得到荷葉離褶傘粗多糖。采用苯酚-硫酸法[13]對荷葉離褶傘多糖含量進(jìn)行測定,根據(jù)所測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖得率。

粗多糖得率計(jì)算公式如下:

式中,Y為荷葉離褶傘多糖得率,%;c為多糖濃度,g/mL;V為多糖溶液體積,mL;D為稀釋倍數(shù);m為荷葉離褶傘多糖干粉質(zhì)量,g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 提取溫度對多糖得率的影響 將液料比固定為30∶1 (mL/g)分別提取2次、每次提取時間為3 h,研究不同溫度(80、85、90、95、100 ℃)對多糖得率的影響。

1.2.3.2 提取時間對多糖得率的影響 將在液料比固定為30∶1 (mL/g)、分別提取2次、每次提取溫度90 ℃,研究不同提取時間(1、2、3、4、5 h)對多糖得率的影響。

1.2.3.3 提取液料比對多糖得率的影響 將提取溫度固定為90 ℃、分別提取2次、每次提取時間3 h,研究不同液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)對多糖得率的影響。

1.2.3.4 提取次數(shù)對多糖得率的影響 將液料比固定為30∶1 (mL/g)、每次提取時間3 h、提取溫度90 ℃,研究不同提取次數(shù)(1、2、3、4次)對多糖得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以多糖得率為響應(yīng)值,初步確定幾個提取因素的范圍。再選取提取溫度(X1)、時間(X2)、液料比(X3)這三個對荷葉離褶傘多糖得率影響較大的因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),其因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 荷葉離褶傘抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除活性測定 DPPH自由基清除活性參照文獻(xiàn)[14],使用比色法進(jìn)行測定,分別配制質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL多糖溶液,吸取50 μL不同質(zhì)量濃度多糖溶液于96孔板中,再依次加入25 μL 0.4 mmol/L DPPH無水乙醇溶液,100 μL超純水,振蕩96孔板使得整個體系均勻,30 ℃在暗處反應(yīng)30 min,于酶標(biāo)儀571 nm處測定吸光值。VC作為陽性對照組。自由基清除率按照下面公式計(jì)算:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A0為對照試驗(yàn)(水代替樣品)吸光值;A1為樣品試驗(yàn)吸光值;A2為樣品干擾試驗(yàn)(無水乙醇代替DPPH溶液)吸光值。

1.2.5.2 ABTS自由基清除活性測定 ABTS自由基清除率參照文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行修改測定。將7 mmol/L ABTS溶液與4.95 mmol/L K2S2O8溶液按1∶1 (v/v)混合配制成ABTS+工作液,放置在室溫暗處12 h后使用。ABTS+工作液用PBS(0.2 mol/L,pH7.4)稀釋至734 nm下的吸光值在0.70±0.02左右。分別配制質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL多糖溶液,吸取200 μL ABTS+工作液于96孔板中,再加入20 μL不同濃度多糖溶液,混合均勻后于室溫放置6 min,于酶標(biāo)儀測定734 nm處的吸光度。以VC作為陽性對照組。自由基清除率按照下面公式計(jì)算:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A0為對照試驗(yàn)(水代替樣品)吸光值;A1為樣品試驗(yàn)吸光值;A2樣品干擾試驗(yàn)(PBS代替ABTS+工作液)吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均重復(fù)3次。用SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素及組間差異統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以MEAN±SD表示,根據(jù)Design-Expert 10進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對荷葉離褶傘多糖得率的影響 由圖1可知,在溫度80～90 ℃之間,隨著溫度升高荷葉離褶傘多糖得率顯著增加(P<0.05),溫度在90 ℃時多糖得率最大,為5.32%,溫度增加到95～100 ℃之間,多糖得率下降,與90 ℃相比有顯著差異(P<0.05)。分析原因可能是80～90 ℃之間隨著溫度升高,分子之間運(yùn)動加快,碰撞的幾率增大,導(dǎo)致溶質(zhì)溶出的速率增大以至于多糖得率增加[16]。95～100 ℃之間由于溫度過高,多糖糖苷鍵遭到破壞,導(dǎo)致得率下降[17]。多糖得率隨著溫度上升先增大后減小的結(jié)論與崔鳳杰等[18]灰樹花多糖提取溫度優(yōu)化結(jié)果一致,同時溫度過高還會使多糖部分功能活性喪失。因此選取90 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖1 提取溫度對荷葉離褶傘多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the extractionyield of Lyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides注:字母不同表示組間差異顯著(P<0.05);圖2～圖4、圖6～圖7同。

2.1.2 提取時間對荷葉離褶傘多糖得率的影響 由圖2可知,提取時間1～2 h內(nèi),多糖得率無顯著差異(P>0.05),可能是由于提取時間較短多糖沒有充分溶出[19]。與提取時間2 h相比,3 h多糖得率顯著升高(P<0.05),達(dá)到最大值為5.29%,之后隨著提取時間增加(3～4 h),多糖得率顯著下降(P<0.05),在4～5 h趨于平穩(wěn)。由于在荷葉離褶傘多糖不斷溶出的同時,長時間的高溫環(huán)境容易導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞,因而長時間提取會使多糖得率顯著下降(P<0.05)[20]。在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)中,選擇提取時間為3 h作為中心點(diǎn)。

圖2 提取時間對荷葉離褶傘多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction yield ofLyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides

2.1.3 提取液料比對荷葉離褶傘多糖得率的影響 由圖3可知,當(dāng)提取液料比在10∶1～30∶1 (mL/g)之間,隨著液料比增大多糖得率顯著增加(P<0.05),在液料比為30∶1 (mL/g)時多糖得率最大,為5.30%,之后增加液料比多糖得率無顯著差異(P>0.05)。增加溶劑量有助于多糖溶出,但是考慮到經(jīng)濟(jì)成本以及試驗(yàn)工作量,選取30∶1 (mL/g)液料比作為最后優(yōu)化試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖3 提取液料比對荷葉離褶傘多糖得率的影響Fig.3 Effect of ratio of water to material on the extractionyield of Lyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides

2.1.4 提取次數(shù)對荷葉離褶傘多糖得率的影響 由圖4可知,與提取次數(shù)為1次相比,提取2次后多糖得率顯著增加(P<0.05),隨后增加提取次數(shù)多糖得率有所上升但是差異不顯著(P>0.05),說明經(jīng)過2次提取多糖已經(jīng)充分溶于水中。因此將提取次數(shù)設(shè)定為2次作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的參數(shù)。

圖4 提取次數(shù)對荷葉離褶傘多糖提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the extraction yield ofLyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響因面試驗(yàn)結(jié)果與分析 以提取溫度(X1)、提取時間(X2)、液料比(X3)作為自變量,荷葉離褶傘多糖得率(Y)為因變量,試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見表2,由結(jié)果分析得出響應(yīng)變量和響應(yīng)值之間的多元二次回歸方程如下:

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

Y=-213.79500+4.59050X1+6.76375X2+0.27113X3+4.468×10-15X1X2+5×10-4X1X3-0.02520X2X3-0.025850X1X1-0.96875X2X2-0.00378750X3X3

表3 多元回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for the quadratic polynomial model

2.2.2 響應(yīng)面圖與等高線圖結(jié)果分析 等高線圖呈現(xiàn)圓形代表兩因素的交互作用對多糖得率沒有顯著性影響,呈現(xiàn)橢圓形則代表有顯著影響,響應(yīng)曲面坡度越陡峭,說明相應(yīng)的兩因素的交互作用對多糖得率影響就越大[22]。從圖5的等高線圖可以看出,提取時間與液料比兩兩交互對多糖的得率有顯著影響。從響應(yīng)曲面圖看出,圖5B、圖5C比圖5A的曲面要陡峭一點(diǎn),說明X1提取溫度和X3提取液料比交互作用、X2提取時間和X3液料比交互作用對多糖得率影響較大,與表3的結(jié)果相對應(yīng)。

圖5 提取溫度、提取時間、液料比交互作用對荷葉離褶傘多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots of the mutual effects of extraction temperature,extraction time and ratio ofwater to material on the extraction yield of Lyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides注:A:提取溫度與提取時間,B:提取溫度與提取液料比,C:提取時間與提取液料比。

根據(jù) Design-Expert 10對試驗(yàn)結(jié)果分析得出對應(yīng)的最佳工藝為:提取溫度89.10 ℃、提取時間3.08 h、液料比31.41∶1 (mL/g),預(yù)測的最高得率為5.38%?？紤]到實(shí)際操作過程方面,最后將條件設(shè)定為:提取溫度89 ℃、提取3 h、液料比30∶1 (mL/g),在此提取條件下進(jìn)行三次重復(fù)驗(yàn)證,得出荷葉離褶傘的最后的率為5.35%±0.12%,該得率與預(yù)測得率相差不大,說明該模型可用。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 荷葉離褶傘多糖DPPH自由基清除能力測定 由圖6可知,在質(zhì)量濃度范圍內(nèi),荷葉離褶傘多糖DPPH自由基清除率隨濃度增大而增加,呈劑量依賴關(guān)系[23],在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時,DPPH清除率達(dá)到最大值,為45.87%±2.12%。由結(jié)果可知,荷葉離褶傘多糖對DPPH自由基的半抑制濃度IC50大于1.0 mg/mL,根據(jù)軟件計(jì)算其IC50為1.40 mg/mL,說明荷葉離褶傘多糖對DPPH自由基有一定清除能力,冮潔等[24]等研究的羊肚菌菌絲體鋅多糖抗氧化性試驗(yàn)中,也表明DPPH自由基清除能力與多糖質(zhì)量濃度有關(guān)。因荷葉離褶傘多糖為酸性多糖且含有硫酸基,所以表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。在Chen等[25]研究的苦瓜多糖結(jié)果也表明,苦瓜多糖中硫酸基可以提高抗氧化能力。圖中對照組VC濃度在1.0 mg/mL時,清除率達(dá)到最大為100%,在試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),樣品組的DPPH自由基清除能力小于VC。

圖6 荷葉離褶傘多糖對DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging capacity ofLyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides

2.3.2 荷葉離褶傘多糖ABTS自由基清除能力測定 由圖7可知,在質(zhì)量濃度為0～1.0 mg/mL范圍內(nèi),荷葉離褶傘多糖ABTS自由基清除率隨濃度增大而增加,同時量-效關(guān)系明顯,在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時,ABTS自由基清除率達(dá)到最大值為76.49%±1.56%。由結(jié)果可知,荷葉離褶傘多糖對ABTS自由基的半抑制濃度IC50為0.44 mg/mL。與其他食用菌相比荷葉離褶傘多糖對ABTS自由基清除能力遠(yuǎn)高于真姬菇多糖[26]、香菇多糖[27]。VC對照組濃度在1.0 mg/mL時,清除率達(dá)到最大值,為100%。不同質(zhì)量濃度多糖對ABTS自由基清除能力差異明顯,但均小于VC對照組,這與Solomon等[28]研究的黃羽扇豆多糖對ABTS自由基清除能力的結(jié)論一致。與圖6相比,多糖在相同質(zhì)量濃度下對ABTS自由基清除率要大于DPPH。原因是ABTS自由基適合評價(jià)親水性抗氧化劑,而DPPH自由基適合評價(jià)親脂性抗氧化劑[29]。

圖7 荷葉離褶傘多糖對ABTS自由基清除能力Fig.7 ABTS radical scavenging capacity ofLyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到荷葉離褶傘提取溫度在89 ℃,提取時間為3 h,液料比為30∶1 (mL/g)時,多糖得率最大為5.35%±0.12%?？寡趸钚匝芯堪l(fā)現(xiàn)荷葉離褶傘多糖的抗氧化性隨多糖濃度增加而增大,對DPPH、ABTS自由基的半抑制濃度IC50分別為1.40、0.44 mg/mL。具有較好的抗氧化能力,為天然抗氧化劑的開發(fā)提供了新的路徑。荷葉離褶傘多糖作為一種應(yīng)用前景廣泛的生物活性物質(zhì),可以應(yīng)用于更多領(lǐng)域。