餌料中添加有益微生物對(duì)日本醫(yī)蛭生長(zhǎng)和成活的影響

劉飛 ，甘奇超 ，袁淵 ，王偉 ，安小平 ，沈財(cái)祥 ，付憲冬

（1.重慶多普泰制藥股份有限公司，重慶 萬(wàn)盛 400800；2.重慶銘實(shí)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司，重慶 萬(wàn)盛 400800）

水蛭作為一種傳統(tǒng)中藥，具有破血、通經(jīng)、逐瘀的功效，最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，近年來(lái)臨床研究表明，水蛭還具有抗血栓[2]、抗炎癥[3]、抗腫瘤[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]等作用。日本醫(yī)蛭（Hirudo nipponica Whitman,1886）屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)，醫(yī)蛭科，醫(yī)蛭屬[6]，別名水蛭，稻田醫(yī)蛭[7]。是目前《中國(guó)藥典》唯一收錄的以動(dòng)物血液為食物來(lái)源的水蛭藥材種類(lèi)，其體內(nèi)所含有的水蛭素，是一種極強(qiáng)的天然抗凝血酶類(lèi)物質(zhì)，其凝血酶的抑制作用是人工重組水蛭素的10倍，且沒(méi)有人工重組水蛭素的出血等副作用[8]。

由于日本醫(yī)蛭藥用價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的不斷提升，人類(lèi)對(duì)其胡亂抓捕現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，再加上環(huán)境惡化導(dǎo)致日本醫(yī)蛭野生數(shù)量逐步減少，因此日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖行業(yè)逐漸興起，且養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大。但在人工養(yǎng)殖過(guò)程中，由于餌料充足日本醫(yī)蛭一次進(jìn)食量過(guò)大，加上其喜攀附于箱壁，運(yùn)動(dòng)量很少，導(dǎo)致餌料長(zhǎng)期積于體內(nèi)，消化周期長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢。并且腸道中還容易滋生有害細(xì)菌，誘發(fā)腸炎等疾病，造成日本醫(yī)蛭大量吐血死亡。

有益微生物能很好的在動(dòng)物腸道內(nèi)定植并迅速生長(zhǎng)繁殖成一定數(shù)量，形成優(yōu)勢(shì)菌，維持腸道菌群的高水平穩(wěn)定，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道失調(diào)，預(yù)防腸道疾病的作用。唐寶英等研究證實(shí)利用丁酸梭菌能使草魚(yú)增重率大幅提高[9]，張彬等利用硝化細(xì)菌、光和細(xì)菌和EM菌凈化菲牛蛭養(yǎng)殖水體，對(duì)菲牛蛭存活率有明顯的提高作用[10]，但日本醫(yī)蛭餌料中添加有益微生物還未見(jiàn)報(bào)道。

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是一種產(chǎn)乳酸革蘭氏陽(yáng)性菌，其普遍存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)，具有改善動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝，提高免疫功能，增加攝食、促生長(zhǎng)等功能[11-13]，是我國(guó)農(nóng)業(yè)部在《飼料添加劑品種目錄2013》中明確規(guī)定可以直接飼喂動(dòng)物的飼料級(jí)微生物添加劑。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）是一種厭氧革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，人和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，增強(qiáng)免疫、促生長(zhǎng)等作用[14]。該研究在日本醫(yī)蛭的餌料中添加糞腸球菌和丁酸梭菌，從而檢驗(yàn)2種腸道有益菌對(duì)日本醫(yī)蛭成活率和增重率的影響，確定2種腸道有益菌的最佳投喂?jié)舛龋瑸槿毡踞t(yī)蛭及其他吸血類(lèi)水蛭的人工養(yǎng)殖提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

日本醫(yī)蛭采集于河北、山東地區(qū)，健康無(wú)病，每條平均體質(zhì)量0.25 g，采集后的日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖于120 cm×60 cm×50 cm聚乙烯塑料箱中，箱底設(shè)有40目防逃網(wǎng)，養(yǎng)殖用水來(lái)自地下井水，水溫20～24℃，溶氧為5.8～8.2 mg/L，pH 值為 7.1～7.3。

1.2 有益微生物的培養(yǎng)

兩種菌種均來(lái)自廣東鶴山市龍之品生物科技有限公司，糞腸球菌接種于胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基，37℃條件下進(jìn)行活化和擴(kuò)繁培養(yǎng)，丁酸梭菌接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)。將所得的兩種菌發(fā)酵液用生理鹽水稀釋?zhuān)M(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算總菌體數(shù)量。然后4 000 r/min離心15 min，棄去上清液，以無(wú)菌生理鹽水洗滌，再4 000 r/min離心15 min，棄去上清液，獲得沉淀菌體。然后用無(wú)菌生理鹽水稀釋到確定濃度（CFU/mL），得到已知濃度的糞腸球菌和丁酸梭菌菌懸液，混合菌利用該兩種菌等比例配比而成。

1.3 試驗(yàn)方法

用已知濃度的菌液再以新鮮豬血為基礎(chǔ)餌料配比成不同濃度的有益微生物作為該試驗(yàn)的考察因素（表1），以日本醫(yī)蛭的存活率、增重率做評(píng)價(jià)指標(biāo)，并參照0#對(duì)照組，優(yōu)選兩種有益菌與日本醫(yī)蛭食用餌料的最佳配比。

選取健康的日本醫(yī)蛭進(jìn)行分箱養(yǎng)殖，每箱4 000尾日本醫(yī)蛭，均重在0.25 g，并設(shè)3組試驗(yàn)平行。將新鮮豬血和已知濃度菌液灌制到豬小腸中進(jìn)行投喂，投喂飼料量按照每箱日本醫(yī)蛭5L進(jìn)行投喂。飼養(yǎng)周期為30d（2019年5月6日到2019年6月6日），投喂頻率為1次/7 d，共計(jì)4次。試驗(yàn)養(yǎng)殖過(guò)程中觀察日本醫(yī)蛭活動(dòng)狀態(tài)，保持室內(nèi)安靜，做好遮光措施，避免強(qiáng)光照射，每天沖洗養(yǎng)殖箱，及時(shí)挑出死亡水蛭，保持養(yǎng)殖箱的清潔。

1.4 樣品采集和數(shù)據(jù)分析

日本醫(yī)蛭放入養(yǎng)殖箱前，稱(chēng)量所有日本醫(yī)蛭總體質(zhì)量（精確到0.01 g），計(jì)算日本醫(yī)蛭個(gè)體平均質(zhì)量，并且還需稱(chēng)量每箱醫(yī)蛭的總體重量，稱(chēng)量前用濕潤(rùn)的紗布或綿柔紙巾除去醫(yī)蛭表面水分和贓物。試驗(yàn)開(kāi)始后，每次餌料投喂前后按試驗(yàn)分組分別統(tǒng)計(jì)日本醫(yī)蛭的總體質(zhì)量和箱內(nèi)醫(yī)蛭剩余條數(shù)，計(jì)算日本醫(yī)蛭的體重增重率和成活率。最后按照體質(zhì)量增重率和成活率確定糞腸球菌和丁酸梭菌的最佳添加濃度。

試驗(yàn)結(jié)果數(shù)值用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 17.0在a=0.05水平下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后組間兩兩比較顯著性差異。體質(zhì)量增重率和成活率見(jiàn)公式一、二。

公式一：體質(zhì)量增重率W（%）=（W2-W1）/W1×100%

公式二：成活率 S（%）=（S2-S1）/S1×100%

W1：每次投喂前日本醫(yī)蛭平均個(gè)體質(zhì)量（g）；W2：每次投喂7 d后日本醫(yī)蛭平均個(gè)體質(zhì)量（g）；S1：試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)日本醫(yī)蛭的尾數(shù)（尾）；S2：每次投喂7 d后日本醫(yī)蛭剩余尾數(shù)（尾）。

表1 微生物濃度水平表

2 結(jié)果

2.1 餌料中添加糞腸球菌和丁酸梭菌對(duì)日本醫(yī)蛭成活率的影響

由表2可知，餌料中添加糞腸球菌，各組在試驗(yàn)期間成活率有一定差異，試驗(yàn)3#組成活率最高，為95.60%±2.56%，其次是2#組，為94.80%±1.94%，成活率最低的是0#組，為90.21%±2.15%。由表3可知，餌料中添加丁酸梭菌，試驗(yàn)2#組成活率最高，為96.10%±1.08%，其次是3#組，為94.40%±2.45%。由表4可知，餌料中添加糞腸球菌與丁酸梭菌混合菌，試驗(yàn)2#組成活率最高，為99.50%±0.28%，其次是1#組，為97.30%±0.82%。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)3種添加方式日本醫(yī)蛭成活率最高組是餌料中添加糞腸球菌和丁酸梭菌混合菌，為99.50%±0.28%，單獨(dú)添加糞腸球菌和丁酸梭菌日本醫(yī)蛭的最高成活率分別是95.60%±2.56%與96.10%±1.08%，兩者沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P>0.05）。

表2 餌料中添加糞腸球菌日本醫(yī)蛭的成活率

表3 餌料中添加丁酸梭菌日本醫(yī)蛭的成活率

表4 餌料中添加糞腸球菌與丁酸梭菌混合菌日本醫(yī)蛭的成活率

2.2 餌料中添加糞腸球菌和丁酸梭菌對(duì)日本醫(yī)蛭體質(zhì)量增長(zhǎng)率的影響

由表5、表6、表7可知，第一次餌料投喂，試驗(yàn)各組日本醫(yī)蛭體質(zhì)量增長(zhǎng)率明顯高于后幾次餌料投喂，各組在試驗(yàn)期間也存在明顯差異，由表5可知，餌料中添加糞腸球菌，試驗(yàn)3#組體質(zhì)量總增長(zhǎng)率最高，為500.00%±8.62%，顯著高于0#、1#、2#、4#（P<0.05），其次是 2#組，為 428.41%±8.84%，最低的是0#組，為272.12%±9.22%。由表6可知，餌料中添加丁酸梭菌，試驗(yàn)3#組體質(zhì)量總增長(zhǎng)率最高，為508.65%±8.22%，顯著高于0#、1#、2#、4#（P<0.05），其次是4#組，為424.33%±9.98%。由表7可知，餌料中添加糞腸球菌與丁酸梭菌混合菌，試驗(yàn)2#組體質(zhì)量總增長(zhǎng)率最高，為 612.35%±5.88%，顯著高于 0#、1#、3#、4#（P<0.05），其次是1#組，為532.66%±6.52%。試驗(yàn)最終3種添加方式日本醫(yī)蛭體質(zhì)量總增重率最高是餌料中添加糞腸球菌和丁酸梭菌混合菌，為612.35%±5.88%，顯著高于其他兩種添加方式（P<0.05），餌料中單獨(dú)添加糞腸球菌和丁酸梭菌體質(zhì)量總增重率最高分別是500.00%±8.62%，508.65%±8.22%，兩者沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P>0.05）。

3 討論

隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，人工集約化程度不斷加深，養(yǎng)殖過(guò)程中疾病爆發(fā)也越來(lái)越頻繁，雖然抗生素和傳統(tǒng)化學(xué)藥物療效顯著，但多會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)殘留，給食品、藥品帶來(lái)安全隱患，長(zhǎng)期使用還導(dǎo)致耐藥菌滋生。微生態(tài)制劑不僅能夠抑制有害細(xì)菌，調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境，還能提高水產(chǎn)動(dòng)物的品質(zhì)和產(chǎn)量。據(jù)報(bào)道，納豆芽孢桿菌能顯著提高鯉魚(yú)腸道蛋白酶和肝胰臟蛋白酶的活性[15]，芽孢桿菌能顯著提高大菱鲆和斑節(jié)對(duì)蝦的成活率和增重率[16-17]，微生態(tài)制劑能顯著提高肉雞的平均體質(zhì)量和降低病死率[18]。但是微生態(tài)制劑在日本醫(yī)蛭的養(yǎng)殖中報(bào)道較少，該試驗(yàn)選取糞腸球菌和丁酸梭菌，從而找到能降低日本醫(yī)蛭死亡率和提高日本醫(yī)蛭產(chǎn)量的最佳配比濃度。

表5 餌料中添加糞腸球菌日本醫(yī)蛭的增重率

表6 餌料中添加丁酸梭菌日本醫(yī)蛭的增重率

表7 餌料中添加糞腸球菌與丁酸梭菌混合菌日本醫(yī)蛭的增重率

3種微生物添加方式的試驗(yàn)中，第一次餌料投喂后日本醫(yī)蛭體重增重率都要顯著高于后期餌料投喂后日本醫(yī)蛭的體重增重率，表明日本醫(yī)蛭在自然條件下基本是處于一個(gè)饑餓狀態(tài)，同時(shí)饑餓狀態(tài)時(shí)的攝食量比正常養(yǎng)殖狀態(tài)下的攝食量要高，這跟張濤[19]2017年的研究結(jié)果一致。從表2～表7的試驗(yàn)結(jié)果表明，添加微生物的試驗(yàn)組與0組比較，日本醫(yī)蛭的成活率與體質(zhì)量增重率都有所提高，可能原因有以下幾點(diǎn)：一是糞腸球菌和丁酸梭菌在日本醫(yī)蛭體內(nèi)能迅速繁殖成一定數(shù)量，形成優(yōu)勢(shì)菌，促進(jìn)乳酸菌等有益菌的繁殖，抑制大腸桿菌等致病菌的增殖，維持腸道菌群的高水平穩(wěn)定；二是糞腸球菌和丁酸梭菌能刺激日本醫(yī)蛭腸道黏膜免疫活性，提高日本醫(yī)蛭的免疫功能，增加了其防病、抗病能力；三是糞腸球菌和丁酸梭菌在日本醫(yī)蛭腸道內(nèi)能產(chǎn)生多種維生素、氨基酸和酶類(lèi)物質(zhì)，這不光給宿主提供了更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還有助于機(jī)體更好的對(duì)營(yíng)養(yǎng)消化吸收。

從試驗(yàn)結(jié)果分析，糞腸球菌和丁酸梭菌混合菌對(duì)日本醫(yī)蛭成活率、體質(zhì)量增重率的促進(jìn)作用都要優(yōu)于單獨(dú)添加糞腸球菌和丁酸梭菌，這與杜宣[13]2006年利用復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)鯉魚(yú)消化酶活力的影響結(jié)果一致，也是復(fù)合微生態(tài)制劑要優(yōu)于單一菌種的微生態(tài)制劑。主要原因可能是復(fù)合微生態(tài)制劑含有多種菌株，在日本醫(yī)蛭體內(nèi)產(chǎn)生的維生素和氨基酸含量相對(duì)較高，提供的營(yíng)養(yǎng)較為豐富，同時(shí)復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)日本醫(yī)蛭腸道內(nèi)的蛋白酶和消化酶活性的促進(jìn)作用優(yōu)于單一菌種的微生態(tài)制劑，提高了日本醫(yī)蛭對(duì)餌料的利用與轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)日本醫(yī)蛭快速生長(zhǎng)。

總之，在日本醫(yī)蛭的人工養(yǎng)殖過(guò)程中適當(dāng)?shù)募尤爰S腸球菌和丁酸梭菌，可以降低日本醫(yī)蛭的病死率，提高日本醫(yī)蛭的產(chǎn)量，該文的研究能為日本醫(yī)蛭的大規(guī)模人工養(yǎng)殖提供一定的科學(xué)依據(jù)。