表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株CaSki增殖、凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響觀察

吳宗妍，劉小敏，李金鴿

1 陜西省安康職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西安康 725000；2西北婦女兒童醫(yī)院

宮頸癌是威脅婦女健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，近年來(lái)死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，其發(fā)病高峰年齡為40～60歲[1]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)是綠茶中最主要的活性成分，具有抗氧化、保護(hù)心血管、神經(jīng)和抗病毒等作用，并且具有有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用[2～4]。2018年3月～2019年7月，本研究觀察了EGCG對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株CaSki增殖、凋亡的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人宮頸癌細(xì)胞株CaSki、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自武漢博士德公司，EGCG、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，青霉素-鏈霉素(100×)溶液、胰酶細(xì)胞消化液購(gòu)自碧云天公司，AnnexinV-FITC/PI染色試劑盒購(gòu)自中國(guó)艾美捷科技公司，TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自天根公司。酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，熒光定量分析儀購(gòu)自瑞士羅氏公司。

1.2 細(xì)胞分組及EGCG給予 CaSki細(xì)胞采用內(nèi)含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CaSki細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度(5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L)的EGCG溶液和5%胎牛血清培養(yǎng)液，記為5 mg/L組、10 mg/L組、20 mg/L組、40 mg/L組；對(duì)照組加入等體積的5%胎牛血清完全培養(yǎng)液。

1.3 各組細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算 采用MTT法。取各組CaSki細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，加入濃度為5 mg/mL 的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔波長(zhǎng)為490 nm處的光密度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 取各組CaSki細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后，吸棄上清液，4 ℃的PBS清洗細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，取0.5 mL細(xì)胞懸液于1.5 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，按照AnnexinV-FITC/PI染色試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因半胱天冬氨酸酶-3(Caspase-3)、P53、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax) mRNA檢測(cè) 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法。取各組細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板、以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火32 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：Caspase-3上游引物為5′-GAAATTGTGGAATTGATGCGTGA-3′，下游引物為5′-CTACAACGATCCCCTCTGAAAAA-3′；P53上游引物為5′-TCCTCCCCAACATCTTATCC-3′，下游引物為5′-GCACAAACACGAACCTCAAA-3′；Bax上游引物為5′-ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3′，下游引物為5′-TGTCCAGCCCATGATGGTTC-3′；Bcl-2上游引物為5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC′-3′，下游引物為5′-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3′；GAPDH上游引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 5 mg/L組、10 mg/L組、20 mg/L組、40 mg/L組、對(duì)照組CaSki細(xì)胞作用48 h后，細(xì)胞增殖抑制率分別為5.14%±0.54%、15.42%±1.22%、27.16%±2.11%、40.51%±1.57%、0，組間相比，P均<0.05。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 5 mg/L組、10 mg/L組、20 mg/L組、40 mg/L組、對(duì)照組CaSki細(xì)胞作用48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為1.95%±0.21%、5.39%±1.54%、15.14%±2.12%、27.46%±3.50%、0.74%±0.21%，組間相比，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組相比，﹡P<0.05；與5 mg/L組相比，﹟P<0.05；與10 mg/L組相比，△P<0.05；與20 mg/L組相比，▲P<0.05。

3 討論

由于中國(guó)人群經(jīng)濟(jì)、文化等分布不平衡，人們對(duì)宮頸癌的預(yù)防、早診、早認(rèn)識(shí)不足，導(dǎo)致其發(fā)病率和死亡率逐年升高。目前研究[5]發(fā)現(xiàn)，EGCG對(duì)人鼻咽癌、膀胱癌、黑色素瘤細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌等惡性腫瘤的腫瘤細(xì)胞中具有一定促凋亡、抑增殖效果。但EGCG對(duì)宮頸癌的作用研究甚少，抑癌的機(jī)制尚不清楚。

EGCG是茶葉的主要活性物質(zhì)。EGCG的抗癌機(jī)制主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面[6]：①抑制蛋白激酶B(PKB)活性，下調(diào)細(xì)胞形成因子(IL-8)、金屬蛋白酶類(MMPs)，抗腫瘤血管形成；②調(diào)節(jié)周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依賴性激酶(CDKs)，影響癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖；③抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子中激活子蛋白-1(AP-1)、核因子(NF-κB)等，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡；④調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的信號(hào)通路，如PI3K/Akt通路、酪蛋白激酶(CK2)通路、受體絡(luò)氨酸激酶(PTKs)受體通路等，影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。本研究將不同濃度的EGCG作用于人宮頸癌CaSki細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EGCG可明顯抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，且EGCG對(duì)CaSki細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用存在一定的濃度依賴性。

細(xì)胞凋亡調(diào)控的失衡可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。線粒體凋亡是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一，參與線粒體凋亡途徑的主要蛋白有：Caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白、細(xì)胞色素C蛋白、凋亡誘導(dǎo)因子AIF蛋白等。本研究進(jìn)一步研究了EGCG作用CaSki細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑有關(guān)的Caspase-3、Bax、Bcl-2基因和人體抑癌P53基因的變化。有研究[7]證實(shí)，Caspase-3蛋白是凋亡過(guò)程中主要執(zhí)行蛋白之一。Caspase-3在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以非活化形式存在，當(dāng)Caspase-3活化后，可以發(fā)揮切斷肽鏈作用，令細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白酶失活，導(dǎo)致細(xì)胞功能和形態(tài)發(fā)生變化使細(xì)胞凋亡。Caspase-3活化的一條途徑為：細(xì)胞內(nèi)死亡配體與相對(duì)應(yīng)的死亡受體結(jié)合形成三聚體，并暴露死亡受體的死亡結(jié)構(gòu)域，激活Caspase-8或Caspase-10，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3；另一條途徑為細(xì)胞受到死亡刺激時(shí)，線粒體釋放細(xì)胞色素C(cyto-C)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等，進(jìn)而活化Caspase-3[8]。BCL-2家族參與線粒體凋亡途徑。抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2基因與促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax基因相拮抗，影響線粒體膜通透性和膜電位，并調(diào)節(jié)Caspase家族蛋白，從而調(diào)控細(xì)胞的凋亡[9]。本研究通過(guò)qPCR檢測(cè)線粒體相關(guān)基因表達(dá)量的結(jié)果顯示，不同濃度的EGCG作用CaSki細(xì)胞能有效上調(diào)Caspase-3、Bax基因，下調(diào)Bcl-2基因，使CaSki細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑發(fā)生凋亡，這與Moradzadeh等[10]學(xué)者在急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞體外研究結(jié)果一致。人體抑癌P53基因是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以上調(diào)Bax的表達(dá)水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)共同完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[11]。本研究結(jié)果表明，EGCG對(duì)CaSki細(xì)胞的凋亡具有調(diào)控作用，即通過(guò)線粒體凋亡途徑及抑癌P53基因的表達(dá)調(diào)節(jié)共同作用促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，綠茶多酚中最主要的活性成分EGCG可抑制CaSki細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡；EGCG誘導(dǎo)CaSki細(xì)胞凋亡的作用與上調(diào)Caspase-3、P53、Bax基因、下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)有關(guān)。EGCG廣泛的藥理作用較為復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。