白蘇葉乙醇提取物體外抗氧化活性評(píng)價(jià)及相關(guān)性分析

,*,2,*

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134; 2.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院,天津 301700)

白蘇(Perillafrutescens(L.)Britt)系唇形科紫蘇屬紫蘇植物的近似種,全株密被白色柔毛,葉片背面呈白色[1-2]。白蘇在我國(guó)各地均有種植,葉可直接食用或作為調(diào)味料用于肉類(lèi)的增香,種子可用于榨取食用油。白蘇具有抑菌、抗氧化、抗衰老等作用[1-2]。關(guān)于白蘇化學(xué)成分的研究甚少,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及同樣資源豐富的紫蘇[3-5],且其研究主要集中在莖葉中所含的揮發(fā)油[6-11],對(duì)于白蘇黃酮類(lèi)物質(zhì)的報(bào)道甚少。王靜等[12]發(fā)現(xiàn)白蘇葉黃酮類(lèi)物質(zhì)清除超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫及抑制豬油氧化的能力均略強(qiáng)于紫蘇葉黃酮。本課題組此前的工作中,優(yōu)化了黃酮類(lèi)的微波輔助提取條件,從白蘇葉的乙醇提取物(WPEE)中鑒定出了13種化合物,主要成分為迷迭香酸(74.94 μg/mg)、野黃芩苷(50.08 μg/mg)、檸檬酸(47.94 μg/mg)和芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷(41.08 μg/mg)[13-14]。

抗氧化劑通常是具有還原性和自由基清除能力,可以減弱、抑制甚至消除氧化反應(yīng)的一類(lèi)物質(zhì)[15]。隨著人們對(duì)食品安全的要求日漸提高,相比人工合成抗氧化劑,人們更關(guān)注較為安全的天然抗氧化劑。而現(xiàn)階段的研究表明,任何一種單一的評(píng)價(jià)方法均無(wú)法充分地評(píng)價(jià)樣品的抗氧化活性[16-17]。而不同的抗氧化評(píng)價(jià)方法之間所得的結(jié)果是否具有相關(guān)性未見(jiàn)報(bào)道,因此使用不同的方法從不同的角度對(duì)樣品的抗氧化活性和清除自由基的能力進(jìn)行研究并解釋不同評(píng)價(jià)方法的相關(guān)性是非常必要的。

本文采用六種方法即細(xì)胞內(nèi)活性氧清除能力(CAA)、總抗氧化活性(TAA)、清除超氧陰離子自由基(SSAR)、清除羥自由基(SHR)、清除二苯基苦基苯肼自由基(SDR)能力以及抑制卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化(ILLP)能力來(lái)評(píng)價(jià)WPEE的抗氧化活性。探討利用這六種方法評(píng)價(jià)抗氧化活性的可行性,以及這些方法與WPEE中活性成分含量的關(guān)系,借以揭示不同的抗氧化性評(píng)價(jià)方法之間的內(nèi)在聯(lián)系,為白蘇資源作為天然抗氧化劑替代人工合成抗氧化劑方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白蘇葉 河北省安國(guó)市,粉碎、過(guò)篩(20目);RAW264.7巨噬細(xì)胞 美國(guó)模式培養(yǎng)物集庫(kù)存;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) 美國(guó)Gibco公司;無(wú)血清高糖培養(yǎng)基(dulbecco modified eagle medium,DMEM)及青霉素、鏈霉素抗體 美國(guó)Hyclone公司;甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT) 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所;活性氧檢測(cè)試劑盒 江蘇碧云天生物科技有限公司;二苯基苦基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DS-5MC倒置顯微鏡 日本尼康公司;SpectraMax M5多功能讀板機(jī) 美國(guó)分子器件公司;HERAcell 240i二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)熱電公司;Lambda 25紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)珀金埃爾默公司;H2050R-1醫(yī)用離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白蘇葉乙醇提取物(WPEE)的制備 按照文獻(xiàn)[13-14]的方法,采用微波輔助提取法對(duì)白蘇葉粉末進(jìn)行提取(提取條件為:乙醇濃度63%、液料比41∶1 mL∶g、微波溫度72 ℃、提取時(shí)間7 min以及微波功率500 W),并利用AB-8大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化,冷凍干燥后獲得白蘇葉醇提物粉末備用。使用甲醇配制4 mg/mL的白蘇葉醇提物樣品液,經(jīng)制備色譜分離純化初步得到2個(gè)組分(以下簡(jiǎn)稱(chēng)F1和F2),貯于陰涼干燥處備用。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)活性氧清除能力(CAA)的測(cè)定 利用DMEM將WPEE、F1和F2分別配制成1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液,0.2 μm濾膜過(guò)濾除菌后,冰箱冷藏4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)前利用DMEM將儲(chǔ)備液適當(dāng)稀釋得到濃度為0.001、0.1和0.5 mg/mL的工作液。

首先,為選擇細(xì)胞抗氧化活性測(cè)定時(shí)合適的WPEE的濃度,運(yùn)用MTT比色法測(cè)定不同濃度下的細(xì)胞存活率[18]。將RAW264.7細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基[含10% FBS、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)],37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于白色透明96孔板,37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)24 h后,吸除上述DMEM培養(yǎng)基并使用磷酸緩沖液(PBS,0.85% NaCl,2.68 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4和1.76 mmol/L KH2PO4)沖洗3次。再向每孔中加入100 μL濃度為0.001、0.1和0.5 mg/mL的WPEE、F1或F2溶液,不同濃度的所有樣品均設(shè)六個(gè)復(fù)孔,再培養(yǎng)24 h后,加入20 μL 5.0 mg/mL MTT再培養(yǎng)4 h,吸除液體后向每孔加入100 μL二甲基亞砜用以溶解藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶,置于多功能讀板機(jī)低速振蕩以助溶解,并利用讀板機(jī)讀取570 nm處吸光度值ODx;空白組為每孔不接種細(xì)胞,以DMEM培養(yǎng)基替代樣品,讀取吸光度值記為OD0;而對(duì)照組為每孔接種細(xì)胞,同樣以DMEM培養(yǎng)基替代樣品,讀取吸光度值記為ODc。細(xì)胞的存活率(%)由式(1)計(jì)算:

式(1)

然后,采用DCFH-DA探針?lè)y(cè)定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。接種細(xì)胞于黑色96孔板(底部透明),培養(yǎng)24 h后吸除上述DMEM培養(yǎng)基并使用PBS沖洗3次。再向每孔加入100 μL 10 μmol/L DCFH-DA探針和100 μL 0.1 mg/mL WPEE(上述細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)證明此濃度的黃酮對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)影響),培養(yǎng)30 min后吸除液體,再使用PBS沖洗,最后加入100 μL 100 μmol/L H2O2,每隔5 min測(cè)定上述液體1 h內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化(激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488和525 nm)?？瞻捉M為加入探針但不加WPEE和H2O2的孔,對(duì)照組為加入探針和H2O2但不加入WPEE的孔。一方面,DCFH-DA探針可自由進(jìn)出細(xì)胞,活細(xì)胞酯酶可分解DCFH-DA生成還原性的DCFH,產(chǎn)物DCFH無(wú)法穿透細(xì)胞膜,故滯留于細(xì)胞內(nèi);另一方面,細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)可在H2O2的刺激下增多,H2O2亦可自發(fā)產(chǎn)生更多的ROS,ROS將還原性的DCFH氧化成熒光物質(zhì)DCF,其熒光強(qiáng)度可間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平,并可間接評(píng)價(jià)樣品的細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力[19-20]。故細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定可通過(guò)測(cè)定DCF熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn),分別以時(shí)間和熒光強(qiáng)度為橫、縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn),CAA可由式(2)計(jì)算:

式(2)

1.2.3 總抗氧化活性(TAA)的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16,21-22]所使用的磷鉬絡(luò)合物法測(cè)定WPEE的TAA。首先將WPEE、F1、F2及VC溶液配制成濃度0.1～0.3 mg/mL的樣品待測(cè)液,其次將0.4 mL的樣品待測(cè)液與4.0 mL的磷鉬試劑(鉬酸銨、磷酸鈉和硫酸終濃度分別為4.0、28.0和0.6 mmol/L)混勻于水浴95 ℃恒溫反應(yīng)90 min,測(cè)定695 nm處吸光度A695 nm。所有測(cè)定均平行重復(fù)3次,以下同(細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)除外)。

1.2.4 清除超氧陰離子自由基(SSAR)能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[23-24]利用鄰苯三酚自氧化動(dòng)力學(xué)法測(cè)定WPEE的SSAR。首先進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描確定鄰苯三酚在堿性條件下(Tris-HCl緩沖液pH8.2,濃度0.05 mol/L)的最大吸收波長(zhǎng)為320 nm。在相同堿性條件下,將濃度為0.1～0.3 mg/mL WPEE、F1和F2或VC的樣品液各1.5 mL分別加入0.5 mL 3.0 mmol/L鄰苯三酚溶液和2.5 mL蒸餾水(上述反應(yīng)試劑均提前37 ℃恒溫水浴20 min),每隔1 min測(cè)定320 nm處吸光度值A(chǔ)320 nm。以A320 nm為縱坐標(biāo),反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖,所得直線(xiàn)的斜率為添加樣品后的鄰苯三酚的自氧化速率Vs。而將樣品液替換為蒸餾水進(jìn)行上述操作,作圖所得的斜率為鄰苯三酚本身的自氧化速率V0。SSAR由式(3)計(jì)算:

式(3)

1.2.5 清除羥自由基(SHR)能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[25]利用水楊酸法測(cè)定WPEE的SHR。利用Fenton反應(yīng)亞鐵離子(Fe2+)與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成OH-自由基,而OH-自由基與水楊酸反應(yīng)生成有色物質(zhì),在510 nm處有特征吸收,當(dāng)加入OH-自由基清除劑時(shí)與水楊酸形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,減少有色物質(zhì)的生成量,從而降低吸光度值。取若干支比色管,首先加入1.0 mL 10 mmol/L硫酸亞鐵溶液(由煮沸放冷的蒸餾水及稀硫酸配制)和2.0 mL 5 mmol/L水楊酸,再分別加入1 mL濃度為0.1～0.5 mg/mL的WPEE、F1、F2或VC的樣品液,最后加入2.0 mL 0.03% H2O2混勻,置于恒溫水浴37 ℃、30 min后測(cè)定A510 nm。其中,An為加入樣品液時(shí)所得吸光度值,以蒸餾水替代樣品液時(shí)為空白對(duì)照液吸光度值A(chǔ)0,不添加H2O2時(shí)樣品溶液的本底吸光度值為A′n。SHR由式(4)計(jì)算:

式(4)

1.2.6 清除DPPH自由基(SDR)能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[26-27]測(cè)定WPEE的SDR。DPPH自由基被還原時(shí),顏色會(huì)由紫色褪至淡黃色,故可通過(guò)測(cè)定加入抗氧化物質(zhì)后517 nm處吸光度A517 nm的變化即可計(jì)算DPPH自由基的清除率。首先,配制濃度為0.02～0.10 mg/mL的WPEE、F1和F2以及VC樣品溶液。取0.5 mL上述樣品液與3.5 mL 1.0×10-4mol/L DPPH混勻避光反應(yīng)30 min后測(cè)定吸光度值A(chǔ)517 nm;0.5 mL樣品液與3.5 mL無(wú)水乙醇混勻后測(cè)定空白吸光度值為A0;0.5 mL無(wú)水乙醇與3.5 mL 1.0×10-4mol/L DPPH混勻后測(cè)定對(duì)照吸光度值為A1。SDR由式(5)計(jì)算:

式(5)

1.2.7 抑制卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化(ILLP)能力的測(cè)定 Fe2+能夠誘發(fā)卵黃磷脂C-2位上的低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)以及多不飽和脂肪酸(PUFA或稱(chēng)為過(guò)不飽和脂肪酸)的過(guò)氧化,此模型可運(yùn)用于WPEE抗氧化能力的測(cè)定。按照文獻(xiàn)[28]方法并略作改進(jìn)。首先取新鮮雞蛋的卵黃與0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS,pH7.45)1∶1 (v∶v)磁力攪拌混勻,再使用該P(yáng)BS稀釋25倍,制得卵黃懸液冷藏4 ℃儲(chǔ)存待用。取0.2 mL卵黃懸液,加入0.6 mL 0.1 mg/mL的WPEE、F1和F2或VC樣品液,0.2 mL 25 mmol/L FeSO4溶液及1.0 mL PBS混勻,37 ℃培養(yǎng)12 h后加入0.5 mL 20%三氯乙酸,混勻靜置10 min,離心10 min(3500 r/min)。分別吸取2.0 mL上清加入1.0 mL 0.8%硫代巴比妥酸(TBA)混勻,沸水浴15 min,冷卻后于532 nm測(cè)定樣品吸光度值A(chǔ)b。以蒸餾水代替樣品經(jīng)上述操作,測(cè)定對(duì)照吸光度值A(chǔ)0。ILLP以抑制率表示:

式(6)

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)測(cè)定均重復(fù)3次,測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同方法測(cè)定的WPEE、F1、F2以及VC的抗氧化性及清除自由基的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析,進(jìn)一步使用SPSS對(duì)不同測(cè)定方法所得白蘇葉黃酮抗氧化活性及清除自由基能力、白蘇葉黃酮含量百分比進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPEE、F1和F2對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧清除能力(CAA)的影響

2.1.1 WPEE濃度的選取 細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性測(cè)定時(shí)需在不影響細(xì)胞存活前提下進(jìn)行,故需要選擇合適的WPEE濃度。故測(cè)定不同濃度的WPEE、F1和F2對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。MTT可與活細(xì)胞的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)生成藍(lán)色的甲瓚結(jié)晶,于可見(jiàn)光處有吸收;相反,死細(xì)胞不具有此種還原酶無(wú)法將MTT還原[29]?；罴?xì)胞數(shù)量與甲瓚結(jié)晶生成量成正比,故測(cè)定吸光度值的高低可以間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。圖1顯示當(dāng)WPEE、F1和F2濃度低于0.5 mg/mL時(shí),對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率均無(wú)影響;當(dāng)樣品液濃度為0.001時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)自由基的清除率較低或效果不明顯,而當(dāng)樣品液濃度較高時(shí),WPEE相對(duì)浪費(fèi),故測(cè)定CAA時(shí),WPEE、F1和F2濃度均選取中間濃度0.1 mg/mL。

圖1 WPEE、F1和F2對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of WPEE,F1 and F2 on the cell viability注:NS代表相同濃度下WPEE和不同組分的細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.1.2 細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果 WPEE、F1和F2(濃度均為0.1 mg/mL)對(duì)RAW264.7細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響如圖2所示。DCFH-DA本身無(wú)熒光,經(jīng)酯酶水解生成的DCFH可被ROS氧化成具有熒光的DCF,熒光強(qiáng)度越高,說(shuō)明ROS含量越多,當(dāng)ROS清除劑存在時(shí),ROS含量減少則熒光強(qiáng)度降低,故熒光強(qiáng)度的測(cè)定可間接反應(yīng)出樣品的CAA大小[20]。由圖2可知,與對(duì)照組相比,WPEE、F1和F2均可極顯著降低DCF熒光強(qiáng)度(P<0.01),證明了WPEE、F1和F2均具有清除細(xì)胞內(nèi)ROS的能力,具有良好的細(xì)胞內(nèi)抗氧化效果。其中,熒光強(qiáng)度越低代表樣品所清除的ROS含量越多,F2組的熒光強(qiáng)度降低最多,WPEE次之,F1降低最少,故可得出在細(xì)胞內(nèi)清除ROS的能力依次為F2>WPEE>F1。

圖2 WPEE、F1和F2對(duì)DCF熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effects of WPEE,F1 and F2on the fluorescence intensity of DCF注:圖中不同小寫(xiě)字母代表反應(yīng)時(shí)間為1 h時(shí)不同樣品組的DCF熒光強(qiáng)度差異極顯著(P<0.01)。

2.1.3 CAA值測(cè)定結(jié)果 利用上述曲線(xiàn)的積分面積及公式(6)計(jì)算可得WPEE、F1和F2在RAW264.7細(xì)胞CAA值(圖3)。在濃度為0.1 mg/mL時(shí),WPEE、F1及F2均具有一定的抗氧化活性,且抗氧化效果差異極顯著(P<0.01),由高到低依次為F2>WPEE>F1。這主要是由于F1和F2的主成分中含有檸檬酸和迷迭香酸[14],后者比起前者結(jié)構(gòu)上具有多個(gè)酚羥基,而這些酚羥基通常是自由基清除的主要作用基團(tuán)[30]。上述結(jié)果說(shuō)明WPEE及其成分不僅在體外可以清除自由基,亦可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)清除ROS,在細(xì)胞內(nèi)亦能夠發(fā)揮良好的抗氧化效果。

圖3 WPEE、F1和F2對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性單位(CAA)的影響Fig.3 Effects of WPEE,F1 and F2 on the cellularantioxidant activity(CAA)units in RAW264.7 cells注:圖中不同小寫(xiě)字母代表相同濃度下WPEE和不同組分的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性單位(CAA)差異極顯著(P<0.01)。

2.2 WPEE、F1和F2的總抗氧化活性(TAA)

WPEE、F1和F2以及VC的TAA的測(cè)定結(jié)果如圖4所示。樣品液濃度與吸光度成正相關(guān),且在測(cè)試濃度范圍內(nèi)(0.1～0.3 mg/mL)TAA大小順序?yàn)?VC>F2>WPEE>F1。根據(jù)白蘇葉成分的研究結(jié)果[14]可知,F1和F2的主成分中含有檸檬酸和迷迭香酸,且各占其組分含量的28%和41%,此外,F1和F2含黃酮類(lèi)物質(zhì)約為39%和53%。檸檬酸供氫能力較弱,是常見(jiàn)的金屬螯合劑,而迷迭香酸以及黃酮類(lèi)物質(zhì)均具有多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu),故F2比F1具有更好的抗氧化活性。

圖4 WPEE、F1和F2以及VC的總抗氧化活性(TAA)Fig.4 Total antioxidant activities(TAA)of WPEE,F1,F2 and Vc注:圖中不同小寫(xiě)字母代表樣品液濃度為0.30 mg/mL時(shí)不同樣品的總抗氧化活性(TAA)差異極顯著(P<0.01)。

2.3 WPEE、F1和F2清除超氧陰離子自由基(SSAR)的能力

圖5 WPEE、F1和F2以及抗壞血酸(VC)對(duì)超氧陰離子自由基的清除率rate of WPEE,F1,F2 and VC注:圖中不同小寫(xiě)字母代表相同濃度下不同樣品的超氧陰離子自由基的清除率差異極顯著(P<0.01);不同大寫(xiě)字母代表相同樣品不同濃度下的超氧陰離子自由基的清除率差異極顯著(P<0.01)。

2.4 WPEE、F1和F2清除羥自由基(SHR)的能力

WPEE、F1和F2以及VC在不同濃度下對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定結(jié)果如圖6所示。在濃度范圍0.1～0.5 mg/mL時(shí),樣品對(duì)羥自由基的清除能力均具有濃度依賴(lài)性,濃度增加清除率升高,且WPEE和F2清除率甚至超過(guò)VC,當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí),清除能力依次為F2>WPEE>VC>F1,F2的清除率接近50%而VC僅達(dá)到36.75%。黃酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)上具有酚羥基,而這些酚羥基是發(fā)揮羥自由基清除能力的主要作用基團(tuán),且酚羥基數(shù)目與清除能力成正相關(guān)[30]。F2中含量最高為迷迭香酸占41%,其次是野黃芩苷占27%[14]。迷迭香酸是酚酸類(lèi)物質(zhì),具有多個(gè)酚羥基故具有良好的羥自由基的清除能力[31];而野黃芩苷結(jié)構(gòu)上于A環(huán)具有5-和6-OH,C環(huán)具有4′-OH,對(duì)羥自由基亦具有良好的清除能力。本研究結(jié)果中F2具有更高的羥自由基清除能力亦證明了此結(jié)論。

圖6 WPEE、F1和F2以及抗壞血酸(VC)對(duì)羥自由基(OH-·)的清除率Fig.6 Hydroxyl radicals(OH-·)scavengingrate of WPEE,F1,F2 and VC注:圖中不同小寫(xiě)字母代表樣品液濃度為0.5 mg/mL時(shí)不同樣品的羥自由基清除率差異極顯著(P<0.01)。

2.5 WPEE、F1和F2清除DPPH自由基(SDR)的能力

WPEE、F1和F2以及VC對(duì)DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果如圖7所示。在濃度范圍0.02～0.10 mg/mL時(shí),樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力均隨著濃度的升高而增加。當(dāng)樣品濃度為0.10 mg/mL時(shí),清除能力依次為VC>F2>WPEE>F1(P<0.01),其中F2對(duì)DPPH自由基的清除率較高,亦證明了F2主要成分迷迭香酸及黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)上所具有的酚羥基有助于自由基的清除。

圖7 WPEE、F1和F2以及抗壞血酸(VC)對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.7 DPPH free radicals scavengingrate of WPEE,F1,F2 and Vc注:圖中不同小寫(xiě)字母代表樣品液濃度為0.10 mg/mL時(shí)不同樣品的DPPH自由基清除率差異極顯著(P<0.01)。

2.6 WPEE、F1和F2抑制卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化(ILLP)的能力

WPEE、F1和F2以及VC抑制卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化能力的測(cè)定結(jié)果如圖8所示。在相同濃度0.1 mg/mL時(shí),VC與WPEE各組分對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化均有抑制效果,其中F2和WPEE的抑制率分別達(dá)到了72.40%和68.04%,均極顯著高于VC的54.02%(P<0.01),但F1的抑制率較低,為23.03%。該反應(yīng)模式是利用Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白的PUFA更易產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化[32],而黃酮類(lèi)化合物具有抑制脂蛋白PUFA的脂質(zhì)過(guò)氧化功能,本研究中WPEE對(duì)該脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率高于70%的結(jié)果亦證明了此結(jié)論:F2脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率最高主要是因其主成分(迷迭香酸和野黃芩苷)的酚羥基數(shù)量多,易與自由基反應(yīng);相反地,F1抑制率低是由于其第一主成分是檸檬酸無(wú)酚羥基,且第二主成分芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷[14]具有C-6,8位碳糖苷,已有研究表明,此糖苷對(duì)黃酮的抗氧化活性及清除自由基能力具有不利影響[33]。故WPEE的F1和F2抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力差距較大。

圖8 WPEE、F1和F2以及VC對(duì)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率Fig.8 Inhibition rate of yolk lipoproteinperoxidation of WPEE,F1,F2 and VC注:圖中不同小寫(xiě)字母代表相同濃度下不同樣品對(duì)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率極顯著(P<0.01)。

2.7 相關(guān)性分析

表1 抗氧化活性及清除自由基能力、WPEE相對(duì)含量的皮爾森相關(guān)系數(shù)Table 1 Pearson’s correlation coefficients among antioxidant activities,free radical scavenging activities and relative content of WPEE

3 結(jié)論

本研究結(jié)合六種不同體系對(duì)WPEE體外抗氧化活性及清除自由基能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于黃酮抗氧化活性的正確評(píng)價(jià)需要結(jié)合其理想濃度,因?yàn)椴煌w系所使用的方法原理、靈敏度、特征性均不一致,故每種體系所使用的黃酮濃度均是不同的。獨(dú)立的測(cè)定方法、不同濃度、不同組分的測(cè)定結(jié)果全面評(píng)價(jià)了WPEE的抗氧化活性和清除自由基能力。六種評(píng)價(jià)方法均證實(shí)WPEE有明顯的抗氧化活性,其中TAA、SSAR和SDR活性順序均為:VC>F2>WPEE>F1,但SHR及ILLP活性順序?yàn)?F2>WPEE>VC>F1。綜上所述,WPEE作為天然抗氧化劑完全有潛力代替人工合成抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè),天然、安全、無(wú)污染。未來(lái)的研究熱點(diǎn)可能包括建立一整套操作成本低廉、簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠且較為全面的測(cè)試方法所構(gòu)成的植物天然抗氧化性能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)與體系。