HPLC測(cè)定遠(yuǎn)志堿水解8個(gè)成分含量△

趙夢(mèng)君，李晨晨，甘龍，潘瑞樂(lè)

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

本研究結(jié)合遠(yuǎn)志化學(xué)成分特點(diǎn)，認(rèn)為有機(jī)酸和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量可以間接反映遠(yuǎn)志中糖酯類(lèi)成分和皂苷類(lèi)成分的含量，故將遠(yuǎn)志水解后進(jìn)行分析，建立了遠(yuǎn)志堿水解8個(gè)主要成分的含量測(cè)定方法，為遠(yuǎn)志的質(zhì)量控制提供了新的思路。

1 材料

1.1 儀器

Waters公司高效液相色譜儀，包括：waters e2695泵、waters 2489 紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器、empower 2色譜工作站、waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器；JA2103N電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；JM-A30001電子天平(余姚紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KQ250B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；FW135中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；OSB-2100 EYELA油浴鍋及N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷購(gòu)自成都埃法生物技術(shù)有限公司(批號(hào)分別為：AF7112017、AF8081707、AF7062102、AF7112632、AF8121702、AF8122101、AF8121802、AF8091003，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)；甲醇、乙腈色譜純(美國(guó)fisher公司)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；其余試劑均為分析純。

10批遠(yuǎn)志來(lái)源見(jiàn)表1，除樣品8為野生品外，其余均為栽培品，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld.。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

采用Waters公司高效液相色譜儀，包括：waters e2690泵、waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器、empower 2色譜工作站，分別對(duì)遠(yuǎn)志水解產(chǎn)物8個(gè)成分在190～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，掃描結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，對(duì)羥基苯甲酸(1)最大吸收波長(zhǎng)是256 nm，對(duì)羥基肉桂酸(2)最大吸收波長(zhǎng)310 nm，芥子酸(3)最大吸收波長(zhǎng)是323、238 nm，阿魏酸(4)的最大吸收波長(zhǎng)是323 nm，苯甲酸(5)的最大吸收波長(zhǎng)是196、230 nm，3，4，5-三甲氧基肉桂酸(6)最大吸收波長(zhǎng)是231、304 nm，對(duì)甲氧基肉桂酸(7)的最大吸收波長(zhǎng)是309 nm，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷(8)只在210 nm附近有末端吸收。綜合考慮8個(gè)化合物的吸收特征，本研究選擇210 nm作為對(duì)羥基苯甲酸、苯甲酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的檢測(cè)波長(zhǎng)，310 nm作為對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 遠(yuǎn)志堿水解8個(gè)測(cè)定成分的結(jié)構(gòu)式

表1 遠(yuǎn)志藥材產(chǎn)地信息

2.2 色譜條件

YMC-Pack ODS-A(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相乙腈(A)-0.05 %磷酸-水溶液(B)，梯度洗脫(0～6 min，20%～22%A；6～8 min，22%A；8～10 min，22%～25%A；10～14 min，25%～28%A；14～30 min，28%～36%A；30～33 min，36%～38%A)；流速為1 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210和310 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

上述色譜條件下8個(gè)成分在33 min內(nèi)與其他共存峰均達(dá)到基線分離，色譜圖見(jiàn)圖3，8個(gè)測(cè)定成分的理論塔板數(shù)均>10 000。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷適量，分別置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到對(duì)羥基苯甲酸0.255 g·L-1、對(duì)羥基肉桂酸0.520 g·L-1、芥子酸0.490 g·L-1、阿魏酸0.513 g·L-1、苯甲酸0.546 g·L-1、3，4，5-三甲氧基肉桂酸0.520 g·L-1、對(duì)甲氧基肉桂酸0.521 g·L-1、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷0.785 g·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取各對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL混合定容至10 mL，得到混合對(duì)照品溶液。

注：1.對(duì)羥基苯甲酸；2.對(duì)羥基肉桂酸；3.芥子酸；4.阿魏酸；5.苯甲酸；6.3，4，5-三甲氧基肉桂酸；7.對(duì)甲氧基肉桂酸；8.細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷。圖2 遠(yuǎn)志堿水解8個(gè)測(cè)定成分全波長(zhǎng)(190～400 nm)紫外光譜掃描圖

注：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液。圖3 遠(yuǎn)志堿水解產(chǎn)物在210、310 nm波長(zhǎng)的HPLC圖

2.3.2 供試品溶液 稱取樣品粉末(過(guò)3號(hào)篩)1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL，置圓底燒瓶中，蒸干，殘?jiān)?0%氫氧化鈉溶液50 mL加熱回流2 h，放冷，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4～5，用水飽和正丁醇提取3次，每次 50 mL，合并正丁醇液，回收正丁醇液至干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 將2.3.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋成1、2、4、8、16、32倍數(shù)濃度的溶液，搖勻，分別取10 μL注入高效液相色譜儀，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，混合對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和r，見(jiàn)表2。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.3.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷8個(gè)成分的峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果8個(gè)成分的RSD分別為0.30%、0.40%、0.30%、0.30%、0.20%、0.30%、0.40%、0.30%，表明分析方法和儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一遠(yuǎn)志樣品，按2.3.2項(xiàng)下制備成供試品溶液，在室溫下放置后于0、2、4、8、12、24、48、72 h，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的峰面積，8種成分峰面積的RSD分別為0.40%、0.60%、0.40%、0.40%、0.40%、0.50%、0.60%、0.30%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一遠(yuǎn)志樣品6份，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的峰面積，計(jì)算各單位峰面積，結(jié)果8成分的單位峰面積RSD分別為3.36%、2.01%、3.25%、2.06%、2.47%、1.72%、3.71%、4.12%，RSD均小于4.12%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 最低定量限(LOQ)和最低檢測(cè)限(LOD) 根據(jù)《中國(guó)藥典》中“9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”，以信噪比10∶1時(shí)待測(cè)物質(zhì)的最低濃度或量為定量限，以信噪比為3∶1時(shí)待測(cè)物質(zhì)的最低濃度或量為檢測(cè)限。將2.3.1項(xiàng)下對(duì)照品稀釋至一定倍數(shù)，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，最終得出對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的LOQ分別為：0.032、0.065、0.061、0.064、0.068、0.033、0.033、12.266 μg·mL-1，LOD分別為：0.016、0.033、0.015、0.016、0.034、0.016、0.016、6.132 μg·mL-1。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取對(duì)照品對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷各適量，得到質(zhì)量濃度分別為1.848、1.238、0.964、0.934、0.382、1.09、1.964、3.836 g·L-1的對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷溶液。

取6份遠(yuǎn)志粉末，每份0.3 g，精密稱定，分別置于250 mL圓底燒瓶中，精密加入2.4.6項(xiàng)下所配制的對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸溶液各1 mL，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷溶液2 mL，用70%甲醇補(bǔ)足至50 mL，按2.3項(xiàng)下方法制成加標(biāo)供試品溶液，依2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各成分的平均加樣回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。8個(gè)測(cè)定成分的平均回收率分別為：102.36%、102.50%、94.74%、104.95%、94.84%、101.22%、97.69%、96.24%；RSD分別為：1.62%、1.82%、1.44%、1.09%、2.62%、1.62%、2.75%、2.48%，平均回收率為94.74%～104.95%，RSD在1.09%～2.75%(n=6)，結(jié)果表明本法的準(zhǔn)確性良好。

表2 遠(yuǎn)志8個(gè)水解產(chǎn)物的線性方程和線性范圍(n=6)

表3 遠(yuǎn)志8個(gè)水解產(chǎn)物的加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

2.5 樣品測(cè)定

精密稱取表1中的10批遠(yuǎn)志粉末，按2.3.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，依2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算其含量，對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.02%～0.09%、0.20%～0.41%、0.25%～0.70%、0.18%～0.39%、0.19%～0.40%、0.05%～0.68%、0.28%～0.36%、1.77%～4.07%，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 遠(yuǎn)志8個(gè)水解產(chǎn)物含量測(cè)定結(jié)果(n=3) %

3 討論

3.1 測(cè)定指標(biāo)的選擇

遠(yuǎn)志皂苷主要為五環(huán)三萜型，基本母核為齊墩果烷，苷元有遠(yuǎn)志皂苷元(presenegenin)、2β-羥基-23-醛基齊墩果酸(polygalagenin)、2β-23-二羥基齊墩果酸(bayogenin)等。苷元的區(qū)別在于2位碳取代基不同(羥基或酮基)，23位碳氧化度不同(甲基、醛基、羥甲基、羧基或亞甲基)，雙鍵的數(shù)量和位置的差異。遠(yuǎn)志皂苷元是最主要的類(lèi)型，其皂苷類(lèi)型多為3-O苷和28位酯苷。皂苷糖鏈存在一定的酯化結(jié)構(gòu)，主要取代基有4-甲氧基肉桂酰基、3，4，5-三甲氧基肉桂酰基、乙?；萚20]。遠(yuǎn)志寡糖酯成分以蔗糖為共同的母核，寡糖母核通常以1個(gè)果糖與2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)葡萄糖連接而成。蔗糖酯多以果糖的3位羥基和葡萄糖的6位羥基與各種?；甚?，寡糖酯則在糖環(huán)上的不同部位發(fā)生不同程度的酯化。遠(yuǎn)志糖酯主要取代基有：苯甲酰基、對(duì)羥基苯甲酰基、肉桂酰基、對(duì)甲氧基肉桂?；萚21]。

從遠(yuǎn)志皂苷和糖酯的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和取代基種類(lèi)可以看出，遠(yuǎn)志皂苷堿水解的主要產(chǎn)物有：葡萄糖、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷；遠(yuǎn)志糖酯堿水解主要產(chǎn)物有：乙酸、苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、苯丙烯酸等。結(jié)合化合物紫外吸收特征和對(duì)照品色譜保留時(shí)間，筆者從遠(yuǎn)志堿水解產(chǎn)物中鑒定出了對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、反式肉桂酸和3，4-二甲氧基肉桂酸10個(gè)主要成分，由于反式肉桂酸和3，4-二甲氧基肉桂酸含量較低，本研究選擇對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷8個(gè)成分進(jìn)行分析。

3.2 堿水解后有機(jī)酸和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量與遠(yuǎn)志中糖酯和皂苷含量的關(guān)系

遠(yuǎn)志糖酯類(lèi)成分是遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志科其他植物中存在的獨(dú)特化學(xué)成分，隨著對(duì)遠(yuǎn)志科植物研究的不斷深入，糖酯類(lèi)成分逐漸引起了人們的關(guān)注。該類(lèi)成分具有腦保護(hù)、抗抑郁、抗老年癡呆等作用[22-23]。因此遠(yuǎn)志糖酯類(lèi)成分的含量是評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志質(zhì)量的重要指標(biāo)。但《中國(guó)藥典》僅對(duì)3，6′-二芥子酰基蔗糖1個(gè)糖酯的含量進(jìn)行測(cè)定。遠(yuǎn)志糖酯成分非常復(fù)雜，單個(gè)成分的含量不能完全反應(yīng)遠(yuǎn)志糖酯的總含量。本研究測(cè)定的堿水解7個(gè)有機(jī)酸，主要來(lái)自糖酯的水解，這些有機(jī)酸含量的總和可以間接反映遠(yuǎn)志糖酯含量情況。由于遠(yuǎn)志皂苷元是遠(yuǎn)志皂苷的最主要的苷元，因此，遠(yuǎn)志皂苷堿水解得到的次級(jí)皂苷細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷(tenuifolin)的含量也可間接反映遠(yuǎn)志皂苷含量。故本研究的測(cè)定方法及結(jié)果，可以為遠(yuǎn)志質(zhì)量控制提供一種新的思路和方法。

3.3 不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志藥材堿水解含量結(jié)果分析

中藥材成分復(fù)雜，其質(zhì)量受不同基原、產(chǎn)地、種植方式、生長(zhǎng)年限及采收季節(jié)等多種因素的影響。據(jù)報(bào)道，不同季節(jié)采收的遠(yuǎn)志藥材其原型成分3，6′-二芥子?；崽呛坎町愝^大[24]。本研究利用建立的方法對(duì)10批不同來(lái)源遠(yuǎn)志藥材堿水解8個(gè)成分含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示不同樣品中各成分含量存在明顯差異。其中3，4，5-三甲氧基肉桂酸成分差異最大，0.05%～0.68%，相差13.6倍，原因可能與遠(yuǎn)志糖酯的水解產(chǎn)物和其他酯類(lèi)均包含此成分有關(guān)?！吨袊?guó)藥典》中遠(yuǎn)志指標(biāo)成分細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.77%～4.07%，最高和最低相差2.3倍。與《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)比較，針對(duì)細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷這一成分，10批測(cè)定樣品中有4批不達(dá)標(biāo)，涉及市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)與產(chǎn)地采收2種來(lái)源，這提示我們市場(chǎng)藥材質(zhì)量控制手段還有待提高，遠(yuǎn)志藥材使用應(yīng)嚴(yán)格注意產(chǎn)地選擇。

3.4 其他

關(guān)于樣品制備，樣品制備過(guò)程中應(yīng)注意萃取環(huán)節(jié)，一定要萃取到樣品無(wú)色透明，本研究均萃取3次；另外對(duì)色譜條件的確定，研究過(guò)程中比較了不同色譜柱、不同洗脫梯度、不同流速、不同柱溫等多個(gè)影響因素，最終確定了正文2.2項(xiàng)下色譜條件。

遠(yuǎn)志作為常用中藥，成分復(fù)雜，質(zhì)量控制難度較大。本研究采用堿水解法，將遠(yuǎn)志中復(fù)雜但又具有較好活性的皂苷類(lèi)成分和糖酯類(lèi)成分水解為相對(duì)簡(jiǎn)單的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、芥子酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸等簡(jiǎn)單小分子有機(jī)酸，并首次建立高效液相色譜測(cè)定包括細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷在內(nèi)的8個(gè)堿水解成分含量的方法。該法簡(jiǎn)便、快速，具有較高的準(zhǔn)確度與精密度，且重復(fù)性好，能夠有效地測(cè)定遠(yuǎn)志藥材中主要水解產(chǎn)物的含量，為遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量控制提供了新思路。