大承氣湯對重癥急性胰腺炎大鼠回腸組織JAK2/STAT3信號通路的影響

沈銀峰， 巴元明， 彭澤旭， 李攀

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北省中醫(yī)院，湖北武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖北武漢 430061）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種臨床常見的急腹癥，其特點(diǎn)為病情重、并發(fā)癥多、病情發(fā)展迅速、病死率高[1]。腸道是SAP時最先受累的胰外器官，腸屏障功能障礙在全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）和多器官功能障礙綜合征（MODS）的發(fā)病過程中起到了始動作用[2-3]。大承氣湯出自醫(yī)圣張仲景《傷寒雜病論》，由大黃、芒硝、枳實(shí)、厚樸等4味中藥組成，是通里攻下法的代表方劑，是臨床上用于治療SAP 的經(jīng)典方劑[4]。已有研究[5]表明，Janus 激酶（JAK）2/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）3信號通路參與了SAP炎癥反應(yīng)過程和組織損害的病理生理過程。因此，本研究基于JAK2/STAT3信號途徑探討大承氣湯對SAP 腸道的保護(hù)作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物健康Wistar 雄性大鼠240 只，體質(zhì)量（230±20）g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心，動物許可證號：SCXK（鄂）2008-0005。于湖北省中醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心完成實(shí)驗(yàn)，室溫22 ℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，標(biāo)準(zhǔn)化食物和飲用水喂養(yǎng)。

1.2 藥物大承氣湯組成：大黃12 g、芒硝9 g、枳實(shí)12 g、厚樸24 g。以上中藥材均購自湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司。水煎濃縮至含生藥1.2 g/mL[6]。

1. 3 試劑與儀器牛磺膽酸鈉，購自美國Sigma公司；魯索替尼（Ruxolitinib，JAK2 抑制劑）、Stattic（STAT3抑制劑）購自美國Selleck Chemicals公司；逆轉(zhuǎn)錄—定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒、cDNA合成試劑盒、TRIzol、電化學(xué)發(fā)光溶液，購自美國Sigma公司；磷酸化JAK2（p-JAK2）抗體、HRP-標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體，磷酸化STAT3（p-STAT3）抗體、HRP-標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體、細(xì)胞裂解液均購自武漢博士德生物工程有限公司。Model550型自動酶標(biāo)光度儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；BX53 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 動物模型的建立大鼠于手術(shù)前12 h禁食不禁水，采用3.5%?；悄懰徕c（1.0 mL/kg 體質(zhì)量，0.1 mL/min）逆行膽胰管內(nèi)注射制備SAP模型[7]，術(shù)后大鼠自由飲水。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法將造模成功的SAP 模型Wistar 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為模型組、JAK2抑制劑組、STAT3抑制劑組、大承氣湯組，另設(shè)假手術(shù)組，每組大鼠各48只。模型組按“1.4”項(xiàng)方法操作；假手術(shù)組大鼠逆行膽胰管內(nèi)注射生理鹽水（1.0 mL/kg 體質(zhì)量，0.1 mL/min）；JAK2 抑制劑組采取術(shù)前2 h 灌胃給藥（魯索替尼，劑量為180 mg/kg）；STAT3 抑制劑組采取術(shù)前2 h 腹腔注射給藥（Stattic，劑量為3.75 mg/kg）；大承氣湯組大鼠采取術(shù)前2 h灌胃給藥（大承氣湯，劑量為12 g/kg）。同時，每組大鼠對應(yīng)給予等量生理鹽水灌胃或腹腔注射處理。以膽胰管內(nèi)注射完畢標(biāo)記為時間0 點(diǎn)，各組大鼠分別再隨機(jī)分為4個亞組，標(biāo)記為3 h、6 h、12 h、18 h，每組各12 只。取末端回腸組織，以PBS 液沖洗干凈后，一部分以體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液固定，一部分置于-80 ℃液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1. 6. 1 末端回腸組織學(xué)變化 新鮮末端回腸組織，用體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚度切片，行蘇木素—伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜組織結(jié)構(gòu)。

1. 6. 2 RT-qPCR 測定末端回腸組織JAK2 和STAT3 mRNA表達(dá) 取凍存?zhèn)溆玫幕啬c組織，研磨成粉狀后用TRIzol 提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。引物（由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成）序列見表1。PCR 反應(yīng)條件：初始變性（95 ℃，3 min），然后進(jìn)行40個循環(huán)的變性（95 ℃，15 s）、退火（60 ℃，30 s）和延伸（72 ℃，30 s）。內(nèi)參為GAPDH，以公式2-△△Ct法計(jì)算JAK2和STAT3 mRNA相對表達(dá)量。

1.6.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法測定末端回腸組織p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá) 將回腸組織勻漿后，加入細(xì)胞裂解液。30 min后，將蛋白質(zhì)裂解物和上樣緩沖液混合，十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜。于室溫22 ℃，用含有50 g/L 脫脂奶粉的PBS 封閉蛋白質(zhì)1 h。后與一抗（p-JAK2 稀釋度1∶100、p-STAT3稀釋度1∶500）4 ℃孵育過夜。PBS漂洗3 次后，將膜與二抗在室溫下孵育1 h。PBS沖洗膜3次后，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光溶液顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像。使用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件測定每個條帶的光密度（OD）。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算p-JAK2、p-STAT3蛋白的相對表達(dá)水平（p）。1. 7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間差異性檢測采用方差分析，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1 造模大鼠與假手術(shù)組大鼠術(shù)后3 h 胰腺組織病理改變圖1 結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠術(shù)后3 h胰腺組織病理改變不明顯；造模大鼠術(shù)后3 h胰腺組織存在不同程度的充血水腫，片狀出血及黑色壞死，證實(shí)SAP造模成功。

圖1 造模大鼠和假手術(shù)大鼠術(shù)后3 h胰腺組織病理改變（HE染色，×100）Figure 1 The pathological changes in pancreatic tissue of modeling rats and sham operation rats 3 h afteroperation（by HE staining，×100）

2.2 各組大鼠術(shù)后12 h末端回腸組織病理改變比較圖2結(jié)果顯示：假手術(shù)組腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)未見破壞，間質(zhì)未見水腫、未見中性粒細(xì)胞浸潤。模型組腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，并呈進(jìn)行性改變，術(shù)后12 h 最顯著，間質(zhì)水腫并點(diǎn)狀出血，大量中性粒細(xì)胞浸潤，絨毛水腫增粗，高度縮短，杯狀細(xì)胞減少，排列紊亂；JAK2 抑制劑組、STAT3 抑制劑組、大承氣湯組術(shù)后12 h 病理損傷較模型組明顯減輕，可見中性粒細(xì)胞浸潤減輕，絨毛脫落減輕、高度較長。

圖2 各組大鼠術(shù)后12 h末端回腸病理改變比較（HE染色，×100）Figure 2 Comparisonof the pathological changes in terminal ileum of various groups 12 h after operation（by HE staining，×100）

2. 3 各組大鼠不同時間回腸組織JAK2 mRNA 和p-JAK2 蛋白表達(dá)比較各組大鼠末端回腸組織JAK2 mRNA和p-JAK2蛋白表達(dá)水平不斷增加，在12 h 達(dá)到峰值（P ＜0.05）。模型組和STAT3 抑制劑組JAK2 mRNA 和p-JAK2 蛋白表達(dá)變化一致（P ＞0.05）。假手術(shù)組、模型組、JAK2 抑制劑組、STAT3抑制劑組、大承氣湯組JAK2 mRNA和p-JAK2蛋白表達(dá)水平在4 個時間點(diǎn)的兩兩比較結(jié)果顯示，大承氣湯組＜JAK2 抑制劑組＜STAT3 抑制劑組＜模型組＜假手術(shù)組（P ＜0.05）。具體見表2、3 及圖3。

2.4 各組大鼠不同時間回腸組織STAT3 mRNA 和p-STAT3 蛋白表達(dá)比較各組STAT3 mRNA 和p-STAT3 蛋白表達(dá)水平術(shù)后12 h 上升到最高（P ＜0.05）后緩慢下降（P ＜0.05）。模型組、JAK2 抑制劑組、STAT3抑制劑組、大承氣湯組STAT3 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)水平4個時間點(diǎn)兩兩比較結(jié)果顯示，模型組＞STAT3 抑制劑組＞JAK2 抑制劑組＞大承氣湯組（P ＜0.05）。具體見表4、5及圖4。

表2 各組大鼠不同時間回腸組織JAK2 mRNA表達(dá)比較Table 2 Comparison of the mRNA expression level of JAK2 in rat ileum of various groups at different time points (±s)

表2 各組大鼠不同時間回腸組織JAK2 mRNA表達(dá)比較Table 2 Comparison of the mRNA expression level of JAK2 in rat ileum of various groups at different time points (±s)

①②③④⑤：5 組組內(nèi)，3 h 與6 h 比較、6 h 與12 h 比較、12 h 與18 h 比較，均P ＜0.05；⑥⑦⑧⑨：4 個時間點(diǎn)，假手術(shù)組與模型組比較、模型組與JAK2抑制劑組比較、JAK2抑制劑組與STAT3抑制劑組比較、STAT3抑制劑組與大承氣湯組比較，均P ＜0.05

組別假手術(shù)組模型組JAK2抑制劑組STAT3抑制劑組大承氣湯組N/只12 12 12 12 12 3 h 0.107±0.018 0.413±0.103⑥0.317±0.098⑥0.421±0.113⑥0.314±0.097⑥6 h 0.211±0.027①0.612±0.130②⑦0.484±0.112③⑦0.617±0.129④⑦0.487±0.117⑤⑦12 h 0.287±0.024①0.812±0.135②⑧0.617±0.123③⑧0.817±0.143④⑧0.621±0.130⑤⑧18 h 0.189±0.017①0.584±0.137②⑨0.512±0.087③⑨0.579±0.142④⑨0.520±0.091⑤⑨

表3 各組大鼠不同時間回腸組織p-JAK2蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of the protein expression level of p-JAK2 in rat ileum of various groups at different time points （±s，p）

表3 各組大鼠不同時間回腸組織p-JAK2蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of the protein expression level of p-JAK2 in rat ileum of various groups at different time points （±s，p）

①②③④⑤：5組組內(nèi)，3 h與6 h比較、6 h與12 h比較、12 h與18 h比較，均P ＜0.05；⑥⑦⑧⑨：4個時間點(diǎn)，假手術(shù)組與模型組比較、模型組與JAK2 抑制劑組比較、JAK2 抑制劑組與STAT3 抑制劑組比較、STAT3 抑制劑組與大承氣湯組比較，均P ＜0.05

組別假手術(shù)組模型組JAK2抑制劑組STAT3抑制劑組大承氣湯組N/只12 12 12 12 12 3 h 0.446±0.077 0.802±0.178⑥0.661±0.121⑥0.775±0.168⑥0.671±0.127⑥6 h 0.501±0.085①0.991±0.182②⑦0.910±0.133③⑦0.950±0.142④⑦0.935±0.142⑤⑦12 h 0.574±0.085①1.345±0.246②⑧1.174±0.221③⑧1.321±0.233④⑧1.211±0.212⑤⑧18 h 0.481±0.095①0.921±0.181②⑨0.885±0.204③⑨0.922±0.185④⑨0.851±0.196⑤⑨

圖3 p-JAK2蛋白Western Blot電泳條帶Figure 3 The Western blotting electrophoresis strip of p-JAK2 protein

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，重癥急性胰腺炎（SAP）的病因病機(jī)具有郁、結(jié)、熱、瘀互結(jié)的特點(diǎn)，根據(jù)“六腑以通為用”的原則，應(yīng)用大承氣湯中西醫(yī)結(jié)合治療SAP 已經(jīng)有近50 年的歷史，取得了很好的臨床治療效果。大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究顯示，大承氣湯能滌蕩胃腸、阻止腸道菌群移位、減少促炎因子釋放、保護(hù)胰外器官等作用[8-9]。

腸損害在SAP 病程發(fā)展中起著非常關(guān)鍵的作用，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不十分明確[10]。有研究顯示，SAP早期機(jī)體處于免疫應(yīng)激狀態(tài)，大量的炎性物質(zhì)產(chǎn)生，炎性信號通路激活，多種炎癥介質(zhì)過度釋放等引起腸道屏障損傷、腸道細(xì)菌移位和腸源性內(nèi)毒素血癥，大量細(xì)菌和內(nèi)毒素進(jìn)入血循環(huán)，啟動SIRS并引發(fā)MODS[11-12]。

表4 各組大鼠不同時間回腸組織STAT3 mRNA 表達(dá)比較Table 4 Comparison of the mRNA expression level of STAT3 in rat ileum of various groups at different time points (±s)

表4 各組大鼠不同時間回腸組織STAT3 mRNA 表達(dá)比較Table 4 Comparison of the mRNA expression level of STAT3 in rat ileum of various groups at different time points (±s)

①②③④⑤：5組組內(nèi)，3 h與6 h比較、6 h與12 h比較、12 h與18 h比較，均P ＜0.05；⑥⑦⑧⑨：4個時間點(diǎn)，假手術(shù)組與模型組比較、模型組與JAK2 抑制劑組比較、JAK2 抑制劑組與STAT3 抑制劑組比較、STAT3 抑制劑組與大承氣湯組比較，均P ＜0.05

組別假手術(shù)組模型組JAK2抑制劑組STAT3抑制劑組大承氣湯組N/只12 12 12 12 12 3 h 0.101±0.020 0.405±0.101⑥0.347±0.086⑥0.307±0.089⑥0.231±0.065⑥6 h 0.124±0.018①0.564±0.131②⑦0.474±0.103③⑦0.411±0.980④⑦0.372±0.093⑤⑦12 h 0.141±0.023①0.812±0.141②⑧0.583±0.117③⑧0.525±0.127④⑧0.486±0.112⑤⑧18 h 0.127±0.013①0.605±0.130②⑨0.411±0.114③⑨0.374±0.102④⑨0.376±0.104⑤⑨

表5 各組大鼠不同時間回腸組織p-STAT3蛋白表達(dá)比較Table 5 Comparison of the protein expression level of p-STAT3 in rat ileum of various groups at different time points （±s，p）

表5 各組大鼠不同時間回腸組織p-STAT3蛋白表達(dá)比較Table 5 Comparison of the protein expression level of p-STAT3 in rat ileum of various groups at different time points （±s，p）

①②③④⑤：5組組內(nèi)，3 h與6 h比較、6 h與12 h比較、12 h與18 h比較，均P ＜0.05；⑥⑦⑧⑨：4個時間點(diǎn)，假手術(shù)組與模型組比較、模型組與JAK2 抑制劑組比較、JAK2 抑制劑組與STAT3 抑制劑組比較、STAT3 抑制劑組與大承氣湯組比較，均P ＜0.05

組別假手術(shù)組模型組JAK2抑制劑組STAT3抑制劑組大承氣湯組N/只12 12 12 12 12 3 h 0.342±0.065 0.691±0.144⑥0.645±0.120⑥0.577±0.110⑥0.557±0.107⑥6 h 0.403±0.067①0.912±0.175②⑦0.813±0.124③⑦0.710±0.123④⑦0.673±0.129⑤⑦12 h 0.443±0.074①1.291±0.214②⑧0.984±0.187③⑧0.861±0.165④⑧0.808±0.175⑤⑧18 h 0.364±0.057①0.890±0.168②⑨0.780±0.170③⑨0.700±0.162④⑨0.679±0.167⑤⑨

圖4 p-STAT3蛋白Western Blot電泳條帶Figure 4 The Western blotting electrophoresis strip of p-STAT3 protein

JAK2 廣泛分布于體細(xì)胞胞漿中，對免疫細(xì)胞的活化具有重要作用[13]；STAT3是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，活化后能誘導(dǎo)與細(xì)胞分化、凋亡等相關(guān)的下游靶基因的表達(dá)[13]。JAK2/STAT3是JAK/STAT家族中最重要的途徑，與炎癥關(guān)系密切[14]。李敏利等[15]研究發(fā)現(xiàn)，SAP發(fā)作時大量促炎因子釋放，抑制JAK2/STAT3通路，因此可以減少SAP 發(fā)作時促炎因子的過度釋放。Zhu等[16]通過動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3信號通路在SAP 相關(guān)腎損害的分子機(jī)制中起關(guān)鍵作用，抑制JAK2/STAT3信號通路可以顯著降低外周血中TNF-α 和IL-6水平。魯索替尼作為酪氨酸激酶抑制劑，應(yīng)用于抑制JAK1/2[17]。Stattic 作為有效的活化STAT3 的抑制劑，應(yīng)用于STAT3活化的動物模型[18]。

本研究結(jié)果顯示，SAP大鼠末端回腸組織損傷嚴(yán)重，回腸組織中JAK2 mRNA、STAT3 mRNA、p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白過度表達(dá)；應(yīng)用JAK2抑制劑和STAT3 抑制劑可明顯下調(diào)此類事件，減輕病理結(jié)構(gòu)破壞。而大承氣湯亦能夠改善SAP 的腸損害，抑制末端回腸組織中JAK2 mRNA、STAT3 mRNA、p-JAK2 蛋白和p-STAT3 蛋白的過表達(dá)，且與應(yīng)用JAK2抑制劑和STAT3抑制劑下調(diào)此類事件效果類似。

綜上所述，活化的JAK2/STAT3 通路在SAP 腸損害中起重要作用，大承氣湯可抑制活化的JAK2/STAT3 通路，保護(hù)腸道；但大承氣湯抑制活化的JAK2/STAT3 通路的具體機(jī)制以及量效關(guān)系需要進(jìn)一步研究。