植酸酶YiAPPA在糞腸球菌中的高效組成型表達(dá)研究

(江西省科學(xué)院微生物研究所,江西南昌 330096)

植酸是單胃動(dòng)物日糧中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子,對(duì)蛋白質(zhì)、脂類、礦物質(zhì)離子等營(yíng)養(yǎng)素均具有極強(qiáng)的吸附和螯合能力[1]。另外,單胃動(dòng)物由于缺少分解植酸的酶,導(dǎo)致一些營(yíng)養(yǎng)素的消化和吸收率降低,大量營(yíng)養(yǎng)素被排泄到體外,造成對(duì)環(huán)境的污染[1]。植酸酶是能夠?qū)⒅菜岱纸鉃榧〈己蜔o(wú)機(jī)磷的一類磷酸酯酶,是單胃動(dòng)物日糧中最常見的飼料添加劑,其在飼用酶制劑生產(chǎn)和銷售市場(chǎng)中占有很大的份額[2-8]。植酸酶作為飼料添加劑能夠減輕植酸磷對(duì)環(huán)境的污染和解除飼料中植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用。在實(shí)際生產(chǎn)中,通過(guò)添加外源性植酸酶可在一定程度上消除抗?fàn)I養(yǎng)因子植酸的不良影響,但也增加了飼料成本,并且只能取得短期效應(yīng),同時(shí)在飼料制粒過(guò)程中,額外添加的植酸酶易因高溫而失活[9]。因此,如何在實(shí)際生產(chǎn)中高效利用植酸酶具有重要意義。其中利用基因工程技術(shù)將植酸酶在乳酸菌宿主中進(jìn)行表達(dá)將是一種可行的和廉價(jià)的策略。

來(lái)源于Yersiniaintermedia的植酸酶YiAPPA是目前已知的植酸酶活性最高的植酸酶,其于37 ℃、pH4.5條件下的酶活高達(dá)3960 U/mg[10],是目前應(yīng)用最廣泛的植酸酶AspergillusnigerPhyA酶活的40倍[11]。YiAPPA的最適反應(yīng)pH為4.5,于pH2.0～5.5條件下具有50%以上的相對(duì)酶活,于pH1.0～8.0條件下具有80%以上的穩(wěn)定性,并且對(duì)于胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有較強(qiáng)的抗性[10]。YiAPPA的酶學(xué)性質(zhì)使其在飼料工業(yè)中具有巨大的應(yīng)用潛力,但是其酶學(xué)性質(zhì)(特別是熱穩(wěn)定性)難以完全滿足飼料工業(yè)的要求。以YiAPPA的熱穩(wěn)定性為例,飼用酶制劑在飼料制粒過(guò)程中需要經(jīng)過(guò)一個(gè)75～93 ℃的短暫高溫,而YiAPPA于80 ℃的半衰期僅為15 min[10],難以滿足飼料工業(yè)的要求。

乳酸菌是以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的各類細(xì)菌統(tǒng)稱,是人與大多數(shù)動(dòng)物腸道內(nèi)常見優(yōu)勢(shì)菌群,被公認(rèn)為安全級(jí)微生物[12]。乳酸菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)不但可以保持腸道菌群微生態(tài)平衡,還可以提供很多益生作用。乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)越來(lái)越受到重視,其優(yōu)點(diǎn)在于乳酸菌安全,無(wú)內(nèi)毒素,可以在腸道中存活定殖,其表達(dá)的外源蛋白質(zhì)可以源源不斷在腸道中生產(chǎn)并起到相應(yīng)的作用[13-16]。但是乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)存在表達(dá)量低的缺點(diǎn)[17],通過(guò)改造控制基因表達(dá)的順式作用元件是提高蛋白質(zhì)表達(dá)量的常用手段,而其中最常用的就是找到一種高效的啟動(dòng)子。乳酸菌屬的啟動(dòng)子對(duì)宿主有著高度的選擇性和特異性[18]。因此在乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)中很少使用外源啟動(dòng)子甚至是不同種屬的啟動(dòng)子。這就需要對(duì)乳酸菌內(nèi)源性的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆和篩選,從而找到所需的啟動(dòng)子。目前用于構(gòu)建乳酸菌表達(dá)載體的啟動(dòng)子包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子,對(duì)應(yīng)的表達(dá)載體分為誘導(dǎo)型表達(dá)載體和組成型表達(dá)載體[19-20]。誘導(dǎo)型表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于在添加誘導(dǎo)物的條件下可以相對(duì)提高外源蛋白質(zhì)的表達(dá)量;其缺點(diǎn)在于在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中,誘導(dǎo)物的添加使得工藝變得繁瑣,生產(chǎn)成本變高,并且誘導(dǎo)物的添加是否會(huì)對(duì)人和動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生非安全方面的影響還有待研究。組成型乳酸菌表達(dá)載體則可以在不添加誘導(dǎo)物的情況下不斷地表達(dá)目的蛋白,在飼料生產(chǎn)、食品發(fā)酵等工業(yè)生產(chǎn)中簡(jiǎn)化操作步驟,同時(shí)降低成本,便于大規(guī)模生產(chǎn)[21]。乳酸菌組成型啟動(dòng)子在功能上的優(yōu)勢(shì)使其在科研和工業(yè)生產(chǎn)中顯得越發(fā)重要,因此克隆和篩選高效的乳酸菌組成型啟動(dòng)子具有重要意義。

本研究以本實(shí)驗(yàn)室前期從健康仔豬腸道黏膜上分離純化得到的具有優(yōu)良益生特性的糞腸球菌EXW27為宿主菌,結(jié)合人工啟動(dòng)子文庫(kù)技術(shù)和高通量篩選技術(shù),獲得控制YiAPPA高效組成型表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子,從而構(gòu)建既具有益生特性又具有植酸酶活性的轉(zhuǎn)基因糞腸球菌。本研究一方面可為植酸酶YiAPPA的應(yīng)用提供新策略,另一方面也為研制新型轉(zhuǎn)基因微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌EscherichiacoliJM109、糞腸球菌EntercoccusfaecalisEXW27、大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒pSIP409、重組質(zhì)粒pSTOP1622-yiappah 均由本實(shí)驗(yàn)室保存;KOD-Plus-neo DNA聚合酶 日本Toyobo公司;DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker 美國(guó)Fermentase公司;DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A. 美國(guó)Omega Bio-tek公司;B-PERTMBacterial Protein Extraction Reagent 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司;Chelating SepharoseTMFast Flow 美國(guó)GE Healthcare公司;Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PCR引物 上海生工生物工程股份有限公司;乳酸桿菌素sakacin P 百靈威科技有限公司;實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Mastercycler gradient型PCR儀 美國(guó)Eppendorf公司;TY04S-3C型凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;SCIENTZ-ⅡD型超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;SP-752PC型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;iMark 酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的構(gòu)建與鑒定 基于yiappa的堿基序列,設(shè)計(jì)引物P1和P2(表1),以重組質(zhì)粒pSTOP1622-yiappah為模板,擴(kuò)增基因yiappa中不含信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)基因yiappads。PCR擴(kuò)增體系為:10×buffer I 5 μL;dNTP 5 μL;MgSO45 μL;引物各2 μL;模板1 μL;KOD-Plus-neo DNA聚合酶2 μL;ddH2O 28 μL。PCR擴(kuò)增條件為:98 ℃ 5 min;98 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s,74 ℃ 2 min,30個(gè)循環(huán);74 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切,連接至經(jīng)同樣雙酶切處理的載體pSIP409,構(gòu)建重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliJM109感受態(tài)細(xì)胞,將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物全部涂布于含200 μg/mL紅霉素的LB固體平板上,于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取LB固體平板上轉(zhuǎn)化子,提取其中所含重組質(zhì)粒。采用Nco I和Xho I雙酶切重組質(zhì)粒鑒定是否有外源基因的插入。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物序列Table 1 Primer sequences for the construction of recombinant plasmids

引物P3中N為25%的A、G、C或T;S為50%的G或C;W為50%的A或T;R為50%的A或G。1.2.2 YiAPPA在糞腸球菌中組成型表達(dá)的人工啟動(dòng)子文庫(kù)的構(gòu)建 在NCBI中找出糞腸球菌中16S rRNA的啟動(dòng)子序列,采用DNAMAN軟件對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì),確定啟動(dòng)子序列中核心序列和非核心序列。將啟動(dòng)子序列中核心序列保持不變,將非核心序列設(shè)計(jì)為隨機(jī)化序列或半保守序列,并結(jié)合穿梭質(zhì)粒pSIP409的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),設(shè)計(jì)構(gòu)建人工啟動(dòng)子文庫(kù)所需的上游PCR引物P3(如表1和圖2所示)。再基于yiappa的堿基序列,設(shè)計(jì)構(gòu)建人工啟動(dòng)子文庫(kù)所需的下游PCR引物P4(如表1和圖2所示)。以重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads為模板,以P3和P4為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為:98 ℃ 5 min;98 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s,74 ℃ 20 s,30個(gè)循環(huán);74 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Bgl II和Nco I雙酶切,連接至經(jīng)同樣雙酶切處理的載體pSIP409-yiappads。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliJM109感受態(tài)細(xì)胞,將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物全部涂布于含200 μg/mL紅霉素的LB固體平板上,于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取LB固體平板上所有轉(zhuǎn)化子,提取其中所含重組質(zhì)粒并電擊轉(zhuǎn)化糞腸球菌EntercoccusfaecalisEXW27,將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物全部涂布于含10 μg/mL紅霉素的MRS固體平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h,獲得人工啟動(dòng)子文庫(kù)。糞腸球菌EntercoccusfaecalisEXW27的電擊轉(zhuǎn)化方法參照參考文獻(xiàn)[22]進(jìn)行。

1.2.3 YiAPPA在糞腸球菌中組成型表達(dá)的人工啟動(dòng)子文庫(kù)的高通量培養(yǎng)和篩選

1.2.3.1 人工啟動(dòng)子文庫(kù)的高通量培養(yǎng) 取滅菌、烘干的96孔深孔板,每孔加入含10 μg/mL紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基500 μL。用10 μL移液槍扎取槍頭后挑取單菌落,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)孔中,依次反復(fù)直至挑選結(jié)束。蓋上蓋子,于搖床中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。用8通道移液器按照順序?qū)⒒罨蟮姆N子液轉(zhuǎn)接至48孔深孔板中,接種量為3%。蓋上蓋子,于37 ℃靜置培養(yǎng)至OD600 nm為1.8(培養(yǎng)時(shí)間約為36 h)。其中,陰性對(duì)照為未經(jīng)誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌;陽(yáng)性對(duì)照為經(jīng)乳酸桿菌素sakacin P誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌(誘導(dǎo)條件為:當(dāng)重組糞腸球菌生長(zhǎng)至OD600 nm為0.3時(shí),加入50 ng/mL sakacin P進(jìn)行誘導(dǎo),待重組糞腸桿菌生長(zhǎng)至OD600 nm為1.8,培養(yǎng)結(jié)束)[22]。

1.2.3.2 人工啟動(dòng)子文庫(kù)的初步篩選 將發(fā)酵后的48 孔深孔板于4 ℃下4000 r/min離心10 min,收集細(xì)胞沉淀,加入25 μL 0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.5),重懸菌體。按照順序?qū)⒕鷳乙恨D(zhuǎn)移至96孔深孔板,加入等體積的細(xì)菌蛋白抽提試劑(B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent),室溫放置30 min后,再加入150 μL 0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.5),混勻,用于植酸酶活性的高通量檢測(cè)。向?qū)嶒?yàn)組中加入400 μL 1.5 mmol/L植酸鈉溶液(0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液,pH4.5),對(duì)照組中加入400 μL顏色/終點(diǎn)混合液(鉬酸銨/釩酸銨/硝酸),混勻。于37 ℃反應(yīng)30 min后,立即向?qū)嶒?yàn)組中加入400 μL顏色/終點(diǎn)混合液,對(duì)照組中加入400 μL 1.5 mmol/L植酸鈉溶液,并混勻。取潔凈的酶標(biāo)板加入100 μL無(wú)菌水和100 μL反應(yīng)液并混勻,用酶標(biāo)儀測(cè)定415 nm下的吸光值。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的吸光值的差值大小反應(yīng)重組糞腸桿菌中植酸酶表達(dá)量的多少。

1.2.3.3 人工啟動(dòng)子文庫(kù)的復(fù)篩 從人工啟動(dòng)子文庫(kù)中選取酶活較高的10個(gè)克隆子,對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩,并以未經(jīng)誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌為陰性對(duì)照,以經(jīng)乳酸桿菌素sakacin P誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌為陽(yáng)性對(duì)照。這12個(gè)克隆子的培養(yǎng)和篩選分別參照“1.2.3.1”和“1.2.3.2”。

1.2.4 YiAPPA在糞腸球菌中組成型表達(dá)的組成型啟動(dòng)子的鑒定 選取人工啟動(dòng)子文庫(kù)中植酸酶活性較高的克隆子,設(shè)計(jì)引物P4和P5(表1)進(jìn)行菌落PCR,其中PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參照“1.2.2”。并將獲得的DNA片段送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,確定每個(gè)克隆子所對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子序列。

1.2.5 YiAPPA在糞腸球菌中的組成型表達(dá)和純化 接種重組糞腸桿菌單克隆到含10 μg/mL紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中,用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng),其中培養(yǎng)基的裝液量為100 mL,于37 ℃靜置培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間為24 h。然后轉(zhuǎn)接該培養(yǎng)物于新鮮含10 μg/mL紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中,用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng),其中培養(yǎng)基的裝液量為100 mL,接種量為3%,于37 ℃靜置培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間為36 h。

待培養(yǎng)結(jié)束后,于4 ℃下8000 r/min離心5 min收集菌體沉淀,采用0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.5)重懸并洗滌菌體沉淀,再加入適量0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.5)重懸菌體沉淀,置于冰上用超聲波破碎細(xì)胞。超聲波細(xì)胞破碎儀的參數(shù)設(shè)置如下:超聲波功率為250 W,超聲波破碎時(shí)間為3 s,間歇6 s。超聲波處理菌體細(xì)胞至菌體懸液變?yōu)榫坏娜芤?采用SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。掃描已脫色的凝膠,采用軟件Image J 1.38×對(duì)凝膠上目標(biāo)蛋白條帶進(jìn)行灰度積分,以此估算目標(biāo)蛋白質(zhì)占細(xì)胞總蛋白中的比例。

采用Ni2+親和層析柱對(duì)細(xì)胞可溶成分中目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化,用250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫,即得到純化后的重組酶。利用SDS-PAGE檢測(cè)重組酶的純度,并采用Bradford法[23]測(cè)定重組酶的濃度。

圖1 糞腸球菌16S rRNA啟動(dòng)子序列比對(duì)Fig.1 Alignment of 16S rRNA promoters from Entercoccus faecalis圖2 人工啟動(dòng)子文庫(kù)構(gòu)建示意圖Fig.2 Construction of the synthetic promoter library

1.2.6 分子克隆技術(shù)和表達(dá)產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析 分子克隆技術(shù)和表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析參照文獻(xiàn)[24]進(jìn)行。

1.2.7 YiAPPA的酶學(xué)性質(zhì)分析 YiAPPA的酶學(xué)性質(zhì)分析參考文獻(xiàn)[25]。

1.2.7.1 植酸酶的最適反應(yīng)pH測(cè)定 將酶液于不同pH(1.0～8.0)條件下測(cè)定植酸酶活性,將所測(cè)得的最高酶活力定義為100%,然后以相對(duì)酶活對(duì)pH作圖。所使用的緩沖液如下:0.25 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液,pH1.0～3.5;0.25 mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液,pH3.5～6.0;0.25 mol/L Tris-鹽酸緩沖液,pH6.0～8.5。

1.2.7.2 植酸酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定 將酶液用不同pH(1.0～12.0)緩沖液稀釋,使其在不同pH條件下于37 ℃處理2 h,然后用最適pH緩沖液稀釋,并根據(jù)如上反應(yīng)體系測(cè)定樣品的酶活力,將所測(cè)得的最高酶活力定義為100%,然后以相對(duì)酶活對(duì)pH作圖。所使用的緩沖液如下:0.25 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液,pH1.0～3.5;0.25 mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液,pH3.5～6.0;0.25 mol/L Tris-鹽酸緩沖液,pH6.0～8.5;0.25 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液,pH8.5～12.0。

1.2.7.3 植酸酶的最適反應(yīng)溫度測(cè)定 按照如上反應(yīng)體系,分別于30～90 ℃反應(yīng)30 min,測(cè)定不同溫度條件下樣品的酶活力,并以酶活力對(duì)溫度作圖,確定其最適反應(yīng)溫度。

1.2.7.4 植酸酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定 取250 μL酶液于離心管中,加入750 μL 0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.5),混勻。酶液于80 ℃保溫0～40 min后,根據(jù)如上反應(yīng)體系測(cè)定樣品的酶比活力,將所測(cè)得的最高酶比活力定義為100%,并以相對(duì)酶活對(duì)時(shí)間作圖。

1.2.7.5 植酸酶的酶活力測(cè)定 取250 μL酶液于離心管中,加入750 μL 0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.5),混勻。向?qū)嶒?yàn)組管中加入2 mL 1.5 mmol/L 植酸鈉溶液(0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液,pH4.5),對(duì)照組中加入2 mL顏色/終點(diǎn)混合液(鉬酸銨/釩酸銨/硝酸),搖勻。于37 ℃反應(yīng)30 min后,立即向?qū)嶒?yàn)組中加入2 mL顏色/終點(diǎn)混合液,對(duì)照組中加入2 mL 1.5 mmol/L植酸鈉溶液,并混勻,于415 nm處測(cè)定光吸收值。植酸酶活力單位(U)定義為:在37 ℃、pH4.5的條件下,每分鐘從1.5 mmol/L植酸鈉溶液中釋放出1 μmol/L無(wú)機(jī)磷所需要的植酸酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 人工啟動(dòng)子文庫(kù)的構(gòu)建

本研究首先從NCBI查詢得到糞腸球菌中16S rRNA的啟動(dòng)子序列,包括Ef16SA-1、Ef16SA-2、Ef16SB-1、Ef16SB-2、Ef16SC-1、Ef16SC-2、Ef16SD-1和Ef16SD-2。并采用DNAMAN軟件對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì)分析,找出其中保守序列和非保守序列,結(jié)果如圖1所示。將啟動(dòng)子序列中保守序列保持不變,將非保守序列設(shè)計(jì)為隨機(jī)化序列,設(shè)計(jì)人工啟動(dòng)子文庫(kù)構(gòu)建引物P3。以誘導(dǎo)型大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達(dá)載體pSIP409為基礎(chǔ)框架,利用pSIP409中酶切位點(diǎn)構(gòu)建植酸酶YiAPPA在糞腸球菌EXW27中組成型表達(dá)的人工啟動(dòng)子文庫(kù)。

2.2 人工啟動(dòng)子文庫(kù)的篩選與鑒定

本研究構(gòu)建植酸酶YiAPPA在糞腸球菌EXW27中組成型表達(dá)的人工啟動(dòng)子文庫(kù),共獲得318個(gè)克隆子,對(duì)這318個(gè)克隆子進(jìn)行胞內(nèi)植酸酶活性檢測(cè),實(shí)現(xiàn)人工啟動(dòng)子文庫(kù)的初步篩選。從以上318個(gè)克隆子選取其中酶活較高的10個(gè)克隆子,對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩,并以未經(jīng)誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌為陰性對(duì)照,以經(jīng)乳酸桿菌素sakacin P誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌為陽(yáng)性對(duì)照。這12個(gè)克隆子的胞內(nèi)植酸酶活性檢測(cè)結(jié)果如圖3所示,此外以上克隆子的胞內(nèi)可溶性成分的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。由圖3和圖4可知,本研究所獲得的組成型人工啟動(dòng)子均能有效控制植酸酶YiAPPA在糞腸球菌EXW27中表達(dá)。其中,10號(hào)克隆子具有最高的植酸酶活性,其胞內(nèi)可溶性成分以植酸鈉為底物時(shí)所測(cè)得的415 nm下的吸光值最高。并且10號(hào)克隆子的胞內(nèi)植酸酶表達(dá)量最高,10號(hào)克隆子中重組YiAPPA的表達(dá)量約占細(xì)胞內(nèi)蛋白總量的15%,約為經(jīng)乳酸桿菌素sakacin P誘導(dǎo)的重組YiAPPA表達(dá)量的94%。

圖3 人工啟動(dòng)子文庫(kù)的植酸酶活性分析Fig.3 Phytase activity analysis of synthetic promoter library注:ck:未經(jīng)誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌;pc:經(jīng)乳酸桿菌素sakacin P誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌;1～10分別表示1～10號(hào)克隆子。

圖4 重組植酸酶YiAPPA在糞腸球菌EXW27中表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of expression ofrecombinant phytase YiAPPA in Entercoccus faecalis EXW27注:M:蛋白質(zhì)Marker;ck:未經(jīng)誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌的胞內(nèi)可溶成分;pc:經(jīng)乳酸桿菌素sakacin P誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌的胞內(nèi)可溶成分;1～10分別表示1～10號(hào)克隆子的胞內(nèi)可溶成分;圖中箭頭標(biāo)示為目的蛋白。

采用引物P4和P5對(duì)以上10個(gè)克隆子進(jìn)行菌落PCR,并將獲得的DNA片段送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,確定每個(gè)克隆子所對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子序列,結(jié)果如圖5所示。在篩選得到的10個(gè)啟動(dòng)子中,除了啟動(dòng)子p2對(duì)應(yīng)為Ef16SA-1,啟動(dòng)子p5對(duì)應(yīng)為Ef16SD-2,啟動(dòng)子p9對(duì)應(yīng)為Ef16SC-1外,其他7個(gè)啟動(dòng)子均為人工啟動(dòng)子。根據(jù)以上結(jié)果,啟動(dòng)子p10控制YiAPPA在糞腸球菌EXW27中組成型表達(dá)的效率最高,選定啟動(dòng)子p10為控制YiAPPA在糞腸球菌EXW27中組成型表達(dá)的啟動(dòng)子。

圖5 人工啟動(dòng)子的序列比對(duì)Fig.5 Alignment of synthetic promoters

2.3 重組YiAPPA在糞腸球菌中的表達(dá)與純化

待發(fā)酵結(jié)束后,采用超聲波處理菌體細(xì)胞,并采用Ni2+親和層析柱對(duì)細(xì)胞可溶成分中目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化,用200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫,即得到純化后的重組植酸酶YiAPPA。

重組植酸酶YiAPPA在糞腸球菌EXW27中的組成型表達(dá)及純化的SDS-PAGE檢測(cè)分析結(jié)果如圖6所示。重組YiAPPA的分子量約為45 kDa,與理論值基本一致。

圖6 重組YiAPPA在糞腸球菌EXW27中表達(dá)及純化的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of expression and purification ofrecombinant YiAPPA in Entercoccus faecalis EXW27注;M:蛋白質(zhì)Marker;ck:未經(jīng)誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌的胞內(nèi)可溶成分;pc:經(jīng)乳酸桿菌素sakacin P誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pSIP409-yiappads的重組糞腸球菌的胞內(nèi)可溶成分;10:10號(hào)克隆子的胞內(nèi)可溶成分;YiAPPA:經(jīng)Ni2+親和層析柱純化后的重組YiAPPA。圖中箭頭標(biāo)示為目的蛋白。

2.4 重組YiAPPA的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 pH對(duì)重組YiAPPA相對(duì)酶活的影響 將酶液于不同pH(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)條件下,測(cè)定pH對(duì)重組YiAPPA相對(duì)酶活的影響,結(jié)果如圖7所示。重組植酸酶YiAPPA的最適反應(yīng)pH為4.5,并且重組植酸酶YiAPPA在pH2.0～6.0范圍內(nèi)具有50%以上相對(duì)酶活。野生型YiAPPA的最適反應(yīng)pH為4.5,并于pH2.0～5.5條件下具有50%以上的相對(duì)酶活[10,26]。本研究中重組糞腸球菌表達(dá)的重組YiAPPA和野生型YiAPPA的最適反應(yīng)pH以及在不同pH條件下的相對(duì)酶活基本一致。

圖7 pH對(duì)酶活的影響Fig.7 pH dependence of phytase activity

2.4.2 pH對(duì)重組YiAPPA穩(wěn)定性的影響 重組植酸酶YiAPPA的pH穩(wěn)定性如圖8所示,其在pH1.0～3.0范圍內(nèi)具有80%以上的相對(duì)酶活;在pH4.0～10.0范圍內(nèi)具有90%以上的相對(duì)酶活。野生型YiAPPA于pH1.0～8.0條件下具有80%以上的穩(wěn)定性[10,26]。重組YiAPPA與野生型YiAPPA的pH穩(wěn)定性基本一致。

圖8 pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 pH stability of phytase activity

2.4.3 溫度對(duì)重組YiAPPA酶比活力和穩(wěn)定性的影響 按照植酸酶的酶比活力測(cè)定方法,于30～90 ℃下測(cè)定重組YiAPPA的酶比活力,以樣品的絕對(duì)酶活對(duì)溫度作圖,結(jié)果如圖9所示。重組植酸酶YiAPPA的最適反應(yīng)溫度為55 ℃,并且重組植酸酶YiAPPA于55 ℃的絕對(duì)酶活高達(dá)3900 U/mg。將重組植酸酶YiAPPA于80 ℃分別保溫不同時(shí)間,測(cè)定其相對(duì)酶活,分析其熱穩(wěn)定性,結(jié)果如圖10所示。在80 ℃下,重組植酸酶YiAPPA于80 ℃的半衰期約為15 min。重組YiAPPA于不同溫度下的酶比活力以及于80 ℃的半衰期與野生型YiAPPA[10,26]基本一致。

圖9 溫度對(duì)酶活的影響Fig.9 Temperature dependence of phytase activity

圖10 80 ℃重組YiAPPA的熱穩(wěn)定性Fig.10 Thermal stability of recombinant YiAPPA at 80 ℃

3 結(jié)論

本研究首先對(duì)比分析了糞腸球菌16S rRNA的啟動(dòng)子序列,然后以誘導(dǎo)型大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體pSIP409為基礎(chǔ)框架,并結(jié)合糞腸球菌16S rRNA的啟動(dòng)子序列特征和pSIP409中酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)構(gòu)建人工啟動(dòng)子文庫(kù)的相關(guān)引物,最后基于PCR引物和啟動(dòng)子序列中非保守序列的隨機(jī)化設(shè)計(jì)構(gòu)建人工啟動(dòng)子文庫(kù)。通過(guò)對(duì)人工啟動(dòng)子文庫(kù)的高通量篩選,獲得了控制植酸酶YiAPPA在糞腸球菌EXW27中高效組成型表達(dá)的組成型啟動(dòng)子p10。重組植酸酶YiAPPA在糞腸球菌EXW27中成功表達(dá),其最適反應(yīng)pH為4.5,在pH2.0～6.0范圍內(nèi)具有50%以上相對(duì)酶活,最適反應(yīng)溫度為55 ℃,絕對(duì)酶活高達(dá)3900 U/mg,于80 ℃的半衰期約為15 min。