苦丁皂苷L、苦丁皂苷N與牛血清白蛋白的相互作用研究

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(1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130012; 2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130012; 3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118; 4.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130021)

苦丁茶冬青(IlexkudingchaC.J.Tseng)為冬青科冬青屬喬木植物,主產(chǎn)于廣西、湖北、湖南、廣東、海南等地,是藥、飲兼用之名貴珍品?？喽〔瓒嗪形瀛h(huán)三萜及苷類、黃酮、多酚、氨基酸、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[1-3],皂苷類化合物是其主要成分。研究表明,苦丁茶冬青具有降血脂、降血壓、抗菌、消炎、增強(qiáng)和調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用,目前臨床上主要用于治療高血壓、高血脂、高血糖等疾病[4-5]。

血清白蛋白(SA)是血液中含量最豐富的蛋白質(zhì),能攜帶許多藥物分子通過血漿儲(chǔ)運(yùn)到達(dá)受體部位產(chǎn)生藥效,易與多種內(nèi)外源物質(zhì)結(jié)合,對(duì)藥物的儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)有重要作用[6-7]。因此,確定藥物與血清白蛋白的結(jié)合能力和類型等信息,對(duì)研究藥物的藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、藥理學(xué)以及毒理學(xué)具有重要意義。牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白(HSA)結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)相似[8-9],所以人們長(zhǎng)期研究藥物與BSA的結(jié)合情況,作為對(duì)HSA結(jié)合情況的參考。

苦丁茶苯丙素苷類與蛋白質(zhì)相互作用研究已有文獻(xiàn)報(bào)道[10],苦丁茶皂苷類成分與BSA相互作用未見報(bào)道。本文采用熒光光譜法和圓二色譜法對(duì)苦丁茶皂苷類成分與BSA相互作用進(jìn)行研究,有助于了解其在體內(nèi)與HSA結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)的過程,在分子水平上認(rèn)識(shí)苦丁茶皂苷類成分與HSA相互作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),對(duì)苦丁茶皂苷類成分的研究與開發(fā)提供科學(xué)的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦丁皂苷L(kudinoside L)、苦丁皂苷N(kudinoside N) 均為實(shí)驗(yàn)室自制,純度≥98%;牛血清白蛋白(≥98%,Mr=68000) Sigma-Aldrich9(上海)貿(mào)易有限公司;乙腈、甲醇 色譜純,美國(guó)TEDIA公司;pH=7.4 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液;水 超純水;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LC-20A型高效液相色譜儀、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、RF-5301熒光光譜儀、MOS-450圓二色譜儀 日本島津公司;BT-25S電子分析天平 德國(guó)賽多利斯公司;Pos-D微量移液器 美國(guó)Rainin公司;ZD-600A恒溫循環(huán)槽 上海精科儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 kudinoside L、kudinoside N分離純化及鑒定 將干燥的苦丁茶冬青葉7.5 kg粉碎,加入8 BV的70%乙醇浸提3次,每次5 d,合并提取液,減壓濃縮成浸膏。依次用石油醚(3×4 L)、乙酸乙酯(3×4 L)、水飽和正丁醇(3×4 L)萃取:將流體狀浸膏轉(zhuǎn)入分液漏斗中,先加入4 L萃取劑充分振搖,靜置分層,收集萃取部分(石油醚部分棄去),萃取3次,合并萃取液;再在流體狀浸膏中加入下一萃取劑同樣方法重復(fù)萃取3次。將各萃取部位減壓濃縮、低溫蒸干后,粉末固體過100目篩。各萃取部位分別得到固體:乙酸乙酯部(393 g)、正丁醇部(820 g)、剩余水部分(750 g)。取正丁醇萃取部位粉末100 g,經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷-甲醇=4∶1,50倍體積洗脫),收集洗脫部分,再經(jīng)C18填料及半制備型高效液相分離。色譜條件:選用YMC-Pack C18柱,流動(dòng)相乙腈-水二元梯度洗脫,0～15 min 30%乙腈,15～45 min 30%～50%乙腈,分析時(shí)間45 min,流速2 mL/min,柱溫35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm,進(jìn)樣量40 μL,分離得到化合物A、化合物B?；衔顰、化合物B濃度:(樣品峰面積/總峰面積)×100%。分別取10 mg化合物A、B,用0.5 mL氘代吡啶溶解后轉(zhuǎn)移到核磁管中待測(cè),通過1H-NMR、13C-NMR鑒定化合物是否為kudinoside L、kudinoside N。1H-NMR測(cè)定條件:測(cè)定溫度298 K,頻率600 MHz,譜寬33333 Hz;13C-NMR測(cè)定條件:測(cè)定溫度298 K,頻率150 MHz,譜寬33333 Hz。

1.2.2 溶液制備 pH=7.4 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液:取19 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4,81 mL 0.2 mol/L的Na2HPO4,加水稀釋到1000 mL;1×10-5mol/L的牛血清白蛋白貯備溶液:稱取6.8 mg BSA溶于10 mL磷酸緩沖溶液中,置于4 ℃冰箱中備用;將kudinoside L、kudinoside N溶于磷酸緩沖溶液中,配制成濃度為1×10-2mol/L貯備溶液,置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 熒光光譜法測(cè)定 用移液槍精密吸取3 mL 1×10-5mol/L的BSA溶液加入到1 cm的熒光比色皿中,用微量注射器逐次加入濃度為1.0×10-2mol/L的kudinoside L、kudinoside N溶液,吹打混勻,累積加樣總體積控制在0.1 mL內(nèi);利用恒溫循環(huán)槽保持反應(yīng)體系的溫度(25和37 ℃),將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm,在290～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)。

1.2.4 圓二色譜測(cè)法測(cè)定 室溫下,利用0.1 mm石英比色皿進(jìn)行圓二色譜的測(cè)量。掃描參數(shù):狹縫寬度1 nm,反應(yīng)時(shí)間2 s,波長(zhǎng)掃描范圍190～250 nm,掃描速度1 nm/5 s,kudinoside L、kudinoside N與BSA的摩爾濃度比分別為13∶1、26∶1、39∶1、52∶1、65∶1,利用磷酸緩沖溶液作為參比,觀察反應(yīng)體系隨著藥物分子的加入,圓二色譜值的變化,并用平均殘基摩爾橢圓率MRE來計(jì)算出BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量的變化[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)化合物A、化合物B進(jìn)行1H-NMR、13C-NMR鑒定。綜合化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道基本吻合,故化合物A、B鑒定為kudinoside L、kudinoside N,純度分別為98.87%、98.03%,液相色譜結(jié)果如圖1所示,核磁結(jié)果如圖2所示,分子結(jié)構(gòu)式如圖3所示。

圖2 kudinoside L、kudinoside N的1H-NMR、13C-NMR圖譜Fig.2 1H-NMR and 13C-NMR NMRspectra of kudinoside L,kudinoside N

圖1 kudinoside L、kudinoside N液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of kudinoside L,kudinoside N注:a:kudinoside L,b:kudinoside N;圖2同。

2.2 熒光光譜

熒光光譜能夠提供小分子與蛋白的結(jié)合特征,如結(jié)合機(jī)制、結(jié)合模式、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等參數(shù)。BSA中有三種內(nèi)源熒光團(tuán),分別是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸,但是BSA的熒光強(qiáng)度主要來源于色氨酸殘基,而當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí),此時(shí)BSA的發(fā)射波長(zhǎng)會(huì)在340 nm左右[16];而當(dāng)小分子與BSA相互作用時(shí),蛋白質(zhì)的熒光可能會(huì)被猝滅。如圖2所示,隨著兩種化合物的加入,BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地減少,在不同溫度下(298、310 K),kudinoside L分別猝滅28.19%、33.23%,kudinoside N分別猝滅16.99%、19.93%,同時(shí)kudinoside L導(dǎo)致BSA的發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了微弱的藍(lán)移,而kudinoside N的發(fā)射波長(zhǎng)沒有改變,提示kudinoside L與BSA相互作用后蛋白的生色基團(tuán)疏水結(jié)構(gòu)更緊密,肽鏈的伸展程度減少,疏水性增加[17]。

2.2.1 猝滅類型 根據(jù)Stern-Volmer方程可知,曲線如果呈線性,則說明猝滅過程為靜態(tài)猝滅或動(dòng)態(tài)猝滅。然而,當(dāng)猝滅過程同時(shí)發(fā)生靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅時(shí),Stern-Volmer的圖將會(huì)呈現(xiàn)出一條向上彎曲的曲線。圖5為不同溫度下(298和310 K),由Stern-Volmer方程作出的關(guān)于kudinoside L、kudinoside N對(duì)BSA的猝滅圖。表1列出了相互作用過程中的Stern-Volmer猝滅常數(shù)(Ksv)和雙分子熒光猝滅常數(shù)(Kq)。依據(jù)文獻(xiàn)[18],BSA的平均熒光壽命值為6.0×l0-9s。不同溫度下,kudinoside L、kudinoside N對(duì)BSA的Stern-Volmer猝滅曲線如圖5所示,Ksv、Kq值列于表1。

表1 不同溫度(298、310 K)下的猝滅常數(shù)及猝滅速率常數(shù)Table 1 Quenching constant and quenching rate constant at different temperatures(298,310 K)

圖5 不同溫度下(298、310 K)kudinoside L、kudinoside N對(duì)BSA的Stern-Volmer猝滅曲線Fig.5 Stern-Volmer quenching curve of kdinoside L andkudinoside N to BSA at different temperatures(298,310 K)注:Q為猝滅劑的濃度;CBSA=2×10-5 mol/L。

由圖3可知,kudinoside L、kudinoside N對(duì)BSA的Stern-Volmer猝滅曲線均為一條直線,說明兩種藥物分子與BSA相互作用存在單一猝滅類型,且隨著溫度的升高,速率常數(shù)Ksv上升,說明猝滅類型為動(dòng)態(tài)猝滅[19]。在相同溫度下,kudinoside L的Ksv值均比kudinoside N要大,因此kudinoside N比kudinoside L對(duì)BSA的熒光猝滅的程度要小。

圖3 kudinoside L、kudinoside N分子結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Molecular structure of kudinoside L,kudinoside N

2.2.2 結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算由log[(F0-F)/F]對(duì)log[Q]作圖所得直線的截距和斜率可求得Ka和n。不同溫度下,kudinoside L、kudinoside N的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)見表2。

圖4 不同溫度下(298、310 K)kudinoside L、kudinoside N對(duì)BSA熒光光譜的影響Fig.4 Effects of kudinoside L and kudinoside N on the fluorescence spectra of BSA at different temperatures(298,310 K)注:a→k:kudinoside L,kudinoside的體積=0、2、4、5、6、8、10、12、14、16、20 μL。

表2 不同溫度(298,310 K)下的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 2 Binding constants and number of binding sites at different temperatures(298,310 K)

從表2可以看出,kudinoside L、kudinoside N在與BSA的作用過程中,隨著溫度的升高,結(jié)合常數(shù)Ka均變大,再結(jié)合熒光分析的結(jié)果可知,kudinoside L、kudinoside N對(duì)BSA的猝滅類型是以動(dòng)態(tài)猝滅為主,兩個(gè)化合物分別與BSA各形成1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

2.2.3 作用力類型 kudinoside L、kudinoside N在不同溫度下,焓變(ΔH)、熵變(ΔS)和吉布斯自由能變化(ΔG)的相關(guān)參數(shù)見表3。

由表3可知,在kudinoside L、kudinoside N與BSA的相互作用過程中,ΔG<0,說明kudinoside L、kudinoside N與BSA的相互作用過程均是一個(gè)吉布斯自由能降低的自發(fā)的過程,而ΔH、ΔS均大于0,表明反應(yīng)為熵驅(qū)動(dòng)過程[20-21],由于小分子與BSA結(jié)合的過程中會(huì)發(fā)生去水化,同時(shí)BSA結(jié)合位點(diǎn)附近的水化層也會(huì)受到相應(yīng)地破壞,這是吸熱熵增明顯的過程,該過程TΔS>ΔH,ΔG<0,吸熱過程要強(qiáng)于放熱過程,故兩個(gè)化合物與BSA的主要作用力為疏水作用[22-23]。

表3 相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Related thermodynamic parameters

2.3 對(duì)BSA構(gòu)象的影響

通過圓二色譜儀測(cè)定蛋白溶液的圓二色譜,可以了解蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)下的各種二級(jí)結(jié)構(gòu)變化信息。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋在圓二色譜中一般含有兩個(gè)負(fù)峰,在222 nm處的負(fù)峰是由肽鍵中的n→π*所導(dǎo)致的,而在208 nm處的負(fù)峰則是由肽鍵中的π→π*所形成的[24]。β-折疊和無規(guī)卷曲分別在215和198 nm出現(xiàn)一個(gè)負(fù)峰。在測(cè)量蛋白圓二色譜時(shí),常用平均殘基摩爾橢圓率MRE來計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。圓二色譜曲線圖以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),以橢圓度observed CD(mdeg)為縱坐標(biāo)。kudinoside L、kudinoside N與BSA相互作用圓二色譜圖如圖6。

圖6 不同濃度的kudinoside L、kudinoside N對(duì)BSA圓二色譜譜圖的影響Fig.6 Effects of different concentrations of kudinoside Land kudinoside N on circular dichroism chromatograms of BSA

結(jié)合圖6和表4可知,隨著藥物小分子濃度的增加,kudinoside L使得BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)從60.80%增加到74.0%,β-折疊的含量從3.8%增加到13.9%,BSA內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)正在發(fā)生從無規(guī)卷曲向α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊含量增加的過程;kudinoside N使得BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)從71.1%降低到64.8%,β-折疊的含量從0.6%增加到7.8%,β-轉(zhuǎn)角的含量從6.3%增加到14.7%,無規(guī)卷曲含量從22.0%降低到11.3%,說明α-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲向β-折疊和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變。

表4 BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)在不同濃度藥物小分子作用下的變化Table 4 Changes of secondary structure of BSA under the action of small molecules of different concentrations of drugs

3 結(jié)論

熒光光譜法研究表明,kudinoside L、kudinoside N對(duì)BSA的猝滅類型為動(dòng)態(tài)猝滅,作用力類型是疏水作用力。kudinoside N對(duì)BSA的熒光猝滅的程度和結(jié)合常數(shù)均比kudinoside L小,這可能與兩者的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。kudinoside N與kudinoside L母核結(jié)構(gòu)一致,僅在C-28上多了一個(gè)鼠李糖基,糖鏈比kudinoside L長(zhǎng),藥物分子更難插入到BSA內(nèi)部的疏水腔中,增加了與BSA結(jié)合的難度。從藥代動(dòng)力學(xué)角度來說,結(jié)合常數(shù)小更有利于kudinoside N在的體內(nèi)釋放并縮短藥物體內(nèi)半衰期[25]。圓二色譜研究表明,隨著kudinoside L濃度的增加,BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊含量增加;隨著kudinoside N濃度的增加,BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量則呈增加趨勢(shì)。說明由于藥物小分子各種作用力的作用,導(dǎo)致了BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本文結(jié)果可為深入研究苦丁茶冬青中五環(huán)三萜類化合物與BSA的作用機(jī)理、探索藥物分子構(gòu)效關(guān)系提供有價(jià)值的信息,為設(shè)計(jì)和篩選藥用效果更優(yōu)的苦丁茶皂苷類成分藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。