湖南省部分地區(qū)奶牛源金黃色葡萄球菌分離鑒定與耐藥性分析

叢 彬， 楊 俊， 王 慧， 劉伯承， 周望平， 傅勝才

(湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)也稱“金葡菌”，是革蘭氏陽性球菌，常寄居與人和動物的皮膚、鼻咽喉、腸胃道、癰、以及化膿瘡口中，也存在于空氣、污水等環(huán)境中，是一種常見的食源性致病微生物[1]。金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要傳染性致病菌之一，金黃色葡萄球菌感染導致的奶牛乳房炎治愈率低、復發(fā)率高，常引起奶牛產(chǎn)奶量下降、奶質(zhì)量下降、廢棄奶和病死牛的數(shù)量增加，給奶牛生產(chǎn)業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失[2]。目前，臨床上奶牛乳房炎的主要預防和治療措施為抗生素乳房灌注[3]。但是，該菌株可以通過自身表型改變以及調(diào)節(jié)代謝通路對抗生素產(chǎn)生適應性耐藥，同時還可以通過水平等方式轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因從而對各種抗生素產(chǎn)生耐藥性[4]，使抗生素的臨床治療效果大打折扣。2000年以來，隨著在獸醫(yī)臨床上各種抗生素的廣泛使用和不規(guī)范應用，使包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的各種細菌耐藥菌株的種類及數(shù)量越來越多，呈現(xiàn)出耐藥范圍廣、多重耐藥、耐藥率高的特點，給臨床治療奶牛乳房炎帶來極大阻礙[5]，因此，對于金黃色葡萄球菌耐藥性研究引起人們廣泛關(guān)注。本實驗通過調(diào)查湖南省部分地區(qū)奶牛場金黃色葡萄球菌耐藥性情況，檢測耐藥基因種類，可為金黃色葡萄球菌的感染提供治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

19株奶牛金黃色葡萄球菌(分別編號1～19)均從湖南省多個規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場分離得到，將得到的所有菌株一起進行鑒定培養(yǎng)和耐藥基因檢測。

1.2 主要藥品和試劑盒

15種藥敏試紙及規(guī)格：青霉素(RA)，10 μg/片；苯唑西林(OX)，10 μg/片；氧氟沙星(OFX)，30 μg/片；頭孢唑林(KZ)，15 μg/片；萬古霉素(VA)，30 μg/片；克林霉素(DA)，30 μg/片；恩諾沙星(ENR)，100 μg/片；氨芐西林(AMP)，10 μg/片；環(huán)丙沙星(CIP)，5 μg/片；四環(huán)素(TCY)，30 μg/片；慶大霉素(CN)，10 μg/片；紅霉素(ERY)，15 μg/片；氯霉素(C)，10 μg/片；甲氧芐啶(W)，30 μg/片；利福平(RD)，30 μg/片。所有藥敏試紙均購自杭州微生物試劑有限公司(表1)。

1.3 主要儀器

津騰針式過濾除菌器購自北京開源國創(chuàng)科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫鼓風干燥箱購自上海森信實驗儀器有限公司；MJP型恒溫培養(yǎng)箱購自北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺購自蘇州凈化設備有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器購自上海智城分析儀器制造有限公司；DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；Tanon3500R型凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司。

表1 主要藥品及來源

1.4 培養(yǎng)基制備

BP培養(yǎng)基的配制：加入蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀0.75 g，磷酸二氫鈉4.5 g，氯化鈉2.5 g，蒸餾水500 mL，121 ℃高壓滅菌15 min，用無菌燒瓶分裝。

1.5 奶牛源金黃色葡萄球菌的分離

從湖南省多個規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場采集78份樣品：用手按摩奶牛乳房，使其有牛奶流出，棄去前3把奶，將采樣管插入奶牛乳房，取牛奶乳樣10 mL，密封寫好編號，低溫保存，盡快送至實驗室。

用無菌棉拭子在血平板瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37 ℃下培養(yǎng)18 h，取生長狀態(tài)良好的菌落接種至BP培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)24 h，挑取在培養(yǎng)基上顯示特殊光圈的單個菌落進行革蘭氏染色，而后鏡檢。挑取菌落在血平板培養(yǎng)基上進行純培養(yǎng)。

1.6 革蘭氏染色

在高溫滅菌后的干燥載玻片上滴加1滴生理鹽水，用滅菌接種環(huán)挑取少量單個菌落，與生理鹽水混合后均勻涂抹于載玻片上，載玻片反面用酒精燈灼燒以固定，不可時間過長，在固定的細菌上滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，染色1 min后水洗；在菌膜上滴加碘液，作用1 min后水洗；滴加95%酒精脫色15～30 s，水洗；滴加復紅復染1 min，水洗；自然干燥或用紙吸干后在顯微鏡下用油鏡觀察。

1.7 酶觸實驗

在無菌干燥的載玻片上滴加1滴3%的過氧化氫，用無菌棉簽挑取純化細菌滴入過氧化氫溶液中觀察其變化。30 s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡，則判定為陽性，不產(chǎn)生氣泡則判定為陰性。

1.8 血漿凝固酶實驗

向3個無菌EP管中加入1∶4的新鮮兔血漿0.5 mL，管1加入培養(yǎng)24 h的疑似菌株肉湯培養(yǎng)基0.5 mL，管2加入培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌指控菌株肉湯培養(yǎng)基0.5 mL，管3加入滅菌肉湯培養(yǎng)基0.5 mL作為對照。將3只EP管搖勻，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔30 min觀察1次，觀察6 h，檢查是否有凝固出現(xiàn)，將試管傾斜或倒置，呈現(xiàn)凝固狀，則判定為陽性；無凝固現(xiàn)象產(chǎn)生，則判定為陰性。

參芪地黃湯加減治療慢性腎小球腎炎的Meta分析及試驗序貫分析 ………………………………………… 梁家華等（12）：1697

1.9 16S rRNA鑒定

16S rRNA引物為通用引物27F和1492R，引物序列(5′-3′)分別為：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和GGTTACCTTGTTACGACTT。

反應體系與條件：按照Mix說明書，32 μL反應體系：

Mix上游引物下游引物DNA模板ddH2O10 μL1 μL 1 μL 2 μL 18 μL 94 ℃預變性94 ℃變性59 ℃退火 72 ℃延伸72 ℃再延伸5 min 1 min1 min2 min10 minüty??????30個循環(huán)

16S rRNA基因測序：上述PCR產(chǎn)物由六合華大生物有限公司測序，序列與Blast序列比對。

1.10 藥敏試驗

參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的紙片瓊脂擴散法(kirby-bauer，K-B)進行，將金黃色葡萄球菌在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用麥氏比濁管對照濃度，稀釋濃度至1.5×108cfu/mL后(約0.5麥氏濃度)，取100 μL于血平板培養(yǎng)基上后涂布均勻靜置5 min，用無菌鑷子將5片圓形藥敏試紙等距貼在血平板培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)16～18 h，用直尺測量各藥敏試紙片抑菌圈直徑大小并記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果判定：以CLSI標準進行判定，分為耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)3種，每株菌株的藥敏試驗均進行3次重復試驗，抑菌圈大小取3次試驗的平均值后判定耐藥結(jié)果。

1.11 耐藥基因檢測

使用PCR技術(shù)檢測分離出的金黃色葡萄球進行耐藥基因，耐藥基因序列如表2。

表2 耐藥基因引物序列

反應體系與條件：按照Mix說明書，32 μL反應體系：

Mix上游引物下游引物DNA模板ddH2O10 μL1 μL 1 μL 2 μL 18 μL 94 ℃預變性94 ℃變性58 ℃退火 72 ℃延伸72 ℃再延伸5 min 30 s30 s45 s7 minüty??????30個循環(huán)

2 結(jié)果及分析

2.1 金黃色葡萄球菌革蘭氏染色鑒定

革蘭氏染色鑒定結(jié)果如圖1所示，顯示所鑒定菌株為革蘭氏陽性菌，并顯示為符合葡萄球菌的菌體形態(tài)。

圖1 革蘭氏染色后呈紫色葡萄狀

2.2 金黃色葡萄球菌酶觸試驗結(jié)果

酶觸試驗結(jié)果如圖2所示，顯示所鑒定菌株為革蘭氏陽性球菌。

圖2 酶觸反應30 s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡

2.3 血漿凝固酶實驗

血漿凝固酶實驗結(jié)果如圖3所示，顯示所鑒定菌株為葡萄球菌，血漿凝固酶實驗管1和2凝固，對照組管3無凝固現(xiàn)象。

圖3 血漿凝固酶實驗結(jié)果

2.4 金黃色葡萄球菌16S rRNA鑒定

16S rRNA鑒定顯示結(jié)果如圖4所示，所有被鑒定菌株均為金黃色葡萄球菌，序列與Genebank金黃色葡萄球菌序列比對相似度均大于99%。

注：M為Marker；1為陰性對照；2為陽性對照；3～21為樣品。

圖419株金黃色葡萄球菌16SrRNA鑒定結(jié)果

2.5 藥敏試驗結(jié)果及多重耐藥分析

藥敏試驗結(jié)果如表3所示，所選菌株對所有抗生素均表現(xiàn)出S、I和R 3種不同的敏感程度。耐藥譜結(jié)果見表4顯示。

表3 19株金黃色葡萄球菌藥敏試驗結(jié)果

注：R表示耐藥，I表示中介，S表示敏感。

表4 19株金黃色葡萄球菌耐藥譜

某種抗生素的耐藥率定義為對此種抗生素耐藥的菌株數(shù)占試驗菌株總數(shù)的比率，進一步對菌株耐藥率進行探索分析，19株金黃色葡萄球菌對15種抗生素的耐藥率各不相同，其中對青霉素的耐藥率達到89.5%，對紅霉素、慶大霉素均大于50%，對萬古霉素較為敏感，未發(fā)現(xiàn)有耐利福平的菌株(圖5)。

2.6 耐藥基因檢測結(jié)果

對金黃色葡萄球菌的耐藥基因檢測結(jié)果如圖6。

圖5 19株金黃色葡萄球菌耐藥率

5號耐藥基因9號耐藥基因

12號耐藥基因 16號耐藥基因

注：M為DNA marker；數(shù)字1為fexA；數(shù)字2為aac(6′)/aph(2″)；數(shù)字3為tetA；數(shù)字4為Nuc。

圖6金黃色葡萄球菌的耐藥基因檢測結(jié)果

3 討 論

在本次試驗中，共采集了湖南省多地78份樣品，檢測到金黃色葡萄球菌19株，檢出率為24.35%，趙效南等[6]在檢測山東省400多份牛乳樣品中，金黃色葡萄球菌的檢出率為35.8%，分離率明顯高于本試驗。劉保光等[7]對河南省350份牛奶樣品中，分離到80余株金黃色葡萄球菌，分離率達到22.86%，與本試驗的分離率接近；王登峰等人[5]在采集的6個省市1 069份奶樣中，分離了金黃色葡萄球菌219株，分離率為20.49%，提示各地區(qū)的感染情況可能有所差異。19株金黃色葡萄球菌對抗生素的耐藥情況各不相同，所有細菌均呈現(xiàn)多重耐藥，最低為2耐，最高為8耐，3株金黃色葡萄球菌對8種抗生素耐藥。其中，對β-內(nèi)酰胺類抗生素青霉素的耐藥率為89.3%，這與杜琳等[8]檢測5個省市金黃色葡萄球菌提到的青霉素80%的耐藥率保持一致。對紅霉素和慶大霉素的耐藥率大于50%。對萬古霉素普遍敏感，萬古霉素是特殊耐藥抗生素，對耐藥金黃色葡萄球菌有效[9]，但只有經(jīng)過嚴格的審核程序后才可使用，這與OSMAN等[10]在調(diào)查埃及牛奶樣品的耐藥性試驗中，對萬古霉素的耐藥率為9.5%情況相同。未發(fā)現(xiàn)有耐利福平的菌株，可將萬古霉素與利福平聯(lián)合用藥治療金黃色葡萄球菌感染。耐藥情況不同提示可能與各地區(qū)用藥習慣有關(guān)，由于動物飼料中抗菌藥物的過度使用，存在多重抗藥性(MDR)病原體正日益成為目前較嚴重的問題[11]。這也提醒養(yǎng)殖人員應合理選擇用藥，加強對環(huán)境的管理，并繼續(xù)對動物源細菌耐藥進行監(jiān)測，進一步防止動物源耐藥細菌傳播至人類。

試驗共檢測了4種耐藥基因，分別為四環(huán)素耐藥基因TetA、氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)/aph(2″)、喹諾酮類耐藥相關(guān)基因Nuc、氯霉素類抗菌耐藥基因fexA[12]。4株所選菌株均具有氯霉素類抗菌耐藥基因fexA，與藥敏試驗的結(jié)果一致。細菌的耐藥機智形成原因眾多，如藥物捕獲、酶失活和主動外排系統(tǒng)等，最重要的機制細菌運用主動外排系統(tǒng)，將藥物通過外排泵對抗抗生素，金黃色葡萄球菌的外排系統(tǒng)主要包括NorA、NorB、NorC、MsrA、MepA等[13]。在篩選氯霉素耐藥基因fexA的預試驗中，fexA的檢出率低于抗氯霉素藥敏試驗的檢出率，這可能是由于耐藥基因并非唯一決定細菌耐藥性原因。

要做到正確防治金黃色葡萄球菌，避免奶牛乳房炎所造成的損失，首先應該正確使用抗生素，避免濫用、錯用；其次，奶牛場應建立健全的消毒規(guī)范，從源頭防治；最后，在治療方面，中藥對于金黃色葡萄球菌的治療也有相關(guān)報道，王雙雙等[14]研究了黃連等5種中藥對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，對這方面可以進行深入研究。