缺氧缺血致腦室周圍白質(zhì)軟化新生大鼠連接蛋白47表達(dá)及其對少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘化的影響

侯阿娜，曲雙雙，富建華

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院兒科，沈陽 110004；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院兒科，沈陽 110016）

近年來，極低和超低出生體質(zhì)量嬰兒的存活率明顯提高，但隨之而來的腦室周圍白質(zhì)軟化（periventricular leukomalacia，PVL）發(fā)病率居高不下［1］。PVL作為早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的最嚴(yán)重形式，已成為影響低出生體質(zhì)量嬰兒日后生存質(zhì)量的主要疾病。我國研究［2］結(jié)果顯示早產(chǎn)兒PVL發(fā)生率為8%～26%，在極低出生體質(zhì)量嬰兒中PVL發(fā)生率為5%～17%，其中74.2%以上發(fā)生腦癱。PVL的病因較為復(fù)雜，目前研究［3-6］認(rèn)為與缺氧缺血（hypoxia ischemia，HI）、全身感染和炎癥反應(yīng)、小膠質(zhì)細(xì)胞活化、興奮性毒性、自由基損害以及大腦白質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes，OLs）自身的發(fā)育易損性等有關(guān)。而HI始終被認(rèn)為是其發(fā)病的主要原因，其病理學(xué)基礎(chǔ)為OLs彌漫性損傷伴髓鞘形成障礙［7-8］。

連接蛋白47（connexin 47，Cx47）是縫隙連接蛋白家族的一員，可通過縫隙連接通道直接介導(dǎo)細(xì)胞間縫隙連接通道（gap junctional intercellular communication，GJIC），參與并影響細(xì)胞死亡過程［9］。Cx47被證實(shí)可形成Cx47/Cx47和Cx47/Cx43等功能性縫隙連接，促使細(xì)胞間營養(yǎng)物質(zhì)、離子、第二信使及小分子（約1×103）等通過，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的形成和損傷修復(fù)中起到關(guān)鍵的作用［10］。Cx47缺乏可引起遺傳性脫髓鞘疾病［11-13］。PARENTI等［12］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cx47廣泛存在于OLs和髓鞘當(dāng)中，既在髓鞘形成早期的發(fā)展過程中，也參與新髓鞘的形成，且在脫髓鞘后髓鞘再生的恢復(fù)階段表達(dá)被上調(diào)。由于PVL的晚期病理結(jié)局主要為OLs彌漫性損傷伴髓鞘形成障礙，Cx47是否參與此階段的髓鞘損傷及修復(fù)，目前尚不清楚。因此，本研究在建立HI致PVL模型的基礎(chǔ)上，動態(tài)監(jiān)測Cx47的表達(dá)變化，旨在闡明Cx47是否與PVL髓鞘的損傷及修復(fù)相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及模型制備

健康清潔級3日齡SD大鼠120只（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供），隨機(jī)均分為HI組（n=60）、對照組（n=60），雌雄不限。按本課題組以往PVL動物模型建立方法［14］，將3日齡SD大鼠吸入性乙醚麻醉，仰臥位顯微鏡下固定，碘伏消毒后，在頸部緊貼氣管右側(cè)切縱形切口（0.5～1.0 cm），分離并用7/0一次性縫合線結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，在結(jié)扎的兩端之間將動脈剪斷，防止結(jié)扎線脫落缺血不徹底，縫合切口，表皮用生理鹽水清洗干凈（手術(shù)時間＜5 min），術(shù)后將新生鼠放入恒溫低氧箱2 h（92%氮?dú)夂?%氧氣混合氣體）；然后返回母鼠身邊飼養(yǎng)。對照組僅分離右側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎也不暴露于低氧中。

1.2 標(biāo)本采集及制備

2組分別于術(shù)后1、3、7、14 d處死大鼠，每個時間分別處死15只。乙醚吸入麻醉后，0.9%生理鹽水左心室灌注，4% 多聚甲醛溶液固定，斷頭取腦，以視交叉為中心前后2 mm取腦組織。分別用于 HE染色、透射電鏡分析、免疫組化和免疫熒光觀察、Western blotting和實(shí)時PCR檢測。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HE染色觀察腦組織形態(tài)：取各時間點(diǎn)腦組織后，4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚4.5 μm。二甲苯、乙醇梯度脫蠟后進(jìn)行HE染色，每組各時間點(diǎn)隨機(jī)抽取6張，每張切片光鏡下（×400）隨機(jī)選取5個腦室周圍腦白質(zhì)視野觀察病理改變。

1.3.2 透射電鏡觀察OLs間縫隙連接超微結(jié)構(gòu)：對照組及HI組大鼠各2只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg）后迅速斷頭取腦，選取腦組織右側(cè)白質(zhì)（1 mm3），置于 2.5%戊二醛 4 ℃保存。1%鋨酸 4 ℃下固定24 h后，用 30%～100%濃度丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片（片厚約50 μm）。切片用醋酸雙氧鈾及硝酸鉛雙重染色后，在JEM-1200Ex透射電鏡（日本Hitachi Electronic公司）下識別具有特殊超微結(jié)構(gòu)特征的OLs及其縫隙連接，觀察OLs間縫隙連接狀態(tài)的超微結(jié)構(gòu)。

1.3.3 免疫組化檢測Cx47、髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）表達(dá)及定位：腦組織石蠟切片常規(guī)脫蠟后，3%過氧化氫溶液室溫處理20 min；標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液進(jìn)行微波修復(fù)；山羊血清室溫封閉30 min；滴加一抗（Cx47 1 ∶200，兔抗大鼠抗體購自美國Santa Cruz公司；MBP 1 ∶300稀釋，兔抗大鼠抗體購自美國Abcam公司）4 ℃過夜；陰性對照以PBS替代一抗。0.01 mol/L PBS洗滌，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG（免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），37 ℃30 min；辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素37 ℃30 min；DAB顯色（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。利用美國 Universal Imaging Porporation圖像分析系統(tǒng)，應(yīng)用MetaMorph軟件，測定平均光強(qiáng)度以表示陽性產(chǎn)物的強(qiáng)度。同時采用連續(xù)切片方法雙標(biāo)Cx47及MBP，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)Cx47及MBP的共定位。

1.3.4 Western blotting測定Cx47、MBP蛋白表達(dá)水平：按照文獻(xiàn)［15］方法，取右側(cè)腦組織50～80 mg，提取蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度。加入細(xì)胞裂解液及緩沖液，加熱變性。各標(biāo)本蛋白（20 μL）上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS -PAGE），轉(zhuǎn)印，Tris鹽酸緩沖液（TBST）漂洗，脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗3次，每次10 min，加一抗Cx47（1 ∶800）、MBP（1 ∶1 000），4 ℃過夜，陰性對照加TBST代替一抗。TBST洗3次，每次10 min，二抗（山羊抗兔1 ∶2 000；山羊抗小鼠 1：2 000購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）工作濃度1 ∶2 000室溫孵育2 h，TBST洗 膜3次，每 次10 min，GAPDH做內(nèi)參各組進(jìn)行對比。最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光（ECL kit；Santa Cruz Biotechnology）顯色。結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)（Chemi Imager 5500 V2.03軟件）進(jìn)行吸光度掃描分析，并用圖像分析系統(tǒng)（Fluor Chen 2.0軟件）對掃描圖像進(jìn)行分析。腦組織內(nèi)的蛋白用平均灰度值表示，蛋白灰度值越高表示蛋白含量越高。

1.3.5 實(shí)時PCR方法測定Cx47、MBP基因表達(dá)：應(yīng)用Trizol-丙酮沉淀法提取RNA，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA［15］。引物由上海生工公司設(shè)計并合成，見表1。采用TaKaRa實(shí)時-染料法（20 μL體系）進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。Cx47mRNA的相對表達(dá)量應(yīng)用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 實(shí)時PCR測定基因表達(dá)引物列表Tab.1 RT-PCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)及行為改變

對照組大鼠一般狀態(tài)反應(yīng)良好，吃奶好，膚色紅潤，生長發(fā)育迅速。而HI組逐漸出現(xiàn)狀態(tài)反應(yīng)差、周身循環(huán)不良、皮膚發(fā)紺、蒼白等表現(xiàn)，隨著低氧時間延長皮膚蒼白逐漸加重，繼而出現(xiàn)煩躁不安，激惹，有時可見四肢抽搐，最終出現(xiàn)嗜睡、大小便失禁等表現(xiàn)，恢復(fù)喂養(yǎng)后癥狀緩解。但隨生長發(fā)育時間的延長，HI組出現(xiàn)明顯活動減少、運(yùn)動不協(xié)調(diào)、睜眼障礙及生長發(fā)育延遲等表現(xiàn)。

2.2 形態(tài)學(xué)變化

光鏡下，對照組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞分布均勻、排列緊密有序，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核圓形、淡染，染色清晰，隨著大鼠日齡的增加細(xì)胞逐漸成熟變大，細(xì)胞形態(tài)更加完整清晰（圖1A、1B、1C、1D）。HI組1 d腦白質(zhì)內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞變形，排列紊亂，少量細(xì)胞出現(xiàn)核固縮（圖1E），手術(shù)后3 d膠質(zhì)細(xì)胞大量壞死，并伴有腦白質(zhì)廣泛結(jié)構(gòu)疏松、紊亂，可呈篩網(wǎng)狀壞死，形成空洞等（圖1F）。與手術(shù)后 3 d比較，手術(shù)后7、14 d溶解壞死細(xì)胞逐漸修復(fù)，腦白質(zhì)病變及壞死區(qū)域明顯減輕，篩網(wǎng)狀損傷基本消失，取而代之的是條索狀、點(diǎn)狀及囊性壞死，最終形成軟化灶（圖1G、1H）。

2.3 腦組織縫隙連接超微結(jié)構(gòu)變化

對照組可見到OLs形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜及核膜明顯，胞核大而清晰，核內(nèi)染色質(zhì)豐富且分布均勻。OLs通過致密的縫隙連接直接相連（圖2A）。與對照組比較，HI組OLs形態(tài)極其不規(guī)則，結(jié)構(gòu)明顯異常，隨損傷加重大量細(xì)胞溶解壞死，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)甚至消失，核染色質(zhì)濃縮、異染，細(xì)胞間縫隙連接斷裂不連續(xù)（圖2B）。

2.4 免疫組化檢測腦組織內(nèi)蛋白的表達(dá)

圖1 各組腦組織形態(tài)學(xué)改變 HE× 400Fig.1 Morphological changes in brain tissue in each group HE× 400

圖2 透射電鏡下觀察HI對少突膠質(zhì)細(xì)胞間縫隙連接通道的影響× 8 000Fig.2 The effect of HI on oligodendrocyte gap junctions observed under a transmission electron microscope × 8 000

2.4.1 免疫組化檢測腦組織內(nèi)Cx47的表達(dá)：對照組手術(shù)后1 d Cx47在腦組織中即有表達(dá)，并隨日齡增加染色呈大量棕黃色（圖3A、3B、3C、3D），隨著日齡增加Cx47表達(dá)量也增加；HI組手術(shù)后1、3、7、14 d腦組織中Cx47表達(dá)雖呈上升趨勢，但相同時間點(diǎn)的表達(dá)均較對照組明顯減少。手術(shù)后3、7 d Cx47的表達(dá)減少尤為明顯（圖3F、3G）；而在14 d 2組Cx47表達(dá)差異開始縮?。▓D3H）。

圖3 免疫組化檢測腦組織內(nèi)Cx47的表達(dá)× 200Fig.3 Immunohistochemical analysis of Cx47 expression in brain tissue × 200

2.4.2 免疫組化MBP的定位及表達(dá)：對照組及HI組手術(shù)后1 d腦室周圍白質(zhì)MBP陽性細(xì)胞表達(dá)較少，隨著日齡的增加其表達(dá)升高。14 d時MBP廣泛表達(dá)于OLs胞質(zhì)及軸突突起上，半定量結(jié)果顯示HI組MBP的表達(dá)較對照組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組手術(shù)后1、14 d腦組織MBP表達(dá)隨著日齡增加而增加，由1 d的胞質(zhì)表達(dá)到14 d的廣泛細(xì)胞間隙突起的表達(dá)。HI組MBP的表達(dá)趨勢與對照組相同，但相同時間點(diǎn)較對照組表達(dá)降低，HI組細(xì)胞突起明顯減少。見圖4。

2.5 新生大鼠腦組織中Cx47蛋白表達(dá)（表2、圖5）

通過Western blotting檢測腦組織中Cx47的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Cx47蛋白表達(dá)在對照組及HI組均隨著日齡的增長逐步增加（P＜ 0.01）。但2組間比較，HI組手術(shù)后3、7、14 dCx47蛋白水平較對照組明顯減少（P＜ 0.01）。

圖4 免疫組化定位MBP的表達(dá)× 200Fig.4 Immunohistochemical detection of MBP expression × 200

表2 2組Cx47蛋白和mRNA表達(dá)水平比較Tab.2 The expression levels of Cx47 protein and mRNA in the two groups

圖5 各組手術(shù)后腦組織Cx47蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of Cx47 protein in brain tissue after surgery

2.6 腦組織Cx47基因表達(dá)水平

實(shí)時PCR檢測腦組織Cx47mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)對照組和HI組在術(shù)后第1天即出現(xiàn)Cx47mRNA表達(dá)，并隨著日齡增加Cx47mRNA水平逐漸增加（P＜0.01）。對照組Cx47mRNA出現(xiàn)高表達(dá)先快后慢，直到術(shù)后14 d達(dá)到高峰（P＜ 0.01）。2組間比較，HI組Cx47mRNA的表達(dá)水平在1、3、7、14 d均較對照組明顯降低（均P＜ 0.01）。見表2。

3 討論

OLs的主要功能是包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結(jié)構(gòu)、協(xié)助神經(jīng)電信號的跳躍式高效傳遞，維持和保護(hù)神經(jīng)元的正常功能。而PVL的主要病理改變就是OLs的彌漫性損傷伴髓鞘形成障礙［12］，OLs對HI高度敏感，HI時未成熟OLs易受到氧化應(yīng)激等損傷，導(dǎo)致其壞死以及成熟分化障礙。損傷后的OLs不能包裹軸突形成髓鞘，進(jìn)而導(dǎo)致PVL的發(fā)生［7，17］。

縫隙連接可以直接連接相互耦聯(lián)細(xì)胞的胞質(zhì)，參與細(xì)胞間物質(zhì)、能量交換和信息傳遞［12，18］。近幾年來CJIC作為新興的膜蛋白通道被廣泛關(guān)注，在脊椎動物中幾乎所有分化細(xì)胞都是通過縫隙連接來交流的，包括血紅細(xì)胞、精子、成人骨骼肌、心肌、平滑肌細(xì)胞、胃腸道上皮細(xì)胞、腦神經(jīng)細(xì)胞等［19］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種疾?。撍枨始膊?、癲癇、膠質(zhì)瘤、腦缺血缺氧性損傷等）均證實(shí)與GJIC有關(guān)［20］。縫隙連接蛋白是由多基因家族編碼的一大類膜蛋白，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有15種。其中Cx47表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘，Cx47基因突變會引起MBP的表達(dá)降低，從而導(dǎo)致腦白質(zhì)異常損傷的脫髓鞘疾病［13，21］。

本研究結(jié)果表明，新生大鼠受到HI損傷后會出現(xiàn)行為、運(yùn)動、發(fā)育等方面的異常表現(xiàn)。大腦組織病理顯示隨著損傷的加重腦組織出現(xiàn)細(xì)胞凋亡壞死，腦組織篩網(wǎng)狀及空洞形成，進(jìn)而形成軟化。在透射電鏡下看到正常腦組織OLs間縫隙連接呈現(xiàn)連續(xù)致密的連接，細(xì)胞間通道關(guān)閉狀態(tài)，而受到HI損傷后OLs間呈間斷不連續(xù)的縫隙連接。與對照組比較，HI組腦組織中Cx47表達(dá)從術(shù)后1 d開始較對照組減少，2組間差異隨HI時間延長而更加明顯。同時免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)HI組腦組織中MDP表達(dá)也較對照組減少。Cx47廣泛存在于OLs和髓鞘中，在髓鞘形成早期的發(fā)展過程中參與新髓鞘的形成［12］，HI后腦組織中Cx47表達(dá)下降與OLs及髓鞘損傷一致，甚至比髓鞘損傷出現(xiàn)更早，這表明在HI致新生大鼠PVL中Cx47的表達(dá)下調(diào)可能引起OLs的損傷及髓鞘化障礙，從而導(dǎo)致髓鞘的發(fā)育延遲。

綜上所述，HI條件下新生大鼠髓鞘發(fā)育成熟障礙，OLs間縫隙連接開放，腦組織中Cx47表達(dá)減少，提示Cx47可能對GJIC功能起到調(diào)控作用，并影響髓鞘發(fā)育。其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索，并可能成為PVL治療的新靶點(diǎn)。