穴位埋線對慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜形態(tài)及血清SOD、MDA含量的影響

馬林， 章小梅， 黃德裕

（1.中山市陳星海醫(yī)院針灸科，廣東中山 528415；2.佛山市仁和中醫(yī)院，廣東佛山 528200）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是因胃黏膜上皮受到多種因素損害，黏膜固有層腺體減少，伴有或不伴有纖維化生、腸腺化生和/或假幽門腺化生的一種慢性胃部疾病[1]，萎縮性胃炎伴有中度以上腸化生或者異型增生可視為胃癌的癌前病變[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對CAG 病因和病理機制的研究尚未完全明確，普遍認為該病與幽門螺旋桿菌感染、遺傳和膽汁反流等因素有關(guān)。目前的治療主要集中在針對病因、改善癥狀和緩解胃黏膜炎癥等方面，主要的西醫(yī)治療原則是根除幽門螺旋桿菌、抑酸護胃，中醫(yī)中藥對GAG 的治療也有積極的作用[3]。中醫(yī)針刺療法可以改善CAG患者的臨床癥狀，并且療效確切。穴位埋線屬于中醫(yī)針刺療法之一，具有操作簡單、療效持久且價格低廉的優(yōu)點，臨床可見諸多報道，但多數(shù)屬于敘述性研究，缺乏循證對照和重復(fù)性，難以科學(xué)體現(xiàn)穴位埋線的優(yōu)勢。本課題組前期研究[4]提示，穴位埋線能抑制JAK2/STAT3轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的異常激活，降低CyclinD 1 等靶因子的表達水平，從而起到改善CAG 的作用，但其治療機制有待進一步探討。本研究擬觀察穴位埋線后CAG模型大鼠胃黏膜的形態(tài)和血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD） 及 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）的含量變化，以期進一步闡明其改善CAG的作用機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料

SPF 級8 周齡雄性大鼠64 只，體質(zhì)量180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SYXK（粵）2013-0034。動物飼料：清潔級普通飼料，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心實驗室，采用架式分籠喂養(yǎng)，恒溫（20 ±1）℃，濕度45%～60%，明暗周期12 h 交替，自動通風(fēng)8～15 次/h 條件下飼養(yǎng)。實驗遵守《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中的動物保護和倫理原則。

1.2 藥品與試劑

N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（MNNG，日本東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)，批號：TCI-M0527-5g）；10%福爾馬林中性緩沖固定液（廣州維格斯生物科技有限公司）；大鼠SOD、MDA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，產(chǎn)品批號分別為：A001-3、A003-2）。

1.3 主要儀器

6 號一次性注射針頭（浙江康德萊醫(yī)療器械公司）；4-0號鉻制羊腸線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司）；光學(xué)顯微鏡（XSP-C 204，上海萊卡公司）；切片機（RM 2016，上海萊卡公司）；包埋機（JB-P5，武漢俊杰電子有限公司）；脫水機（JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司）；振蕩器（QB8002，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；酶標儀（MK3，美國Thermo Multiskan 公司）；離心機（LX200，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；渦旋混合器（KB3，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；PBS 緩沖液（G0002，武漢谷歌生物科技有限公司）；蘇木素染液（G1004，武漢谷歌生物科技有限公司）；中性樹膠（G1403，谷歌生物）。

1.4 模型制備

所有SD 大鼠均給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將64 只大鼠按照隨機數(shù)字表隨機分成空白組15 只和造模組49 只。空白組給予普通飼料配合蒸餾水常規(guī)喂養(yǎng)，不予造模，每天給予等容積生理鹽水灌胃。造模組大鼠參考文獻[5]方法略加改進，復(fù)制CAG模型：將MNNG加蒸餾水調(diào)配為1 g/L的母液，置于4 ℃冰箱并用錫紙覆蓋避光保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r取用母液加入自來水配制成100 μg/mL的飲用液，供大鼠自由飲用，每24 h更換溶液1次，同時配以饑飽失常法，即大鼠飽食1日，禁食1日，交替進行，每周測體質(zhì)量1次。根據(jù)前期經(jīng)驗，造模組大鼠自16 周開始，每周隨機剖殺2 只大鼠，對胃黏膜組織進行光鏡和病理檢測，以確定模型是否復(fù)制成功。造模第22周大鼠胃黏膜病理顯示，腺體減少，排列紊亂，局部壞死，符合大鼠慢性萎縮性胃炎診斷標準[5]，提示造模成功。

1.5 動物分組與治療

取造模組大鼠49只，從第16周開始每周剖殺2 只，至第22 周造模成功，期間共殺檢大鼠14 只。造模過程中死亡3只，其中，2只大鼠因為打斗后傷口感染死亡，1只大鼠因為長期不明原因不進食而死亡，其余大鼠均未出現(xiàn)明顯的不良情況。采用隨機數(shù)字表將32 只成模大鼠隨機分為模型組和埋線組，每組各16 只，同時配合預(yù)先設(shè)置好的空白組15 只，最終分為3 組，即模型組、埋線組和空白組，3 組采用相同的喂養(yǎng)方式繼續(xù)喂養(yǎng)，均自由進食和飲用蒸餾水。埋線組采取穴位埋線治療，參考《實驗針灸學(xué)》[6]選取脾俞、中脘、足三里穴，將0.5 cm長的4-0號鉻制羊腸線從6 號一次性注射針頭的針尖處裝入針體（此時注射針頭內(nèi)作為針芯的30 號1. 5 寸不銹鋼毫針稍退后），線頭與針尖內(nèi)緣齊平，背腰部穴位由局部下方向上平刺，下肢穴位直刺，刺至所需深度，邊推針芯，邊退針管。將羊腸線埋植于穴位皮下組織或肌層內(nèi)，線頭不外露，消毒針孔，外敷無菌敷料，膠布固定24 h。每10 d治療1 次，共埋線治療6次。模型組大鼠造模后只抓取，不治療?？瞻捉M正常喂養(yǎng)。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 一般狀態(tài)觀察 對各組大鼠的毛色、精神狀態(tài)及活動情況進行觀察和比較。

1.6.2 胃黏膜的大體觀察和光學(xué)顯微鏡觀察 大鼠在取材前24 h 禁食但不禁水，腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）進行麻醉，待麻醉后迅速剖腹，摘取全胃，沿大彎至小彎方向剪開，以0.9%氯化鈉溶液加以清洗，對剪開的胃組織做肉眼大體觀察，包括黏膜的色澤、彈性、皺襞多少、黏液覆蓋量以及有無出血點。然后，選取典型的胃黏膜組織約3 mm × 5 mm，固定于10%中性甲醛溶液中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度大約為4 μm，蘇木素—伊紅（HE）染色后，乙醇脫水，二甲苯透明樹脂膠封片，行光學(xué)顯微攝影，并于光鏡下觀察胃黏膜炎癥細胞浸潤以及腸化生和癌變情況。

1. 6. 3 大鼠血清SOD 和MDA 含量檢測 按照“1.6.2”項下方法處死大鼠，用負壓真空管于腹主動脈采血，以3 000 r/min離心10 min，獲取上層血清，用0.5 μL離心管分裝并置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以上制備的血清標本采用酶?lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測方法測定大鼠SOD、MDA含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況比較

空白組大鼠營養(yǎng)狀態(tài)良好，好動，皮毛順滑，有光澤，飲食飲水正常，精神狀態(tài)良好，行動靈活，二便正常。模型組大鼠精神狀態(tài)不佳，皮毛光澤差，毛色灰暗，活動緩慢，精神狀態(tài)萎靡，喜臥，攝食量減少，自主活動減少。與模型組比較，埋線組大鼠毛色有光澤，攝食量增多，活潑好動，自主活動均有明顯增加，精神狀況有所改善。說明穴位埋線可以改善大鼠的皮毛光澤度、精神狀態(tài)、飲食飲水以及行動靈活性等情況。

2.2 各組大鼠胃黏膜大體觀察結(jié)果

空白組：胃黏膜整體具有彈性，皺襞形態(tài)規(guī)則，黏膜表面光滑有光澤，黏膜外觀橘紅色，表面覆蓋多量黏液，無出血點。埋線組：黏膜較有彈性，黏膜外形較規(guī)整，黏膜外觀暗紅色，黏膜表面覆蓋中量黏液，肉眼可見散在出血點。模型組：胃黏膜整體擴張，胃壁彈性差且整體變薄，皺襞低平或消失，黏膜顏色灰白，表面少量黏液依附，可見大量出血點。

2.3 各組大鼠胃黏膜光鏡觀察結(jié)果

空白組：胃黏膜厚度正常，上皮細胞與腺體排列有序，且形態(tài)基本一致，細胞呈單層柱狀排列，腺體豐富，腺體和胃小凹之間分界清晰，黏膜和固有腺體無充血、水腫及增生。見圖1-a。埋線組：胃黏膜厚度適中，腺體排列次序總體規(guī)則，可見局限紊亂。細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本一致，黏膜表層可見炎細胞浸潤，固有腺體完整。個別腺體有萎縮性改變，但無明顯壞死。見圖1-b。模型組：胃黏膜層變薄，而肌層變厚，胃小凹變淺，腺體縮小，腺體和胃小凹之間分界模糊不清，排列雜亂，數(shù)量減少，可見大量囊性擴張，呈空泡狀，多量間質(zhì)、纖維組織增生，并可見淋巴細胞浸潤和腺上皮化生。見圖1-c。

圖1 各組大鼠胃黏膜病理形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathomorphological features of gastric mucosa in rats of various groups（by HE staining，×200）

2.4 各組大鼠血清中SOD和MDA含量的比較

表1結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清SOD 含量顯著降低，MDA 含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，埋線組大鼠血清SOD 含量顯著升高，MDA 含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清中SOD和MDA含量的比較Table 1 Comparison of the serum SOD and MDA contents in rats of various groups (±s)

表1 各組大鼠血清中SOD和MDA含量的比較Table 1 Comparison of the serum SOD and MDA contents in rats of various groups (±s)

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別空白組模型組埋線組N/只15 16 16 SOD[J/（U·mL-1）]192.19±7.14 156.03±7.01①185.81±5.19②MDA[c/（nmol·mL-1）]5.53±0.91 8.96±1.21①6.46±0.90②

3 討論

慢性萎縮性胃炎（chronicatrophicgastritis，CAG）是常見并且難治的消化系統(tǒng)疾病，重度慢性萎縮性胃炎常被定義為癌前病變，西醫(yī)對本病尚無特效治療手段，中醫(yī)特色療法對本病的治療具有明顯優(yōu)勢。本課題組通過觀察穴位埋線療法對CAG模型大鼠胃黏膜形態(tài)的改變和血清SOD、MDA 含量的影響，探討穴位埋線療法改善CAG 的可能作用機制。

本研究結(jié)果顯示：埋線組大鼠胃黏膜的彈性、形態(tài)、顏色和表面黏液以及有無出血點等多項觀察指標同空白組接近，肉眼所見大鼠胃黏膜外觀接近空白組，而較模型組明顯改善，說明穴位埋線療法能夠明顯改善鼠胃黏膜的外在形態(tài)。研究[7]報道，通過對CAG 大鼠足三里、中脘、胃俞進行穴位埋線和針刺治療，結(jié)果顯示：穴位埋線對CAG的治療作用可能與其能促進胃液分泌、改善胃黏膜病理形態(tài)變化有關(guān)。該研究結(jié)果與本研究結(jié)論有相似之處。

SOD 是生物體組織中廣泛存在的一種金屬蛋白酶，具有催化自由基的歧化反應(yīng)，推動超氧陰離子氧化并降低其細胞毒性，保護細胞膜等功能。SOD 活性的高低是機體清除自由基能力的直接反應(yīng)，機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)會在SOD 活性降低的狀態(tài)下得到釋放[8]，生理狀態(tài)下，氧自由基的含量處于一種動態(tài)平衡中。研究[9]表明，機體大量蓄積的自由基可損傷細胞膜和蛋白質(zhì)，其廣泛參與了炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。另外，自由基可誘發(fā)脂類的過氧化反應(yīng)，不飽和脂肪酸的過氧化產(chǎn)物就是MDA，其可以間接反應(yīng)細胞受損的程度。相關(guān)研究[10]顯示：體內(nèi)過量的MDA 等過氧化物可對胃黏膜造成損傷。SOD 和MDA 的綜合觀測結(jié)果是反映機體清除氧自由基能力和機體受自由基攻擊程度的重要參考[11]。本研究結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清SOD含量顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，埋線組大鼠血清SOD 含量顯著升高，MDA 含量顯著降低（P＜0.01）。本研究采用MNNG 制備大鼠CAG模型，對大鼠胃黏膜造成了損傷，提示胃黏膜的炎癥損傷可以導(dǎo)致機體抗氧化能力降低而過氧化作用增強。有研究[12]顯示：束縛應(yīng)激方法能夠?qū)е麓笫笪葛つば纬蓱?yīng)激性潰瘍，且胃黏膜損傷潰瘍指數(shù)同MDA含量呈正相關(guān)，與SOD/MDA的比值呈負相關(guān)。以上研究結(jié)果同本實驗結(jié)論相類似。研究[13]報道，穴位埋線能夠改善CAG 大鼠胃黏膜超微結(jié)構(gòu)、保護胃黏膜。穴位埋線可提高大鼠腦組織SOD 活性而降低MDA 含量，從而產(chǎn)生對腦組織的保護作用[14]。所以，我們認為，穴位埋線對機體組織的治療作用是沒有組織選擇性的，影響機體組織SOD、MDA 含量是實現(xiàn)其治療作用的途徑之一。

綜上所述，SOD 與MDA 的含量水平可視為評價CAG 病情及預(yù)后的生物學(xué)標志之一，其可能的作用機制是穴位埋線治療能夠提升機體細胞的抗氧化能力，同時清除體內(nèi)過量的過氧化物從而達到保護胃黏膜的作用，最終逆轉(zhuǎn)CAG 向胃癌發(fā)展的病理進程。Arimoto 等[15]研究表明，過量的自由基能夠激活癌癥基因而產(chǎn)生癌變，故今后研究方向可以結(jié)合腫瘤免疫學(xué)做進一步深入的研究，這也許是將來針刺研究的重要方向。