正元膠囊防治肺腺癌A549移植瘤裸鼠化療相關(guān)性疲勞的療效及機(jī)制研究

關(guān)潔珊， 羅智杰， 肖志偉， 林麗珠

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東廣州 510405）

肺癌是世界上最常見(jiàn)的癌癥之一，其中男性發(fā)病率為33.86/10萬(wàn)，女性為13.5/10萬(wàn)[1]。肺癌的死亡率極高，占所有癌癥患者死亡人數(shù)的18.2%[2]。肺癌以非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）多見(jiàn)，其中腺癌是非小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)的亞型，約占肺癌的40%[3]。手術(shù)治療是可切除的Ⅰ、Ⅱ期和ⅢA期的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的主要治療方式，這些患者在術(shù)后接受輔助化療可顯著提高其生存率[4-7]。但對(duì)于在沒(méi)有驅(qū)動(dòng)基因突變的ⅢB-Ⅳ期NSCLC 患者，化療往往作為治療方案的首選[8]。然而，80% ～90%的接受化療的患者會(huì)出現(xiàn)化療相關(guān)性疲勞（CRF）[9]，部分患者的疲勞癥狀甚至在治療結(jié)束后仍持續(xù)數(shù)年之久[10-11]。CRF 患者的身體機(jī)能顯著降低，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，目前仍缺乏有效的干預(yù)手段。

正元膠囊是防治癌因性疲勞的中成藥。本研究選擇肺腺癌A549 細(xì)胞移植瘤裸鼠為對(duì)象，觀察正元膠囊防治肺腺癌A549細(xì)胞移植瘤裸鼠CRF 的療效，并初步探討其作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用正元膠囊防治CRF 提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物7 周齡雄性BALB/c-nu 裸鼠80 只，體質(zhì)量18 ～20 g，購(gòu)于華阜康生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。飼養(yǎng)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1. 2 細(xì)胞、藥物與試劑人肺腺癌A549 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。正元膠囊（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)廣州海瑞藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20148001）；順鉑（南京制藥廠有限公司， 國(guó)藥準(zhǔn)字H20030675）。RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、青/鏈霉素、胰蛋白酶、PBS 緩沖液、肝糖原試劑盒（堿溶液、1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液、顯色劑）（美國(guó)Gibco 公司）；促紅細(xì)胞生成素（EPO）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢華美生物有限公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）及白細(xì)胞介素3（IL-3）檢測(cè)用細(xì)胞因子抗體芯片（美國(guó)Luminex公司）。

1.3 儀器負(fù)重用鉛墜（自制）；恒溫游泳箱（高29 cm，直徑19 cm）（上海移動(dòng)數(shù)據(jù)信息技術(shù)公司）；ML204 型號(hào)電子天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]；小動(dòng)物行為記錄分析系統(tǒng)（上海楚才電子科技有限公司）；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱[50 cm×50 cm×40 cm（長(zhǎng)×寬×高），實(shí)驗(yàn)箱為正方形，上面敞開(kāi)，內(nèi)部墻壁涂黑]（廣州飛迪生物科技有限公司）；懸尾測(cè)試儀（廣州飛迪生物科技有限公司）；BC6800-A 自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Luminex200多功能流式點(diǎn)陣儀（美國(guó)Luminex公司）。

1. 4 肺腺癌A549 移植瘤裸鼠模型的建立與分組隨機(jī)抽取20 只裸鼠作為正常組，不接種A549 細(xì)胞，其他60只裸鼠復(fù)制肺腺癌移植瘤模型。方法：將A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)（37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2），傳代培養(yǎng)，大量擴(kuò)增。待傳代培養(yǎng)至足夠數(shù)量后，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min后去上清，用新鮮配制的稀釋液（由1∶1的無(wú)血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液與BD Matrigel TM Basement Membrane matrix 配制）制成5 ×107個(gè)/mL細(xì)胞懸液。抽取細(xì)胞懸液注入裸鼠右側(cè)腋窩皮下處，每只裸鼠接種0.2 mL。接種完后，當(dāng)瘤塊長(zhǎng)到50 ～100 mm3時(shí)（接種后第7 天），隨機(jī)分為3 組，模型組、順鉑組、聯(lián)合治療組，每組20 只。上述4 組每組20 只裸鼠再分為兩大組（1 組、2組）。

1.5 給藥于A549 細(xì)胞接種第7 天分組后開(kāi)始每天9∶00 給藥。順鉑組給予順鉑5 mg/kg 腹腔注射，每3天注射1次。聯(lián)合治療組同時(shí)給予順鉑與正元膠囊治療，順鉑的給藥方法及劑量同順鉑組，正元膠囊的給藥劑量為1.8 g/kg（相當(dāng)于成年人等效劑量的2倍），每天灌胃1次。正常組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。連續(xù)治療21 d。本課題組前期研究結(jié)果顯示，2 倍的藥物等效劑量，即1.8 g/kg，療效較好，故本研究選擇此劑量。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1. 6. 1 正元膠囊對(duì)荷瘤裸鼠力竭游泳時(shí)間的影響 取各組第1組裸鼠。具體方法：干預(yù)前、干預(yù)后第18天，用7%體質(zhì)量的鉛墜系于裸鼠尾部，將裸鼠放入水溫為（25±1）℃的游泳箱（高29 cm，直徑19 cm）中進(jìn)行力竭游泳實(shí)驗(yàn)，并記錄力竭游泳時(shí)間。力竭游泳標(biāo)準(zhǔn)為裸鼠鼻尖沉入水下10 s。每次實(shí)驗(yàn)后，立即將裸鼠用干毛巾擦干。

1.6.2 正元膠囊對(duì)荷瘤裸鼠行為學(xué)的影響

1.6.2.1 懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST）[12]取各組第1 組裸鼠。在干預(yù)后的第19 天，將裸鼠尾（距尾尖2 cm 處）用膠布粘在懸尾測(cè)試儀上，裸鼠頭部距測(cè)試儀底部5 cm，記錄6 min 內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。

1.6.2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）[13]取各組第1 組裸鼠。在干預(yù)后的第20 天對(duì)裸鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。裸鼠提前運(yùn)送到保持安靜通風(fēng)、室內(nèi)暗光的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室，使裸鼠適應(yīng)環(huán)境，減少緊張。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先確認(rèn)曠場(chǎng)裝置清潔、無(wú)味道（注意徹底清除上次實(shí)驗(yàn)遺留的裸鼠糞便、尿液）。將裸鼠從籠內(nèi)取出（裸鼠背向?qū)嶒?yàn)者），握住裸鼠尾巴近端1/2 ～1/3處，輕輕將裸鼠放入曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱的正中央格。迅速、輕柔打開(kāi)錄像記錄系統(tǒng)，記錄裸鼠5 min內(nèi)在曠場(chǎng)內(nèi)的活動(dòng)。監(jiān)測(cè)裸鼠在實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)的總運(yùn)動(dòng)距離、平均速度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將裸鼠放回籠內(nèi)，并以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇噴灑實(shí)驗(yàn)箱底部并用潔凈紗布抹干清除糞便。

1.6.3 正元膠囊對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響 剝離瘤塊，稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-干預(yù)組平均瘤質(zhì)量）/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.6.4 正元膠囊對(duì)荷瘤裸鼠肝糖原的影響 取各組第1組裸鼠。處死后，取肝臟，置于生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟100 mg。嚴(yán)格按照肝糖原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。

1.6.5 正元膠囊對(duì)荷瘤裸鼠外周血象及骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

4)便捷性原則：在綠道系統(tǒng)與外界的聯(lián)系上，將公共交通系統(tǒng)與慢行道系統(tǒng)無(wú)縫連接，方便游客與市民進(jìn)入綠道網(wǎng)絡(luò)中，將公共服務(wù)設(shè)施適當(dāng)分布在各個(gè)大小節(jié)點(diǎn)，以便游客隨取隨用。

1.6.5.1 外周血象 取各組第2 組裸鼠。在末次給藥1 h 后，摘眼球取血1 mL 置于干凈的含有EDTA K2 0.2 mg 的EP 管 中，BC6800-A 自 動(dòng) 血 球計(jì)數(shù)儀檢測(cè)紅細(xì)胞（RBC）計(jì)數(shù)、白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）計(jì)數(shù)。

1.6.5.2 骨髓有核細(xì)胞（BMNCs）計(jì)數(shù) 取各組第2組裸鼠。處死后，立即取裸鼠左側(cè)股骨，剔去肌肉和結(jié)締組織，剪去股骨兩端，用消毒過(guò)的注射器以及6 號(hào)針頭吸取2 mL PBS 緩沖液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集全部骨髓，充分混勻，并用槍頭反復(fù)吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分分散，取10 μL滴在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定BMNCs數(shù)。

1.6.5.3 骨髓細(xì)胞涂片 取各組第2 組裸鼠。處死后，取裸鼠右側(cè)股骨，剔去肌肉和結(jié)締組織，剪去股骨兩端，用消毒過(guò)的注射器以及6號(hào)針頭推出裸鼠骨髓，滴在提前準(zhǔn)備好的滴有EDTA抗凝劑的載玻片上，充分混勻，行骨髓涂片，并用瑞氏姬姆薩染色法，風(fēng)干后在顯微鏡下觀察。

1. 6. 6 血清中TNF-α、IL-6、G-CSF、IL-3 及EPO含量的測(cè)定 取各組第1組裸鼠處死后取得的血清，室溫下解凍。采用高通量液相蛋白芯片檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6、G-CSF 及IL-3 的含量；采用ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中EPO 的含量。以上實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1. 7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究檢測(cè)的指標(biāo)均為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正元膠囊延長(zhǎng)荷瘤裸鼠力竭游泳時(shí)間干預(yù)前，各組裸鼠力竭游泳時(shí)間均衡（F = 1.051，P ＞0.05）。圖1 結(jié)果顯示：干預(yù)后第18 天，各組力竭游泳時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 73.382，P ＜0.001）；除正常組外，模型組、順鉑組、聯(lián)合治療組的力竭游泳時(shí)間較干預(yù)前均明顯縮短（P ＜0.001，P ＜0.001，P ＜0.05）。進(jìn)一步利用多重比較判斷各組力竭游泳時(shí)間的具體差異結(jié)果顯示，模型組力竭游泳時(shí)間較正常組縮短（P ＜0.001）；順鉑組力竭游泳時(shí)間與模型組相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；聯(lián)合治療組的力竭游泳時(shí)間較順鉑組及模型組顯著延長(zhǎng)（P ＜0.001）。

2.2 正元膠囊改善荷瘤裸鼠行為學(xué)圖2-A 結(jié)果顯示，正常組、模型組、順鉑組、聯(lián)合治療組的懸尾不動(dòng)時(shí)間分別是（67.89 ± 20.06）s、（89.78 ±19.13）s、（77.90 ± 23.11）s、（49.60 ± 22.60）s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=6.060，P ＜0.01）。進(jìn)一步多重比較結(jié)果顯示，模型組懸尾不動(dòng)時(shí)間較正常組延長(zhǎng)（P ＜0.05），模型組和順鉑組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），而聯(lián)合治療組懸尾不動(dòng)時(shí)間較模型組及順鉑組顯著縮短（P ＜0.001，P ＜0.01）。

圖1 干預(yù)后第18天各組裸鼠的力竭游泳時(shí)間比較（±s，N/只=10，10，10，10）Figure 1 Comparison of the exhaustive swimming in various groups on day 18 after treatment（±s，N=10，10，10，10）

圖2-B、-C 結(jié)果顯示，在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，正常組、模型組、順鉑組、聯(lián)合治療組的總運(yùn)動(dòng)距離分 別 是（2 508.46 ± 392.13）mm、（2 003.82 ±551.78）mm、（1 466.31 ± 308.41）mm、（1 871.53 ±403.58）mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 9.327，P ＜0.001）。進(jìn)一步多重比較結(jié)果顯示，模型組總運(yùn)動(dòng)距離較正常組縮短（P ＜0.05），順鉑組總運(yùn)動(dòng)距離較模型組縮短（P ＜0.05），聯(lián)合治療組總運(yùn)動(dòng)距離較順鉑組延長(zhǎng)（P ＜0.05），但與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。正常組、模型組、順鉑組、聯(lián)合治療組的平均運(yùn)動(dòng)速度分別是（8.36 ±1.31）mm/s、（6.68±1.84）mm/s、（4.89±1.03）mm/s、（6.24 ± 1.35）mm/s，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =9.319，P ＜0.001），其多重比較結(jié)果與總運(yùn)動(dòng)距離組間的差異具有一致性。

2.3 正元膠囊對(duì)荷瘤裸鼠瘤體質(zhì)量、抑瘤率的影響圖3 結(jié)果顯示：干預(yù)后第21 天，順鉑組、聯(lián)合治療組的瘤體質(zhì)量均較模型組減輕（P ＜0.05），且順鉑組與聯(lián)合治療組之間無(wú)明顯差異。聯(lián)合治療組抑瘤率較順鉑組稍有升高。說(shuō)明正元膠囊對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)無(wú)影響。

圖2 各組裸鼠的行為學(xué)比較(±s)Figure 2 Comparison of the behaviors of mice in various groups(±s)

圖3 干預(yù)后第21天各組荷瘤裸鼠瘤體質(zhì)量、抑瘤率比較(±s)Figure 3 Comparison of the tumor mass and tumor inhibition rate in various groups on day 21 after treatment(±s)

2.4 正元膠囊增加荷瘤裸鼠肝糖原儲(chǔ)備圖4 結(jié)果顯示：正常組、模型組、順鉑組、聯(lián)合治療組的肝糖原水平分別為（8.97 ± 2.14）mg/g、（7.49 ±3.52）mg/g、（4.67 ± 1.56）mg/g、（11.82 ± 1.92）mg/g，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 8.878，P ＜0.001）。多重比較結(jié)果顯示，順鉑組肝糖原水平較正常組下降（P ＜0.01），與模型組相近（P ＞0.05）；聯(lián)合治療組肝糖原水平較正常組、模型組及順鉑組均增加，但與模型組、順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01，P ＜0.001）。

圖4 各組裸鼠肝糖原水平比較（±s，N/只=7，7，7，7）Figure 4 Comparison of the hepatic glycogen level in various groups（±s，N=7，7，7，7）

圖5 治療第21天各組裸鼠外周血象比較（±s，N/只=9，9，8，8）Figure 5 Comparison of peripheral hemogram in various groups on day 21 after treatment（±s，N=9，9，8，8）

2.5 正元膠囊改善荷瘤裸鼠外周血象圖5 結(jié)果顯示：各組裸鼠WBC、RBC、HGB 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.001）。多重比較結(jié)果顯示，順鉑組的WBC、RBC 及HGB 較正常組、模型組下降（P ＜0.001）；聯(lián)合治療組的WBC、RBC 及HGB較正常組、模型組下降，較順鉑組升高（P ＜0.05或P ＜0.001）；4組的PLT水平相似（P ＞0.05）。

2.6 正元膠囊對(duì)順鉑所致的骨髓抑制有緩解作用裸鼠骨髓細(xì)胞涂片可見(jiàn)：正常組骨髓增生明顯活躍，易見(jiàn)造血島，粒、紅、巨三細(xì)胞系比例、形態(tài)大致正常。模型組骨髓增生減低，偶見(jiàn)造血島，紅系細(xì)胞比例相對(duì)減低，粒系、淋巴細(xì)胞比例相對(duì)增高，部分細(xì)胞呈溶解狀。順鉑組骨髓增生減低至重度減低，偶見(jiàn)少量造血島，以淋巴細(xì)胞及粒細(xì)胞為主，有核紅細(xì)胞比例減低，部分細(xì)胞胞漿胞核結(jié)構(gòu)泡壞。聯(lián)合治療組骨髓增生活躍，可見(jiàn)造血島，粒、紅、巨三系細(xì)胞比例、形態(tài)大致正常。

正常組、模型組、順鉑組、聯(lián)合治療組BMNCs 計(jì) 數(shù) 分 別 是（1.64 ± 0.38）× 107/femur、（1.35 ± 0.38）× 107/femur、（0.77 ± 0.24）× 107/femur、（1.51±0.30）×107/femur，4 組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=10.839，P ＜0.001）。順鉑組BMNCs較正常組和模型組下降（P ＜0.001，P ＜0.01），而聯(lián)合治療組BMNCs 計(jì)數(shù)較順鉑組顯著升高（P ＜0.001）。具體如圖6所示。

圖6 治療第21天各組裸鼠BMNCs計(jì)數(shù)比較（±s，N/只=8，8，8，8）Figure 6 Comparison of the bone marrow nucleated cell count in various groups on day 21 after treatment（±s，N=8，8，8，8）

2.7 正元膠囊對(duì)裸鼠外周血細(xì)胞因子有調(diào)節(jié)作用各組的TNF-α、IL-6 及G-CSF 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01或P ＜0.001）。

圖7-A 結(jié)果顯示：模型組的TNF-α 水平較正常組和順鉑組升高（P ＜0.001，P ＜0.05）；聯(lián)合治療組TNF-α 水平較模型組和順鉑組下降（均P ＜0.05）。圖7-B 結(jié)果顯示：模型組IL-6 水平較正常組升高（P ＜0.001）；順鉑組IL-6 水平較模型組下降（P ＜0.001），但較正常組顯著升高（P ＜0.001）；聯(lián)合治療組IL-6 水平較模型組、順鉑組顯著下降（均P ＜0.001），與正常組相近（P ＞0.05）。圖7-C結(jié)果顯示：模型組G-CSF 水平較正常組和順鉑組升高（P ＜0.05）；聯(lián)合治療組G-CSF水平較正常組和順鉑組升高（均P ＜0.05）。圖7-D結(jié)果顯示：聯(lián)合治療組EPO 水平較模型組、順鉑組均升高，但與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。圖7-E結(jié)果顯示：聯(lián)合治療組IL-3水平較正常組、模型組、順鉑組升高（均P ＜0.05）。

圖7 治療第21天各組裸鼠外周血細(xì)胞因子水平比較(±s)Figure 7 Comparison of the peripheral cytokine levels in various groups on day 21 after treatment(±s)

3 討論

正元膠囊是由淫羊藿、黃芪、生曬參、白術(shù)、龜板、鱉甲、女貞子、陳皮等組成。方中淫羊藿性溫，味辛、甘，歸肝、腎經(jīng)，溫腎壯陽(yáng)、補(bǔ)益肝腎，為君藥。黃芪補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)舉陷，補(bǔ)肺益衛(wèi)；生曬參，即人參洗凈后干燥者，大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津安神；白術(shù)補(bǔ)氣健脾、燥濕利水；三者合用同為臣藥，可補(bǔ)脾益肺、補(bǔ)氣生血、健脾化痰，使氣血得生，痰濁得化。佐以龜板滋陰潛陽(yáng)、益腎健骨、補(bǔ)血養(yǎng)心；鱉甲滋陰潛陽(yáng)、軟堅(jiān)散結(jié)；女貞子補(bǔ)肝腎陰、烏須明目；三者合而為佐藥，可補(bǔ)益肝腎之陰，滋陰養(yǎng)血，又能軟堅(jiān)散結(jié)，且藥性寒涼，使全方溫而不燥。再以陳皮為使藥，陳皮，性溫，味辛、苦，歸脾、肺經(jīng)，理氣和中兼以化痰散結(jié)，使全方補(bǔ)中有散，補(bǔ)而不滯，不會(huì)過(guò)于滋膩。以上八藥合用溫而不燥、滋而不膩，共奏益氣健脾、補(bǔ)腎填精，兼能理氣化痰、軟堅(jiān)散結(jié)之功，可用于癌因性疲勞的治療。

癌因性疲勞包括軀體性疲勞和精神性疲勞[14]。軀體性疲勞主要表現(xiàn)為活動(dòng)能力的下降，在動(dòng)物模型中經(jīng)常使用力竭游泳實(shí)驗(yàn)來(lái)衡量[15-16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)力竭游泳時(shí)間在順鉑組明顯較正常組縮短，聯(lián)合治療組較順鉑組明顯延長(zhǎng)，提示正元膠囊可以減輕化療引起的軀體性疲勞。精神性疲勞在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通常用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)如懸尾實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)去衡量[17]。本研究同時(shí)采用了懸尾實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)以評(píng)估裸鼠的精神疲勞。我們發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，順鉑組的懸尾不動(dòng)時(shí)間稍有延長(zhǎng)，在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中總運(yùn)動(dòng)距離明顯縮短，平均運(yùn)動(dòng)速度明顯降低，表明化療導(dǎo)致了裸鼠的精神性疲勞。聯(lián)合治療組的懸尾不動(dòng)時(shí)間明顯縮短，總運(yùn)動(dòng)距離延長(zhǎng)，平均速度提高，提示正元膠囊可以緩解化療所致的精神性疲勞。

糖原是肌肉活動(dòng)的重要能量來(lái)源。在活動(dòng)過(guò)程中，肌糖原消耗會(huì)引起肝臟釋放糖原，當(dāng)參與活動(dòng)的肌肉和肝臟中的糖原水平顯著減少時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)疲勞。因此，肝糖原水平是判斷疲勞程度的敏感指標(biāo)[18]。在本研究中，順鉑組肝糖原水平低于正常組和模型組，而聯(lián)合治療組肝糖原水平較模型組和順鉑組均明顯升高。提示正元膠囊的治療效果與肝糖原水平有關(guān)，可增加順鉑化療后肝糖原儲(chǔ)備。

BMNCs 是指骨髓中的未成熟細(xì)胞，包括白細(xì)胞、巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞。骨髓細(xì)胞總數(shù)是骨髓造血的直接指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，順鉑組的BMNCs 計(jì)數(shù)明顯低于模型組，而正元膠囊在聯(lián)合治療組明顯增加了BMNCs 計(jì)數(shù)。骨髓涂片結(jié)果也表明，正元膠囊可以減輕順鉑的血液學(xué)毒性。外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)可以間接反映骨髓的造血功能，因此可以用來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)骨髓造血的影響。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，與順鉑組相比，聯(lián)合治療組WBC、HGB 明顯升高，說(shuō)明正元膠囊能改善順鉑化療后骨髓抑制。

TNF-α和IL-6是最常見(jiàn)和最重要的炎癥因子。在腫瘤的微環(huán)境中有大量的TNF-α 和IL-6，能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致免疫逃逸[19-21]。研究表明，外周免疫系統(tǒng)功能失調(diào)與持續(xù)疲勞有關(guān)。在免疫—大腦信號(hào)通路中，外周炎癥細(xì)胞因子如TNF-α 和IL-6 傳送信號(hào)到大腦，導(dǎo)致疲勞、睡眠障礙、抑郁等[22-23]。此外，CRF患者血清IL-6水平常升高[22]。因此，炎癥細(xì)胞因子抑制劑的開(kāi)發(fā)成為近年來(lái)CRF治療的研究熱點(diǎn)。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，晚期癌癥患者接受紫杉醇化療后給予TNF-α 受體阻滯劑治療，與對(duì)照組相比，沒(méi)接受TNF-α 受體阻滯劑的癌癥患者CRF的發(fā)病率更低[24]。TNF-α和IL-6亦是造血負(fù)性調(diào)節(jié)因子。TNF-α可以通過(guò)抑制EPO 的合成引起貧血[25]。而IL-6 則可誘導(dǎo)肝臟合成hepeidin，hepeidin 導(dǎo)致鐵代謝紊亂，抑制紅細(xì)胞生成，最終導(dǎo)致貧血[26]。在本研究中，TNF-α和IL-6 水平在模型組和順鉑組均較正常組升高，這與許多研究結(jié)果一致[19-21]。然而，TNF-α和IL-6的水平在順鉑組低于模型組，表明這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生并不是與順鉑導(dǎo)致的疲勞有關(guān)。

造血調(diào)節(jié)因子包括造血生長(zhǎng)因子和造血抑制因子，能夠?qū)撬柙煅杉?xì)胞的整個(gè)造血過(guò)程產(chǎn)生影響。造血生長(zhǎng)因子可分為集落刺激生長(zhǎng)因子和造血輔助因子。集落刺激生長(zhǎng)因子（CSF）包括G-CSF、EPO 和IL-3，可刺激造血干細(xì)胞形成集落。上面提到的炎癥細(xì)胞因子TNF-α 就屬于造血抑制因子。造血輔助因子與其他造血生長(zhǎng)因子協(xié)同作用，促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖分化，而不是單獨(dú)形成菌落。EPO 在骨髓紅細(xì)胞的分裂、分化和成熟過(guò)程中起著重要作用。EPO 的減少可能導(dǎo)致貧血，但EPO 是否能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)目前尚不清楚[27-31]。在本研究中，對(duì)模型組與正常組的EPO水平進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤本身并不分泌EPO。而聯(lián)合治療組EPO水平明顯高于模型組和順鉑組，則說(shuō)明正元膠囊能促進(jìn)EPO 分泌，從而改善CRF裸鼠貧血。

G-CSF 主要由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌，進(jìn)入循環(huán)后可發(fā)揮全身作用。G-CSF 已廣泛應(yīng)用于預(yù)防或治療化療引起的中性粒細(xì)胞減少癥。近年來(lái)，G-CSF與其受體G-CSFR的表達(dá)在各種實(shí)體腫瘤中均有報(bào)道，其結(jié)合可能激活下游信號(hào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)移，因此，使G-CSF的應(yīng)用引起了一定爭(zhēng)議[32-35]。本研究結(jié)果顯示，模型組G-CSF 水平明顯高于正常組，而順鉑組G-CSF 水平及瘤體質(zhì)量明顯低于模型組，提示瘤體及其微環(huán)境分泌G-CSF，當(dāng)化療后腫瘤縮小，使G-CSF 水平下降。此外，化療的毒性也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成很大的損傷，導(dǎo)致G-CSF 水平下降。與順鉑組相比，聯(lián)合治療組G-CSF水平升高，瘤體質(zhì)量相近，說(shuō)明正元膠囊可促進(jìn)正常細(xì)胞分泌G-CSF，而不促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

IL-3 又稱多菌落刺激因子，是一種具有廣譜效應(yīng)的造血生長(zhǎng)因子。它能在造血的早期起作用，促進(jìn)造血干細(xì)胞在不同階段的增殖分化。IL-3還與多種造血生長(zhǎng)因子協(xié)同調(diào)控造血過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，正常組、模型組和順鉑組IL-3 水平無(wú)明顯差異，而聯(lián)合治療組IL-3 水平明顯高于其他各組。因此，我們認(rèn)為，腫瘤及其腫瘤微環(huán)境不分泌IL-3，但正元膠囊可促進(jìn)裸鼠IL-3 分泌，促進(jìn)造血功能恢復(fù)，改善化療后骨髓抑制。而以上結(jié)果顯示，與順鉑組相比，聯(lián)合治療組與骨髓造血功能相關(guān)的集落刺激生長(zhǎng)因子G-CSF、EPO、IL-3明顯升高，說(shuō)明正元膠囊可促進(jìn)G-CSF、EPO、IL-3等的分泌，從而減輕化療后骨髓毒性和疲勞。

綜上所述，正元膠囊可減輕裸鼠化療后骨髓抑制，提高肝糖原儲(chǔ)備，緩解裸鼠的CRF 癥狀。正元膠囊更可能通過(guò)改善骨髓功能來(lái)緩解CRF。本研究為正元膠囊防治CRF 及后續(xù)機(jī)制研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為臨床防治CRF 提供了新的思路與方法。