CNQX拮抗斷尾誘發(fā)小鼠前扣帶回皮質(zhì)神經(jīng)元c-fos基因的表達(dá)

李娜然，商麗宏，楊宇，姚陽(yáng)，吳敏范

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1.機(jī)能與形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心；2.生理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110034）

研究［1-2］表明，截肢手術(shù)后有50%～60%以上的患者伴有幻肢痛（phantom limb pain，PLP）。前扣帶回皮質(zhì)（anterior cingulate cortex，ACC）已被大量的研究［3-4］證明是痛覺的重要中樞，在疼痛感知、認(rèn)知和情緒等關(guān)鍵大腦功能中發(fā)揮重要作用。PLP患者ACC的腦血容量顯著增加，與疼痛強(qiáng)度密切相關(guān)［5］；截肢后大鼠ACC對(duì)外周刺激與中樞刺激的反應(yīng)增強(qiáng)［6］；神經(jīng)元的c-fos基因表達(dá)［7］、NK-1受體［8］、AMPA/Kainate受體［9］與痛覺有關(guān)。目前，PLP的發(fā)病機(jī)理尚不清楚。將小鼠尾末端截?cái)喑Ｓ糜赑LP產(chǎn)生機(jī)制的研究［4］。研究［8］表明，NK-1受體參與斷尾引起小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)的過程。但是，AMPA/Kainate受體是否參與此過程尚未見報(bào)道。因此，本研究采用免疫組化方法探討PLP的產(chǎn)生機(jī)理，為治療PLP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供雌性成年昆明種小鼠36只，體質(zhì)量（27±6）g［動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（遼）2010-0001］。1%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1體質(zhì)量腹腔麻醉小鼠，隨機(jī)均分為6組，每組6只：空白對(duì)照組（不做任何處理）；斷尾（尾末端2.5 cm用剪刀截?cái)啵┖?.5 h組；iv CNQX組（尾靜脈注射1%CNQX 1 mg·kg-1體質(zhì)量后10 min+斷尾后0.5 h）；iv NS組（尾靜脈注射同體積生理鹽水后10 min+斷尾后0.5 h）；ith CNQX組（蛛網(wǎng)膜下腔注射CNQX 10 μg·10 μL-1生理鹽水后10 min+斷尾后0.5 h）；ith NS組（蛛網(wǎng)膜下腔注射同體積生理鹽水后10 min+斷尾后0.5 h）。

1.2 ACC c-fos基因表達(dá)的檢測(cè)

斷尾后0.5 h，將上述各組小鼠斷頭，取腦，置于4 ℃ 4%多聚甲醛中過夜固定。連續(xù)冠狀面-20 ℃冰凍切片，厚度為15 μm，用免疫組化方法常規(guī)染片及洗片等，最后使用樹膠封片。使用顯微圖像分析儀（×400放大倍數(shù)）檢測(cè)切片ACCc-fos陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度（integrated optical density，integrated OD）和面積百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 iv CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的影響

空白對(duì)照組正常小鼠ACC神經(jīng)元有少量c-fos基因表達(dá)，而斷尾后0.5 h小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞OD和面積百分比顯著高于空白對(duì)照組（P＜ 0.01）；iv CNQX拮抗斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞OD和面積百分比與空白對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但顯著低于斷尾后0.5 h組（P＜ 0.01），而ivNS組斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)沒有影響，陽(yáng)性細(xì)胞OD和面積百分比顯著高于空白對(duì)照組及iv CNQX組（P＜ 0.01），見表1，圖1。

2.2 ith CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的影響

表1 尾靜脈或蛛網(wǎng)膜下腔注射CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的影響Tab.1 Effect of iv or ith CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice

圖1 iv CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的影響 ×400Fig.1 Effect of iv CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice ×400

與空白對(duì)照組正常小鼠比較，斷尾后0.5 h小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜ 0.01）；ith CNQX拮抗斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞OD和面積百分比與空白對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05），但是，顯著低于斷尾后0.5 h組（P＜ 0.01），而ith NS組對(duì)斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)沒有影響，陽(yáng)性細(xì)胞OD和面積百分比顯著高于空白對(duì)照組及ith CNQX組（P＜0.01），見表1，圖2。

3 討論

圖2 Ith CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的影響 ×400Fig.2 Effect of ith CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice ×400

c-fos基因及Fos蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的部位與傷害性信號(hào)的傳導(dǎo)、整合分析有關(guān)［7-8］；大鼠截肢后ACC對(duì)外周刺激與中樞刺激的反應(yīng)增強(qiáng)［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，斷尾后0.5 h小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，表明小鼠ACC的神經(jīng)元能接受傷害信號(hào)的傳入，參與斷尾產(chǎn)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性改變。本研究結(jié)果為深入研究PLP提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

PLP是截肢者術(shù)后常見的并發(fā)癥。目前，PLP的發(fā)病機(jī)理尚不明確。NK-1受體、AMPA/Kainate受體與痛覺有關(guān)［8-9］。NK-1受體參與斷尾引起小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)的過程［8］。但是，AMPA/Kainate受體是否參與此過程尚未見報(bào)道。本研究觀察到iv CNQX AMPA/Kainate受體拮抗劑拮抗斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，說明外周AMPA/Kainate受體參與此過程。CNQX不易透過血腦屏障，因此本文深入研究了ith CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)的影響。發(fā)現(xiàn)ith CNQX拮抗了斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的顯著增強(qiáng)，說明中樞AMPA/Kainate受體也參與了此過程，外周與中樞AMPA/Kainate受體可能作為鎮(zhèn)痛藥物治療PLP的候選靶點(diǎn)。