黃酒米漿水中抗菌乳酸菌的篩選及特性分析

(浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州 310015)

黃酒(Huangjiu)是我國(guó)民族特產(chǎn)和傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一,通常以糯米為原料,經(jīng)浸米、蒸煮、加曲、糖化發(fā)酵、壓榨、過(guò)濾、煎酒、貯存、勾兌而成[1-2]。浸米是黃酒生產(chǎn)的第一個(gè)工藝,以生產(chǎn)用水對(duì)糯米進(jìn)行浸泡,每生產(chǎn)1噸黃酒約產(chǎn)生2噸米漿水[3]。米漿水富含淀粉、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3],還含有豐富的細(xì)菌,尤其是乳酸菌,含有少量酵母菌和霉菌等類(lèi)群微生物[4-6],鑒于環(huán)境保護(hù)和精深加工的需求,黃酒企業(yè)一直在探索米漿水的綜合、高效利用途徑。

近年來(lái),乳酸菌在食品保藏、飼料行業(yè)、保健、醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值被深入挖掘[7-9],我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品蘊(yùn)含豐富的乳酸菌資源,黃酒米漿水中富含乳酸菌,其代謝產(chǎn)物對(duì)黃酒的發(fā)酵過(guò)程、風(fēng)味產(chǎn)生及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值產(chǎn)生影響[4,6,10]。已有我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品如泡(醬)菜、發(fā)酵乳制品中具有抑菌活性乳酸菌的研究報(bào)道[11-12],鑒于乳酸菌基因組的多樣性大多與其所在的環(huán)境有關(guān),尤其與抗生素抗性、糖代謝、蛋白質(zhì)水解和限制性修飾等功能相關(guān)的基因與環(huán)境特異性相關(guān)[13],亟需深入認(rèn)識(shí)黃酒米漿水中抑菌乳酸菌的類(lèi)型及生理特性、抑菌物質(zhì)的理化特性等。革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)的化學(xué)組成、生理生化特性不同,有些抑菌物質(zhì)不能同時(shí)對(duì)G+和G-有抑制作用,比如成瀟龍等[14]研究發(fā)現(xiàn)米漿水對(duì)金黃色葡萄球菌(G+)有抑菌作用,故本文以致食品腐敗菌蠟樣芽胞桿菌(G+)和大腸桿菌(G-)為指示菌,對(duì)黃酒米漿水中具有抑制G+和G-的乳酸菌進(jìn)行篩選,并對(duì)其特性進(jìn)行初步分析,為米漿水的開(kāi)發(fā)和綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃酒米漿水 會(huì)稽山紹興酒股份有限公司;大腸桿菌(E.coli,ATCC44102)、蠟樣芽胞桿菌(B.cereus,AS1.2238) 浙江省微生物研究所;MRS培養(yǎng)基、胰酪大豆胨培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂粉、微生物生化反應(yīng)管 杭州微生物試劑有限公司;CaCO3成都市科龍化工試劑廠(chǎng);乳酸菌篩選培養(yǎng)基 含0.3% CaCO3MRS固體培養(yǎng)基;乳酸菌活化培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基;乳酸菌保藏培養(yǎng)基 含2%瓊脂粉的MRS固體培養(yǎng)基;大腸桿菌活化及培養(yǎng)培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;蠟樣芽孢桿菌活化及培養(yǎng)培養(yǎng)基 胰酪大豆胨培養(yǎng)基;2%素瓊脂 瓊脂粉20 g,蒸餾水1 L。

YM30Z滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;LRH-250恒溫培養(yǎng)箱 國(guó)華儀器有限公司;PHS-25酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠(chǎng);PL303電子分析天平 CX31光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司;梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Biofuge Primo R。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的初篩 采用溶鈣圈法[15],取100 μL適當(dāng)稀釋的米漿水涂布于MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24～48 h,挑取具有透明溶鈣圈、形狀不同的單個(gè)菌落。

1.2.2 抑菌乳酸菌的篩選 參照王偉[16]的方法,首先采用牛津杯法篩選對(duì)大腸桿菌和蠟樣芽胞桿菌有抑菌活性的乳酸菌,接著通過(guò)過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)篩選過(guò)氧化氫酶陰性菌株,所選菌株于MRS固體培養(yǎng)基上保藏,備用。

1.2.3 乳酸菌形態(tài)觀察及生理生化鑒定

1.2.3.1 菌株形態(tài) 將純化的有溶鈣圈的菌株接種于MRS平板上,37 ℃培養(yǎng)2 d,革蘭氏染色后顯微鏡觀察,挑取形態(tài)不一致菌株,編號(hào),保藏。

1.2.3.2 生理生化鑒定 按半乳糖、乳糖、松三糖、棉子糖、麥芽糖、葡萄糖、七葉苷、馬尿酸鈉、葡萄糖產(chǎn)氣、淀粉水解、精氨酸雙水解、吲哚反應(yīng)、明膠液化生化鑒定管的要求接種乳酸菌,考察乳酸菌的生理生化特性[17-18]。

1.2.4 乳酸菌抑菌活性的測(cè)定 將大腸桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂基液體培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h;蠟樣芽孢桿菌接種于胰酪胨大豆液體培養(yǎng)基,30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h;采用牛津杯法[16]考察乳酸菌上清液對(duì)指示菌的抑菌性能。

1.2.5 有機(jī)酸干擾的排除 參照王偉[16]的方法略有改動(dòng),用1 mol/L的NaOH將離心后的發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)至5.0,同時(shí)分別用乳酸、乙酸和鹽酸調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基pH至5.0作為對(duì)照;采用牛津杯法考察乳酸菌發(fā)酵上清液、乳酸、乙酸和鹽酸對(duì)指示菌的抑制活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)平行,用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的分離及部分形態(tài)

從黃酒米漿水中篩選出具有抑菌活性的乳酸菌菌株36株,其菌落形態(tài)為圓形,乳白色,表面光滑,邊緣齊整,不透明,質(zhì)地均勻,菌體無(wú)鞭毛,無(wú)芽孢產(chǎn)生,菌落周?chē)腥阝}圈。顯微鏡下,均為桿菌,只是菌株的長(zhǎng)寬不一;革蘭氏染色后有些菌株呈紫色,有的菌株呈紅紫色,說(shuō)明細(xì)胞壁肽聚糖和類(lèi)脂質(zhì)含量有差異。菌落形態(tài)及顯微鏡下菌體形態(tài)見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 乳酸菌菌落及融鈣圈Fig.1 LAB colony and calcification ring

圖2 幾株乳酸菌在顯微鏡下的菌體狀態(tài)(400×)Fig.2 The shape of several strains of the lacticacid bacteria under the microscope(400×)

2.2 乳酸菌生理生化特性

對(duì)分離得到的36株菌進(jìn)行生理生化鑒定,從表1可見(jiàn),36株乳酸菌均能利用葡萄糖、七葉苷及麥芽糖,精氨酸雙水解試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)、明膠試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣、淀粉水解都為陰性,由葡萄糖產(chǎn)氣為陰性得出36株乳酸菌均為同型發(fā)酵乳酸菌,也就是說(shuō)這些菌株發(fā)酵己糖幾乎全生成乳酸[16]。

表1 乳酸菌生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical properties of the LAB

參照《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[17],36株乳酸菌均為乳桿菌屬,R1、R6、R8與植物乳桿菌(L.plantarum)特征一致,R3與微小乳桿菌(L.minor)生化反應(yīng)相似度極高,R4、R33與鳥(niǎo)乳桿菌不解棉籽糖亞種乳桿菌(L.aviariussubsp.araffinosus)特征一致,R7、R35與鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)特征一致,R10、R15、R30與馬乳酒樣乳桿菌(L.kefiranofaciens)特征一致,R11、R13、R16、R18、R19、R20、R22、R24、R25、R27、R36與卷曲乳桿菌(L.crispatus)特征一致,R17、R21、R23、R28、R31、R34與嗜酸乳桿菌(L.acidlophilus)特征一致。菌株R2、R5、R9、R12、R14、R26、R29、R32無(wú)法確定,其中R2、R5、R9三者特征一致,R12與R32特征一致,R14、R29、R26三者不相同,這36株菌中唯獨(dú)R26不能使馬尿酸鈉產(chǎn)生沉淀。這36株菌均為乳桿菌屬,與毛青鐘等[19]的報(bào)道相符合。

2.3 乳酸菌抑菌活性

以G+菌株蠟樣芽孢桿菌、G-菌株大腸桿菌為指示菌,36株乳酸菌的抑菌活性見(jiàn)表2。從表2可知,36株乳酸菌均對(duì)蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌有抑制作用,以蠟樣芽孢桿菌為指示菌時(shí),抑菌圈清晰,抑菌圈最大的菌株為R2,其直徑為18.14 mm,抑菌圈最小的菌株為R26,其直徑為13.72 mm;以大腸桿菌為指示菌時(shí),抑菌圈不是很明顯,邊緣不清晰,抑菌圈最大的菌株為R3,其直徑為16.50 mm,抑菌圈最小的菌株為R15,其直徑為10.88 mm。

表2 乳酸菌抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of the LAB

從目前報(bào)道來(lái)看,大部分乳酸菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)只對(duì)G+或G-有抑制效果,少部分乳酸菌如乳酸菌SD-22[20]、乳酸菌Y13、X29和X30[21]、植物乳桿菌HLJ-174[22]等既抑制G+,也抑制G-,乳酸菌SD-22還對(duì)部分真菌有抑制作用[20]。本研究分離出的36株乳酸菌既對(duì)G+蠟樣芽孢桿菌有抑制作用,也對(duì)G-大腸桿菌未有抑制作用,說(shuō)明這些乳酸菌生理特征與現(xiàn)有報(bào)道有區(qū)別;另外,這可能就是浸米時(shí)間長(zhǎng)釀得的酒,入壇后能夠久藏不壞的原因之一。

圖3 乳酸菌對(duì)大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of the LABon B.cereus and E. coli注:A:蠟樣芽孢桿菌為指示菌;B:大腸桿菌為指示菌。

2.4 有機(jī)酸干擾的排除

目前發(fā)現(xiàn)乳酸菌的抑菌性主要依賴(lài)于其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,這些物質(zhì)主要有有機(jī)酸如乳酸、乙酸、蘋(píng)果酸等,蛋白或小肽如reuterin和bacteriocins[23-24],以及新型抑菌物質(zhì)如苯乳酸、4-羥基苯乳酸[25-26]等,為了驗(yàn)證該抑菌物質(zhì)是乳酸、乙酸、鹽酸,還是有機(jī)酸外的某類(lèi)物質(zhì),用乳酸、乙酸和鹽酸調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基至pH5.0的抑菌效果見(jiàn)表3。

表3 三種有機(jī)酸在pH5.0時(shí)的抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effect of threekinds of organic acids at pH5.0

從表3可見(jiàn),乳酸、乙酸和鹽酸調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基至pH5.0時(shí),對(duì)蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌均無(wú)抑菌活性;該結(jié)果與王偉[16]的研究報(bào)道相似。這說(shuō)明乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)并非是乳酸、乙酸和鹽酸等有機(jī)酸,而是由其它類(lèi)型的抑菌物質(zhì)組成的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在黃酒米漿水中分離得到36株對(duì)蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌同時(shí)有抑菌作用的乳桿菌,初步判斷為植物乳桿菌、微小乳桿菌、鳥(niǎo)乳桿菌不解棉籽糖亞種乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、馬乳酒樣乳桿菌、卷曲乳桿菌、嗜酸乳桿菌等。這36株乳桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)非乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸、乙酸和鹽酸。黃酒米漿水中乳酸菌資源豐富,但是其生理特性、發(fā)揮的功能及代謝通路仍不清楚,本研究?jī)H篩選了具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的乳酸菌,為黃酒米漿水中抑菌物質(zhì)的研究提供了思路,但是對(duì)乳酸菌的特性、抑菌物質(zhì)的類(lèi)型等仍需深入研究,因?yàn)槠洳粌H影響黃酒的品質(zhì),而且可能在食品保鮮、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。