不同產(chǎn)地雷公藤中4種有效成分的含量測定

張玉梅 曹佩雪 張仕林

摘要 [目的]建立同時測定雷公藤中4種有效成分含量的方法，并研究不同產(chǎn)地雷公藤中4種有效成分的含量差異。[方法]采用Thermo Hypersil GOLD Phenyl Dim（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱;以乙腈-0.1%磷酸-0.2%三乙胺溶液為流動相，梯度洗脫;檢測波長：0～65 min為225 nm，65 min后為210 nm;流速0.75 mL/min;柱溫25 ℃;進樣量10 μL。[結(jié)果] 4種有效成分均有較好的分離度，方法精密度和重復(fù)性RSD均小于3.7%，待測樣品于室溫下24 h內(nèi)能保持穩(wěn)定，4種有效成分均有良好的線性關(guān)系，加樣回收率分別為雷公藤甲素86.72%、雷公藤內(nèi)酯酮107.51%、雷公藤紅素76.94%、雷公藤酯甲84.38%。[結(jié)論]該方法精密度和重現(xiàn)性良好，可同時測定雷公藤中4種有效成分的含量，可為雷公藤的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 雷公藤;有效成分;HPLC;含量測定

Abstract [Objective]To establish a method for simultaneous determination of four effective ingredients of Tripterygium wilfordii，and to study the difference of these four effective constituents from different producing areas.[Method]Samples were analyzed on a Thermo Hypersil GOLD Phenyl Dim chromatographic column （ 250 mm × 4.6 mm，5 μm ）， and eluted with the mobile phase of acetonitrile - 0.1% phosphorus -0.2% triethylamine solution with a linear gradient mode， the detection wavelengths were set at 225 nm for 0-65 min and 210 nm for 65 min， the flow rate of the mobile phase was 0.75 mL/min with the column temperature of 25 ℃， and the determined volume was 10 μL.[Result]These four effective constituents were well separated， the RSD of precision and repeatability both less than 3.7%， and the samples remained stable for 24 hours at room temperature.Meanwhile these four effective constituents exhibited a good linearity， and the recoveries of triptolide， triptonide， celastrol and wilforlide was 86.72%， 107.51%， 76.94% and 84.38%，respectively.[Conclusion]The method is accurate and repeatable， and it can be used for the determination of the four components in Tripterygium wilfordii.

Key words Tripterygium wilfordii Hook.f.;Effective constituents;HPLC;Content determination

雷公藤藥材系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物的根，主產(chǎn)于浙江、湖南、江西、安徽、貴州等地[1]，具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[2]，臨床應(yīng)用廣泛。雷公藤藥材中主要活性成分為二萜內(nèi)酯類，生物堿類及三萜類化合物[3-4]，但其主要活性成分同時又是毒性成分，不良反應(yīng)時有報道[5-7]。目前，對于雷公藤藥材的評價多集中于對主要有效成分雷公藤甲素或雷公藤紅素的含量測定，但單一化學(xué)成分不能較全面反映藥材質(zhì)量，雖然梁健等[8]對雷公藤藥材進行了HPLC指紋圖譜的研究，但并未對藥材中各個有效成分進行準確的定量。因此，該試驗對雷公藤中4種有效成分同時進行測定，并對15批不同產(chǎn)地藥材中有效成分的含量進行比較。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器。Agilent 1260型高效液相色譜儀（包括DAD檢測器、四元低壓梯度泵、在線真空脫氣機，美國Agilent公司）;Chemstation工作站（美國Agilent公司）;NE-203型電子天平（梅特勒-托利儀器有限公司）;XBF-500型高速中藥粉碎機（吉首市中湘制藥機械廠）;2XZ-4C型真空泵（臨海市譚氏真空泵有限公司）;SB-2000型水浴鍋（上海市愛朗儀器有限公司）;DL/SB-5/25型低溫冷卻循環(huán)泵（鞏義市予化儀器有限責任公司）;SHB-III型循環(huán)水多用真空泵（北京市泰和格潤儀器有限公司）;SK5200B型超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.1.2 試劑。雷公藤甲素（批號GR-133-160613）、雷公藤內(nèi)酯酮（批號GR-134160613）對照品購自南京廣潤生物制品有限公司，純度≥98%;雷公藤紅素（批號A0106）、雷公藤酯甲（批號A0107）對照品購自中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%。乙腈、甲醇、磷酸、三乙胺均為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;水為娃哈哈純凈水;其他試劑為分析純，玻璃層析柱（內(nèi)徑1 cm），中性氧化鋁（100 ～ 200目）。

1.1.3 試材。15批雷公藤藥材來源見表1，其中S1 ～ S9購于貴陽太升中藥材市場，S10 ～ S15于不同地方采集，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為雷公藤屬植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）的根。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品溶液的配制。精密稱取適量對照品雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲，分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得各對照品儲備液。精密量取各對照品儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇并定容至刻度，混合，搖勻，精密量取1 mL混合液，稀釋成10 mL，制備成混合對照品溶液。

1.2.2 雷公藤藥材供試品溶液的配制[9-11]。S1 ～ S15雷公藤藥材干燥粉碎后過40目篩，精密稱取15 g，加入95%乙醇，其料液比為1∶3，75 ℃回流提取2次，每次4.5 h，過濾，合并濾液，濃縮至無乙醇味，干燥至恒重。精密稱取干燥后的殘渣0.5 g于錐形瓶中，加入乙酸乙酯30 mL，超聲處理30 min，過濾，用30 mL乙酸乙酯分次洗滌錐形瓶和漏斗，合并濾液及洗液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，殘渣用10 mL乙酸乙酯溶解，經(jīng)過中性氧化鋁柱（100 ～ 200目，3.5 g，內(nèi)經(jīng)1 cm，乙酸乙酯濕法裝柱），用35 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，回收溶劑。殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得各供試品溶液。

1.2.3 色譜條件。色譜柱：Thermo Hypersil GOLD Phenyl Dim（250 mm × 4.6 mm，5 μm）;流動相A：0.1% 磷酸溶液-0.2% 三乙胺溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫（0 ～10 min，20%～35% B;10～15 min，35%～40% B;15～35 min，40% B;35～50 min，40%～45% B;50～60 min，40%～45% B;60～75 min，65%～75% B）;檢測波長：0～65 min為225 nm，65 min時為210 nm;流速：0.75 mL/min;柱溫：25 ℃;進樣量：10 μL。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。分別吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，在“1.2.3”色譜條件下，注入液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.2.4.2 標準曲線的繪制。精密量取“1.2.1”項下4個對照品溶液，按“1.2.3”色譜條件進行分析，以峰面積為縱坐標、不同體積對照品的質(zhì)量為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸。

1.2.4.3 精密度試驗。取編號為S5的雷公藤供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定并記錄各成分峰面積。

1.2.4.4 重復(fù)性試驗。取編號為S5的雷公藤平行制備6份供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件進行測定，并記錄峰面積。

1.2.4.5 穩(wěn)定性試驗。取編號為S5的雷公藤供試品溶液，室溫下分別于0、2、4、8、12、24 h按“1.2.3”色譜條件進行測定，并記錄各成分峰面積。

1.2.4.6 加樣回收率試驗。取編號為S5的雷公藤15 g，按“1.2.2”方法處理，所得溶液中分別加入對照品溶液各1 mL，按“1.2.3”色譜條件進行測定，并記錄各成分峰面積。

1.2.5 樣品含量測定。分別取不同產(chǎn)地的雷公藤藥材/飲片S1 ～ S15，每個樣品平行取3份，按“1.2.2”方法制備各供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件進行測定，記錄各成分峰面積，分別計算樣品中4種有效成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。圖1表明，在“1.2.3”條件下，樣品譜圖中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲的保留時間分別為17、28、65、67 min左右，并且重復(fù)性相對較好。

2.1.2 標準曲線的繪制。按照“1.2.4.2”方法操作，以峰面積為縱坐標、不同體積對照品的質(zhì)量為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，結(jié)果見表2。由表2可知，雷公藤中4種有效成分的標準曲線線性關(guān)系良好，R2≥0.999。

2.1.3 精密度試驗。按照“1.2.4.3”方法操作，計算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲4種有效成分含量的RSD分別為0.941%、2.006%、3.559%、2.671%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗。按照“1.2.4.4”方法操作，計算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲4種有效成分含量的RSD分別為1.076%、1.921%、3.665%、2.501%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.4.5”方法操作，計算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲4種有效成分含量的RSD分別為1.927%、2.159%、4.626%、3.132%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.6 加樣回收率試驗。按照“1.2.4.6”方法操作，計算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲4種有效成分含量的平均加樣回收率分別為86.72%、107.51%、76.94%、84.38%。

2.2 樣品含量測定 按照“1.2.5”方法操作，由表3可知，相比雷公藤飲片（S1～S9），雷公藤藥材中4種有效成分的含量普遍較高，尤其以湖南產(chǎn)地（S13、S14）的更為明顯。

3 討論與結(jié)論

3.1 流動相的選擇 試驗中分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%冰乙酸溶液、乙腈-0.1% 磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液-0.2%三乙胺溶液作為流動相進行梯度洗脫，結(jié)果表明，相同條件下，流動相為甲醇-水時，4種有效成分的出峰時間相對較慢;流動相為甲醇-0.1% 冰乙酸溶液時，基線上浮，不平穩(wěn);流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液-0.2% 三乙胺溶液時比用乙腈-0.1%磷酸溶液時的色譜峰分離效果更好，分離度和峰形更好。因此該試驗以乙腈-0.1%磷酸溶液-0.2%三乙胺溶液作為流動相。

3.2 檢測波長的選擇 試驗中選取210、218、225、242、276 nm 5個檢測波長，結(jié)果表明，在276和242 nm時，4種有效成分的色譜峰吸收較弱;在210和225 nm時，4種有效成分的吸收都比較強，且在225 nm條件下的基線相對平穩(wěn)且峰形較好，由于雷公藤紅素和雷公藤酯甲在210 nm時的吸收最強，因此試驗中檢測波長選擇為0 ～ 65 min 225 nm，65 min之后210 nm。

3.3 其他條件的優(yōu)化 該試驗中還對流速及柱溫2種條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，當流速為0.75 mL/min、溫度為25 ℃時，色譜峰分離度及峰形較好，故試驗中選擇了該流速和柱溫條件。

3.4 結(jié)論 該研究采用HPLC法同時對雷公藤藥材中4種有效成分含量進行測定，方法精密度、重復(fù)性良好，可同時測定雷公藤藥材中4種有效成分的含量，可為該藥材的質(zhì)量控制提供新的科學(xué)依據(jù)。

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