新型冠狀病毒棘突蛋白免疫原性分析及其多肽疫苗設(shè)計研究

許志強，魯 陳，胡曉軍，郭 有，胡巧麗，朱 穎,4

(1.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210000；2.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院；3.贛州市疾病預防控制中心，江西 贛州 341000；4.南昌大學生命科學學院，江西 南昌 330031)

至2020年3月4日，我國被確診感染新型冠狀病毒肺炎患者超過8萬人，并導致超過3千名患者死亡，且確診和死亡人數(shù)仍在每日增加(http://www.nhc.gov.cn/)，對國民生活、經(jīng)濟秩序造成極其嚴重的影響。目前，國際病毒分類委員會已將這種新型冠狀病毒命名為“SARS-CoV-2”，而由此病毒感染的肺炎也被命名為“COVID-19”(Corona Virus Disease 2019)。

冠狀病毒是一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒。SARS-CoV-2屬于β-冠狀病毒，具有典型的冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)。棘突蛋白(spike protein, S)位于SARS-CoV-2病毒包膜表面，可與宿主細胞膜特定受體結(jié)合，在病毒侵入和感染細胞中具有至關(guān)重要的作用。盡管SARS-CoV-2的S蛋白在多種冠狀病毒中表現(xiàn)出高度的變異，但是它與引起嚴重急性呼吸道綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的SARS-CoV病毒表面的S蛋白具有較高的同源性。SARS-CoV-2與SARS-CoV的S蛋白在其受體結(jié)合域(receptor-binding domain, RBD)具有幾乎相同的三維空間結(jié)構(gòu)，表明SARS-CoV-2與SARS-CoV作用的受體相同，即都是通過S蛋白-血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)結(jié)合途徑感染支氣管上皮細胞和肺上皮細胞[1]。截至2020年3月5日，SARS-CoV-2感染病例仍在增加，因此，有效的疫苗研發(fā)至關(guān)重要。

目前，已有大量的藥物可作為SARS-CoV-2感染后的輔助治療，包括廣譜的病毒靶向藥物，宿主靶向藥物和中藥等[2-3]。然而，市場上還沒有特異性針對SARS-CoV-2的藥物或疫苗，一些新型藥物的研制也處于早期階段?；赟蛋白在SARS-CoV-2病毒感染中的關(guān)鍵作用，其有望成為治療藥物設(shè)計靶點。已發(fā)表的針對SARS-CoV S蛋白結(jié)構(gòu)的研究表明，其N末端區(qū)域(N terminal domain, NTD)，融合肽區(qū)域(fusion peptide, F)，七肽重復區(qū)(heptad region, HR)和中央螺旋區(qū)(central helix, CH)是激發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體(neutralizing antibody)的潛在靶標[4]。因此，對SARS-CoV-2 S蛋白結(jié)構(gòu)和表位的分析可在一定程度上為免疫原疫苗的研制提供依據(jù)。

本研究基于SARS-CoV S蛋白結(jié)構(gòu)和SARS-CoV-2的基因組序列，對其S蛋白的功能域、空間結(jié)構(gòu)進行分析，并通過DNAStar、ABCpred、Bepipred、ElliPro、DiscoTope和SEPPA對SARS-CoV-2的線性和構(gòu)象B細胞表位進行了綜合預測。在抗擊COVID-19的緊迫形勢下，本研究期望為新型疫苗的開發(fā)和研制節(jié)省時間和成本。

1 材料和方法

1.1序列檢索與SARS-CoV-2S蛋白的物理化學性質(zhì)分析從美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索SARS-CoV-2和SARS-CoV 兩種冠狀病毒S蛋白的氨基酸序列，在GenBank中的檢索號分別為QHD43416和P59594。利用Protparam對SARS-CoV-2 S 蛋白的分子量，氨基酸組成，親水性均值和不穩(wěn)定指數(shù)進行分析。

1.2SARS-CoV-2與SARS-CoVS蛋白的氨基酸序列比對和體系結(jié)構(gòu)分析我們通過Clustal序列比對工具將SARS-CoV-2與SARS-CoV的S蛋白進行氨基酸序列比對，明確兩種病毒中S蛋白的同源性，并根據(jù)已報道的SARS-CoV S蛋白結(jié)構(gòu)域[4]，進一步分析SARS-CoV-2 S蛋白的信號肽區(qū)域(signal peptite, SP)、N末端區(qū)域(N-terminal domain, NTD)、連接區(qū)域(linker or connect region, L or CR)、受體結(jié)合區(qū)域等結(jié)構(gòu)(receptor-binding domain, RBD)。此外，通過TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對S蛋白的跨膜區(qū)域進行了預測[5]。

1.3二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)建與分析根據(jù)SARS-CoV-2的氨基酸序列，利用SWISS-MODEL構(gòu)建了SARS-CoV-2 S蛋白的三級結(jié)構(gòu)[6]。在SIWSS-MODEL服務(wù)器(https://swissmodel.expasy.org/)中輸入SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列進行同源模擬，選擇具有最大序列一致性、最大序列覆蓋率、最高全局模型質(zhì)量評估(Global Model Quality Estimation, GMQE)得分進行進一步分析。使用pymol展示最終獲得的SARS-CoV-2的S蛋白模型[7]，并分析其中α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)。

1.4SARS-CoV-2線性B細胞表位分析B細胞表位是抗原蛋白中能被B細胞受體或隨后由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體所識別的特殊區(qū)域。一般來說，B細胞表位可分為兩種類型，即線性表位(linear epitope)和構(gòu)象表位(conformational epitope)。線性表位又稱連續(xù)性表位，是由抗原的連續(xù)性的氨基酸組成。對于SARS-CoV-2的S蛋白的線性表位，我們利用三種不同類型的免疫信息學工具：DNAStar protean、ABCpred、Bepipred，全面分析線性B細胞表位。在DNAStar中，選擇S蛋白氨基酸具有良好親水性、柔韌性、可及性和高抗原性的區(qū)域作為初步篩選結(jié)果。隨后使用ABCpred[8]和Bepipred 2.0[9]對S蛋白的線性表位進一步分析，分別從中選擇得分高于0.8和0.55結(jié)果。綜合上述三種工具所得結(jié)果，選擇由兩種工具以上篩選的相同序列作為最終的候選線性B細胞表位。

1.5SARS-CoV-2構(gòu)象B細胞表位分析不同于線性B細胞表位，構(gòu)象B細胞表位可由分布在三維結(jié)構(gòu)中位置臨近的非連續(xù)性的氨基酸組成。首先結(jié)合S蛋白三維結(jié)構(gòu)，使用ElliPro篩選最小分數(shù)為0.8和最大距離為5埃的構(gòu)象表位[10]。隨后，使用DiscoTope 1.1和SEPPA 3.0區(qū)分S蛋白氨基酸序列中的表位和非表位殘基[11-12]。綜合ElliPro、DiscoTope 2.0、SEPPA 3.0的篩選結(jié)果，確定最終的構(gòu)象B細胞表位。

2 結(jié) 果

2.1SARS-CoV-2S蛋白的序列檢索和物理化學性質(zhì)根據(jù)SARS-CoV-2 S蛋白的Genbank檢索號(QHD43416)獲取其氨基酸序列。通過Protparam分析，SARS-CoV-2的S蛋白包含1 273個氨基酸，分子量為141.18 kDa。其氨基酸中，110個帶負電荷(D+E)，103個帶正電荷(R+K)。理論等電點(pI)為6.24，表明它在天然條件下是帶負電荷的蛋白質(zhì)。其親水性均值和不穩(wěn)定指數(shù)分別為33.01和-0.079，表明S蛋白具有穩(wěn)定和親水性特性。

2.2序列對比和體系結(jié)構(gòu)分析通過Clustal軟件對SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白的氨基酸序列進行比對，它們的氨基酸一致性為76%，具有較高的同源性。 通過與SARS-CoV的序列相應(yīng)區(qū)域比較，在SARS-CoV-2的S蛋白可分為兩個部分：S1和S2。富含β折疊結(jié)構(gòu)的S1亞基主要由N末端區(qū)域(氨基酸殘基18-306)、受體結(jié)合區(qū)域(氨基酸殘基331-527)、兩個亞區(qū)域(氨基酸殘基528-589和590-676)組成。 S2亞基則主要含有α螺旋結(jié)構(gòu)，包括一個上游螺旋結(jié)構(gòu)(upstream helix, UH)位于747-783、一個螺旋融合區(qū)域(fusion region, F)位于816-827、七肽重復區(qū)(hepated region, HR)位于912-984、中央α螺旋區(qū)域(central helix)位于985-1 034。隨后緊接一個“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)(β-hairpin, βH)位于1 035-1 071和一個亞區(qū)域位于1 072-1 112。信號肽區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)則分別位于1-17、1 214-1 236和1 237-1 273(圖1)。

2.3SARS-CoV-2S蛋白的空間結(jié)構(gòu)和折疊特征在SWISS-MODEL中，與SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列一致性和覆蓋率最高的模板為SARS-CoV S蛋白(PDB號：6ACC)。通過模型構(gòu)建，SARS-CoV-2的S蛋白為同源三聚體結(jié)構(gòu)，其中一個單體的受體結(jié)合區(qū)存在兩種構(gòu)象，即“橫臥”和“立式”(圖2B～C)。S1亞基含有35個β-折疊和6個α-螺旋結(jié)構(gòu)，而S2亞基包含14個α-螺旋和7個β-折疊結(jié)構(gòu)，其中第39和40個β-折疊共同形成β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖2D)。

2.4線性B細胞表位分析鑒定抗原中的B細胞表位是表位疫苗設(shè)計的重要步驟。綜合親水性、柔韌性、表面可及性和抗原性在內(nèi)的序列特性，通過DNAStar protean得到40條多肽。ABCpred和Bepipred 2.0分別篩選出43條和35條符合條件的多肽。綜合三種工具的肽段結(jié)果，最終確定出31個線性的SARS-CoV-2 S蛋白表位，其首-尾殘基位置分別為：73-81、94-100、110-115、146-160、204-208、251-257、280-285、312-320、354-362、402-406、415-419、439-444、476-483、526-540、552-556、565-579、602-609、634-645、652-661、674-689、689-704、741-749、772-780、807-818、883-889、931-946、1 084-1 091、1 117-1 127、1 157-1 164、1 180 -1 186、1 191-1 196，每個表位對應(yīng)的氨基酸序列和在S蛋白空間結(jié)構(gòu)上的位置分別見表1和圖3A，其中7個線性表位B1-B7位于SARS-CoV-2 S蛋白的NTD區(qū)域(氨基酸殘基18-306)，5個線性表位B9-B13位于RBD區(qū)域(氨基酸殘基331-527)。

2.5構(gòu)象B細胞表位分析對SARS-CoV-2 S蛋白的構(gòu)象表位分析中，EliiPro共得出14條分值高于0.8且最大距離不超過5埃的表位。此外，通過DiscoTope 1.1和SEPPA 3.0分別鑒定出184和235個表位殘基。整合這三種方法，共獲得9條構(gòu)象B細胞表位：72-75、(146-147)-(149-155)、246-257、(404-409)-(413-414)、443-448、458-463、474-481、498-506、556-571，相應(yīng)的氨基酸序列見表2，其中3條表位CB1-CB3位于S蛋白NTD區(qū)域，5條表位C4-C8位于RBD區(qū)域(圖3B)。

圖1 SARS-CoV-2與SARS-CoV S蛋白的氨基酸序列比對結(jié)果

SP: 信號肽；NTD：N末端區(qū)域；L：連接區(qū)域；RBD：受體結(jié)合區(qū)域；SD1：亞區(qū)1；SD2：亞區(qū)2；upstream helix：向上螺旋結(jié)構(gòu)；FP：融合肽；CR：連接區(qū)域；HR：七肽重復區(qū)；central helix：中央螺旋結(jié)構(gòu)；β-hairpin：β發(fā)卡結(jié)構(gòu)；SD3：亞區(qū)3；α1-α15：α螺旋結(jié)構(gòu)；β1-β42：β折疊結(jié)構(gòu)。

圖2 SARS-CoV-2 S蛋白的空間結(jié)構(gòu)

A.不同體系結(jié)構(gòu)的平面分布圖示?？s略詞釋義見圖1。B～C.S蛋白的三聚體結(jié)構(gòu)和兩種構(gòu)象的蛋白結(jié)構(gòu)。lying RBD：“臥式”受體結(jié)合區(qū)；standing RBD：“立式”受體結(jié)合區(qū)。D.S蛋白不同體系結(jié)構(gòu)的空間位置。cartoon：以二級結(jié)構(gòu)展示；surface：以表面形式展示。

表1 線性B細胞表位篩選結(jié)果

圖3 B細胞表位在SARS-CoV-2 S蛋白空間結(jié)構(gòu)上的位置

A.線性B細胞表位在S蛋白結(jié)構(gòu)上位置。B1-B31：31個不同的B細胞表位。B.構(gòu)象B細胞表位在S蛋白結(jié)構(gòu)上的位置。CB1-CB9：9個不同的構(gòu)象B表位。

表2 構(gòu)象B細胞表位篩選結(jié)果

3 討 論

自2019年12月至今，新型冠狀病毒在國內(nèi)已引起超過8萬人感染并導致3千名以上患者死亡，對公眾健康造成極其嚴重的危害。目前，2019新型冠狀病毒的基因組信息已經(jīng)明確，與引起2003年嚴重呼吸綜合征的SARS冠狀病毒有非常高的同源性，并且在感染模式上也具有相似性。由于S蛋白在新型冠狀病毒傳播過程中起著至關(guān)重要作用，因此也是誘導體內(nèi)中和抗體產(chǎn)生的首要靶點。鑒于疫情防控的嚴峻形勢，迫切地需要明確SARS-CoV-2 S蛋白的結(jié)構(gòu)特征和B細胞表位，以至于能夠快速地研制免疫原疫苗和中和性抗體。

我們通過與SARS-CoV中的S蛋白進行氨基酸序列和體系結(jié)構(gòu)的比較，發(fā)現(xiàn)雖然SARS-CoV-2的S蛋白與SARS-CoV在總體序列上具有高達76%的序列一致性，但在S蛋白的S1亞基中兩者序列差異較大，并存在較多的缺口(gap)，序列一致性為64%。S1亞基含有NTD和與ACE2受體結(jié)合的RBD，表明S1亞基是SARS-CoV-2特異性疫苗研制的重要區(qū)域。相較于S1亞基，SARS-CoV-2與SARS-CoV S蛋白的S2亞基的序列高度相似，氨基酸一致性達到90%。雖然CHAN等比較了SARS-CoV-2和SARS-CoV基因組的相似性并且也針對S蛋白進行了序列比對，但是他們主要針對進化層面進行分析，對于SARS-CoV-2 S蛋白也僅明確了S1、S2、SP、NTD和RBD區(qū)域[13]。而先前針對SARS-CoV S蛋白的研究顯示S2亞基含有融合肽區(qū)域、七肽重復區(qū)和中央螺旋結(jié)構(gòu)，均為誘使廣譜中和抗體(broadly neutralizing antibodies)產(chǎn)生的重要位點[4]。因此，本研究還根據(jù)SARS-CoV的研究結(jié)果，同源比較分析得到其他多種功能區(qū)所在的位點。

隨后，我們通過同源模擬成功構(gòu)建了S蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。與SARS-CoV相同，SARS-CoV-2的S蛋白也是一個同源三聚體，并且具有兩種構(gòu)象：其一是“臥式”，三個RBD全部都是隱蔽構(gòu)象，由于位阻效應(yīng)不易與ACE2受體結(jié)合；其二是“立式”，三聚體中的一個RBD轉(zhuǎn)變?yōu)榱⑹綐?gòu)象，是結(jié)合至ACE2受體的必要條件[14]。根據(jù)SARS-CoV-2的S蛋白結(jié)構(gòu)模型，我們對其螺旋結(jié)構(gòu)和折疊特征進行了分析。S1亞基主要為β-折疊結(jié)構(gòu)而S2亞基主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)，這兩種結(jié)構(gòu)通常含有較高的化學鍵能量，不利于表位的形成。Wrapp等使用冷凍電鏡對SARS-CoV-2 S蛋白的27-1 146位氨基酸之間的結(jié)構(gòu)的實際測定結(jié)果(PDB ID：6VSB)更是進一步證實了上述結(jié)構(gòu)特征[15]。我們通過同源模擬所得到的S蛋白的結(jié)構(gòu)與電鏡實測結(jié)構(gòu)具有較高的一致性，通過均方根偏差計算(RMSD)，兩種方法所得S蛋白的“立式”構(gòu)象的RMSD值為1.365 ?(750個原子)，“臥式”構(gòu)象為1.494 ?(788個原子)。兩者結(jié)構(gòu)模型之間的差異主要在兩個方面：(1)兩種模型S蛋白RBD區(qū)域所旋轉(zhuǎn)的角度不同引起，先前對SARS病毒S蛋白的結(jié)構(gòu)研究中也表明RBD區(qū)域存在多種旋轉(zhuǎn)角度[14]；(2)雖然冷凍電鏡得到的SARS-CoV-2 S蛋白的實測結(jié)構(gòu)，但作者表示其中缺少了一些柔性卷曲結(jié)構(gòu)[15]。由于B細胞表位常處于蛋白的無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角部分，明確完整的S蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)對表位疫苗的研制尤為必要。

對于抗原B細胞表位的預測一般都基于氨基酸序列的物理化學特性，但僅適于線性B表位的分析。然而，構(gòu)象表位在機體免疫反應(yīng)過程中同樣重要。因此，本研究中不僅對SARS-CoV-2的線性B細胞表位進行了全面分析，還基于“立式”構(gòu)象的S蛋白結(jié)構(gòu)對構(gòu)象表位進行了綜合預測。利用DNAStar、ABCpred、BepiPred三種工具共得到31條線性B細胞表位，分布于S蛋白各處，包括NTD、RBD、S2亞基。除B2以外，其余30條表位均位于S蛋白表面和無規(guī)則卷曲處。在構(gòu)象表位的分析中，結(jié)合ElliPro得到的表位序列、DiscoTope和SEPPA所得陽性氨基酸殘基，綜合出9條構(gòu)象表位，主要分布于S1的NTD和RBD，并且和線性B細胞表位具有部分重合，如B1與CB1、B4與CB2、B6與CB3、B13與CB7等。綜合先前已報道對SARS-CoV S蛋白的B表位研究結(jié)果，其310-535、604-625、1 023-1 189均為驗證后的表位區(qū)域[16-18]，其中471-503、604-625、1 164-1 191在恒河猴中誘導產(chǎn)生的抗體可有效阻止SARS-CoV的感染[17]。這些位點在SARS-CoV-2 S蛋白中相應(yīng)的位置為323-549、618-639、1 041-1 207，通過對表位的進一步篩選，位于這些區(qū)域的線性表位共有11條(B9-B14和B27-B31)、構(gòu)象表位共有5條(CB4-CB8)，均為潛在的疫苗研發(fā)候選表位。在這16條表位中，B9-B13、CB4-CB8均位于SARS-CoV-2 S蛋白與人ACE2受體結(jié)合的RBD區(qū)域，針對此10條表位疫苗產(chǎn)生的抗體在理論上能直接干擾S蛋白與人ACE2的結(jié)合。雖然BARUAH等也對SARS-CoV-2 S蛋白的B細胞表位進行了分析，但是缺少全面性和綜合性。在線性表位篩選中沒有考慮氨基酸自身的物理化學特性，在構(gòu)象表位中也僅依靠ElliPro單一工具所得結(jié)果，最終只獲得了3條線性和5條構(gòu)象B細胞表位[19]。較少表位結(jié)果既喪失了靈敏性也缺失準確性，不利于后續(xù)疫苗的研究。本研究不僅綜合了多種工具在多種S蛋白的特性下對表位進行了綜合分析，而且根據(jù)先前針對SARS S蛋白B表位已有的研究和SARS-CoV-2的功能區(qū)，對所得表位結(jié)果進行了進一步的篩選，旨在加速研發(fā)針對SARS-CoV-2的中和抗體。

綜上所述，我們不僅對SARS-CoV-2 S蛋白的結(jié)構(gòu)域進行了分析，還對潛在表位進行了綜合篩選，共獲得40條B細胞表位。綜合SARS-CoV的表位研究結(jié)果，我們從中篩選出16條可作為潛在的新型冠狀病毒肺炎免疫原疫苗研發(fā)的候選表位，且其中的10條位于SARS-CoV-2 S蛋白RBD區(qū)，是較為有進一步研究價值的肽段。這些結(jié)果不僅能減少疫情防控所需疫苗的研制時間，更能進一步節(jié)約其研發(fā)成本。