水提取法和仿生提取法研究菲牛蛭不同炮制品的體外抗凝活性△

鐘苗，雷艷，譚赫，王雄飛，侯覺文，謝海林，單宇，袁瑞娟*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.廣西復(fù)鑫益生物科技有限公司，廣西 南寧 530000；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

水蛭別名螞蟥，是我國傳統(tǒng)的動物類藥材，具有破血通經(jīng)、逐瘀消癥等功效。藥理學(xué)研究表明，水蛭具有抗凝血、溶血栓、抗腫瘤、抑制腫瘤細胞凋亡等作用，其中抗凝作用為其主要藥理作用。我國水蛭的品種有上百種，2015年版《中華人民共和國藥典》(一部)收錄了螞蟥(寬體金線蛭)、水蛭和柳葉螞蟥3種，其中臨床應(yīng)用較多的品種是寬體金線蛭[1]。廣西、云南的地方標準中收錄了菲牛蛭，研究發(fā)現(xiàn)其抗凝血活性遠高于寬體金線蛭[2]。為達到矯臭祛味、易于粉碎、緩性減毒的目的，水蛭常經(jīng)過炮制后入藥，炮制方法多為滑石粉燙制、酒炙。但現(xiàn)代研究表明，水蛭的活性成分為蛋白多肽類，如水蛭素、菲牛蛭素等[3-6]，高溫炮制使水蛭蛋白類有效成分空間結(jié)構(gòu)改變，變性失活。大量的研究數(shù)據(jù)表明，經(jīng)炮制后，水蛭的水溶性蛋白大幅度降低，而且炮制溫度越高，藥效損失越大[7-11]。但這些研究通常采用水提取法，而水蛭通常以口服形式給藥，在胃腸道消化酶作用下，蛋白質(zhì)多肽類成分易被降解失活，因此在體內(nèi)發(fā)揮抗凝溶栓藥效的成分與水提取出的成分未必一致。本課題組曾采用水提取法和仿生提取法分別研究寬體金線蛭不同炮制品的體外抗凝活性，結(jié)果表明采用水提取法時，炮制后抗凝活性降低；而采用仿生提取法時，炮制后抗凝活性反而升高，由于仿生提取法與人體的吸收過程更為接近，因此筆者認為炮制有其科學(xué)性[12]。對于抗凝活性更高的菲牛蛭，目前對于其炮制前后抗凝活性變化的研究較少。因此本課題組利用仿生酶解及水提取的方法提取菲牛蛭及其炮制品的活性成分，測定多個凝血指標的變化，科學(xué)評價不同炮制方式對菲牛蛭抗凝活性的影響。

1 材料

1.1 儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(北京世紀予華儀器有限公司)；METTLER TOLEDO 實驗室pH計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；LG-PABER-I半自動凝血分析儀(北京世帝科學(xué)儀器公司)；UH5300雙光束紫外-分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試藥

菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)活體，由廣西復(fù)鑫益集團有限公司提供，冷凍干燥或吊干后使用，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定系楊瑤珺教授鑒定為菲牛蛭；滑石粉(北京市雙橋燕京中藥飲片廠，批號：1608009)；黃酒(五年陳釀·清爽型黃酒，湖州老恒河釀造有限公司)；胃蛋白酶(1∶10 000，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號：9001756)；胰蛋白酶(1∶250，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號：9002077)；活化部分凝血酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司)；福林酚試劑(F8060，北京索萊寶科技有限公司)；比伐盧定(上海源葉生物科技有限公司)；濃鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀、95%乙醇、85%磷酸等為分析純；實驗用水為娃哈哈純凈水。

雄性健康大耳白兔，質(zhì)量2 kg，動物許可證號為SCXK(京)2017-0005，符合國家健康一級動物標準。

2 方法

2.1 菲牛蛭的炮制

2.1.1 活體凍干品 菲牛蛭冷凍干燥后，粉碎，過三號篩，-20 ℃密封保存，備用。

2.1.2 清水吊干品凈制 取菲牛蛭活體，清水洗凈表面附著物，置于陽光下暴曬至干后，粉碎，過三號篩，-20 ℃密封保存，備用。

2.1.3 滑石粉燙制 參照文獻[12]進行。

2.1.4 酒浸悶烘 參照文獻[12]進行。

2.2 菲牛蛭活性成分的提取

2.2.1 仿生提取法 參照文獻[12]，修改后進行。取9 mL濃HCl，加水定容至1000 mL，制得人工胃液。取10 mL人工胃液加入適量胃蛋白酶(酶底比1.25%)并攪拌均勻，分別加入菲牛蛭各樣品粗粉0.40 g(測定抗凝血酶活性時，取15 mL人工胃液加入各樣品粗粉0.50 g，其余操作同)，置37 ℃恒溫磁力攪拌器中攪拌3 h；用濃度為1 mol·L-1的NaOH溶液將溶液pH調(diào)至6.80(胰蛋白酶生理條件，加入NaOH的體積對溶液濃度的影響可忽略不計)，再加入適量胰蛋白酶(酶底比7.5%)，攪拌均勻，37 ℃條件下磁力攪拌2 h；取出樣品，85 ℃水浴滅活15 min，冷卻至室溫；15 000 r·min-1離心20 min(離心半徑為10 cm)，取上清液用空白酶解液(除不加水蛭粗粉外，其余操作相同)稀釋9倍后，備用。

2.2.2 水提取法 取4個樣品粗粉各0.40 g加至10 mL去離子水中(測定抗凝血酶活性時，取菲牛蛭及其炮制品粗粉0.50 g加至15 mL去離子水中，其余操作相同)，室溫條件下磁力攪拌5 h，15 000 r·min-1(離心半徑為10 cm)離心后分取上清液，用去離子水稀釋9倍后，備用。

2.3 抗凝活性測定

2.3.1 血漿制備 向健康兔耳緣靜脈注射烏拉坦致其麻醉，頸動脈取血至裝有質(zhì)量濃度為3.8%的枸櫞酸鈉抗凝劑(9∶1)的離心管中，混勻，立即4000 r·min-1離心15 min(離心半徑為10 cm)，取得貧血小板血漿(PPP)，備用。

2.3.2 APTT測定 參照試劑盒測試說明進行，將上述PPP、菲牛蛭各樣品溶液、APTT試劑加入測試杯中，記錄下血漿凝固時的APTT，并記錄空白參比的APTT(水提法中以水為空白參比，仿生提取法中以空白酶解液為空白參比)。

2.3.3 PT測定 參照試劑盒測試說明進行，將上述PPP、菲牛蛭各樣品溶液、PT試劑加入測試杯中，血漿凝固時記錄下其PT，并記錄空白參比的PT。

2.3.4 TT測定 參照試劑盒測試說明進行，將上述PPP、菲牛蛭各樣品溶液、TT試劑加入測試杯中，血漿凝固時記錄下其TT，并記錄空白參比的TT。

2.4 蛋白質(zhì)含量的測定

2.4.1 堿性銅試液的制備 將10 g氫氧化鈉、50 g碳酸鈉，溶于400 mL水中，作為甲液；另取酒石酸鉀0.5 g，溶于50 mL水中，得A液；取硫酸銅0.25 g，溶于30 mL水中，得B液；將A、B液混合作為乙液。臨用前，合并甲、乙液，加水定容至500 mL。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱定比伐盧定2.00 mg，加水定容至10 mL，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.2 g·L-1的比伐盧定對照品溶液，備用。

2.4.3 標準曲線的制作 參照《中華人民共和國藥典》四部通則項下的蛋白質(zhì)含量測定法第二法中測定法進行，以對照品溶液濃度與其相對應(yīng)的吸光度做標準曲線，計算線性回歸方程。

2.4.4 菲牛蛭及其炮制品的蛋白含量測定 另精密量取各樣品溶液(稀釋21倍)1 mL，同法測定吸光度。其中水提取法以水為空白對照，仿生提取法以空白酶解液為空白對照。

2.5 抗凝血酶活性測定

2.5.1 三羥甲基氨基甲烷鹽酸 (Tris-HCl) 緩沖液的配制 取0.2 mol·L-1的Tris溶液25 mL與0.1 mol·L-1HCl溶液40 mL，混合搖勻，加水定容至100 mL，將溶液pH調(diào)至7.40。

2.5.2 抗凝血酶活性測定 取100 μL稀釋4倍的樣品上清液置試管中，加入臨用新配的含纖維蛋白原0.5%的Tris-HCl緩沖液200 μL，置37 ℃水浴環(huán)境中溫浸5 min，取出緩慢滴加40 U·mL-1的凝血酶溶液(每min滴加1次，開始時每次滴加5 μL，接近滴定終點時減少每次加入的量，邊滴邊輕輕搖勻)直至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積并以此計算抗凝血酶活性。

2.6 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 APTT測定

取菲牛蛭及其炮制品水提液及仿生提取液測定APTT，結(jié)果見表1。

表1 菲牛蛭及其炮制品水提液和仿生提取液APTT測定結(jié)果

注：與空白組相比*P<0.01；與活體凍干品相比#P<0.01；與水提法相比△P<0.01。下同。

APTT反映凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟傅臅r間，常作為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)實驗的篩選指標。APTT實驗結(jié)果提示，采用水提法和仿生提取法測定的抗凝活性變化趨勢一致，均顯示炮制后活性降低，且隨著炮制溫度越高，活性降低越明顯，抗凝活性順序均為活體凍干品>清水吊干品>酒浸悶烘品>滑石粉燙制品。此外，相較于仿生提取法，水提法表現(xiàn)出更好的抗凝效果。

3.2 PT測定

取菲牛蛭及其炮制品水提液及仿生提取液測定PT，結(jié)果見表2。

表2 菲牛蛭及其炮制品水提液及仿生提取液PT測定結(jié)果

PT反映在待測血漿中加入組織凝血活酶和鈣離子使血漿凝固的時間，常作為外源性凝血系統(tǒng)實驗的篩選指標。PT實驗結(jié)果提示，4個樣品均表現(xiàn)出一定的抗凝效果。水提取法中，PT大小順序為：清水吊干品>活體凍干品>酒浸悶烘品>滑石粉燙制品；仿生提取法中，PT大小順序為：活體凍干品>清水吊干品>酒浸悶烘品>滑石粉燙制品。無論是水提取法還是仿生提取法，炮制品相比活體凍干品PT均有不同程度縮短，均表示炮制后抗凝活性有所下降。

3.3 TT測定

取菲牛蛭及其炮制品水提液及仿生提取液測定TT，結(jié)果見表3。

表3 菲牛蛭及其炮制品水提液及仿生提取液TT測定結(jié)果

TT反映血漿中纖維蛋白原在標準化凝血酶作用下轉(zhuǎn)為纖維蛋白的時間，反映共同凝血途徑。TT 實驗結(jié)果提示，與空白組相比，水提法與仿生提取法的不同樣品均有一定的抗凝效果。水提取法與仿生提取法的TT大小順序均為：活體凍干品>清水吊干品>酒浸悶烘品>滑石粉燙制品，這表明高溫炮制及清水吊干的過程降低了活體凍干品的抗凝活性。

3.4 蛋白質(zhì)含量測定

以比伐盧定為對照品，采用Lorry法測定菲牛蛭及其炮制品中蛋白質(zhì)的含量，測得標準曲線線性回歸方程為Y=0.053X+0.030 6(r=0.998 9，n=5)。測定菲牛蛭及其炮制品水提物及仿生提取物中的蛋白質(zhì)含量(以比伐盧定計)，結(jié)果見表4。

表4 菲牛蛭及其炮制品水提物及仿生提取物的蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

從表4結(jié)果可以看出，無論水提取法還是仿生提取法，菲牛蛭及其炮制品中蛋白質(zhì)含量順序均為：活體凍干品>清水吊干品>酒浸悶烘品>滑石粉燙制品，活體凍干品和清水吊干品蛋白含量較高，滑石粉燙制品蛋白含量相較于其他三者明顯較低。說明菲牛蛭炮制的過程會降低菲牛蛭蛋白和多肽的含量。該結(jié)果與炮制后抗凝活性降低順序一致，兩者可能有相關(guān)性。

3.5 抗凝血酶活性測定

根據(jù)凝血酶滴定法測定菲牛蛭及其炮制品的抗凝血酶活性，結(jié)果見表5。

表5 菲牛蛭及其炮制品水提物及仿生提取物的抗凝血酶活性測定

抗凝血酶活性結(jié)果顯示，無論是水提取法還是仿生提取法，各樣品的抗凝血酶活性順序為活體凍干品>清水吊干品>酒浸悶烘品>滑石粉燙制品，這與APTT、PT、TT及蛋白含量順序一致，進一步說明酒浸悶烘及滑石粉燙制的過程使菲牛蛭抗凝活性降低，纖維蛋白原在凝血酶參與下更容易轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白而發(fā)生凝固。

4 討論

4.1 炮制目的與實驗結(jié)果分析

水蛭炮制的目的是矯臭祛味、易于粉碎、緩性減毒。其中滑石粉燙制為《中華人民共和國藥典》記載的臨床常用的炮制方法，烘干溫度約200 ℃，具有凈制藥材、降低毒性、利于粉碎的作用。酒炙法為北京地區(qū)特色炮制工藝，烘干溫度約60 ℃，因黃酒中含有的乙醇、糖類成分，能大大地降低水蛭的腥臭味，使質(zhì)地酥脆，易于粉碎；且酒能活血，增強水蛭破血逐瘀通經(jīng)的功效，又可引藥上行，更好地發(fā)揮治療腦血管疾病方面的作用。在本實驗中，經(jīng)過滑石粉燙制和酒浸悶烘后，均能達到矯臭去味、易于粉碎的目的。

很多動物藥具有很強的活性，其活性成分往往也會引起毒性，如斑蝥、蜈蚣等經(jīng)炮制后，活性成分含量降低，毒性作用也降低，藥性趨向緩和。水蛭具有破血逐瘀功效，藥性峻猛，適當炮制后可能具有減小毒性的作用。但目前對于水蛭毒性的研究很少，據(jù)記載，水蛭有小毒，不慎吸入或可導(dǎo)致蛋白過敏癥狀[13]。本實驗的結(jié)果表明，炮制后菲牛蛭的抗凝活性降低，尤其是滑石粉燙制后活性降低更嚴重。推測原因可能是高溫破壞了其中的活性成分，但由于其毒性成分未知，因此炮制是否達到了減小毒性的效果有待深入研究。

4.2 水提取法與仿生提取法的比較

水蛭的活性成分多為蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)，口服給藥后在胃腸道消化酶的作用下易被降解成小分子活性成分，因此發(fā)揮抗凝藥效的成分與水直接提取出來的成分可能不同。除PT外，反映內(nèi)源性凝血途徑的 APTT以及反映共同凝血途徑的 TT均較仿生提取法高，仿生提取法的抗凝血酶活性整體上也高于水提取法。仿生提取法模擬胃腸道消化環(huán)境，此結(jié)果表明，菲牛蛭采取口服給藥時，活性成分在人體胃腸道會發(fā)生降解，從而降低活性。因此從活性角度考慮，菲牛蛭活性成分更適合以注射形式給藥。

4.3 炮制對水蛭抗凝活性影響的原因分析

血液凝固過程是由內(nèi)源性途徑(所有參與成分均在血液中)、外源性途徑(除血液中成分以外，還需要組織因子參與)和兩者共同途徑組成。當凝血過程通過外源性和內(nèi)源性途徑發(fā)展到因子X被激活時，2種途徑合二為一，進入共同途徑，凝血酶原活化為凝血酶，最終導(dǎo)致纖維蛋白原生成纖維蛋白，血液凝固。3個途徑分別用APTT、PT、TT(或抗凝血酶活性)表示。本實驗中，采取APTT、PT、TT和抗凝血酶活性4個指標評價菲牛蛭的抗凝活性，幾種指標從不同的角度反映了菲牛蛭活性成分參與的抗凝環(huán)節(jié)。結(jié)果顯示，無論水提取法，還是仿生提取法，各評價指標均顯示炮制后抗凝活性降低，說明菲牛蛭的抗凝活性成分能夠作用于抗凝的各途徑?；钚越档偷脑蚩赡苁欠婆ｒ伟l(fā)揮抗凝作用的活性成分為菲牛蛭素，是來源于水蛭唾液的1種多肽。將菲牛蛭冷凍干燥的過程可以很好地保護菲牛蛭素不被破壞，從而保持菲牛蛭的藥用活性。清水吊干的過程中，樣品處于太陽下暴曬，會使一部分活性成分變性，從而降低抗凝活性。而菲牛蛭采用滑石粉燙制的過程，需要高達200 ℃以上的高溫條件，在如此劇烈的高溫炮制條件下，抗凝活性物質(zhì)變性更為明顯。酒浸悶烘品也會使菲牛蛭的抗凝活性降低，猜測是由于有機溶劑和烘干的共同作用所致。綜上，可初步認為菲牛蛭炮制后較炮制前抗凝活性降低，但體外的模擬環(huán)境仍不能完全替代體內(nèi)吸收過程，炮制對體內(nèi)抗凝活性的影響還有待進一步深入研究。

5 結(jié)論

本實驗以APTT、PT、TT、抗凝血酶活性、蛋白及多肽含量多個指標綜合評價了菲牛蛭活體凍干品、清水吊干品、酒浸悶烘品、滑石粉燙制品的體外抗凝活性。實驗結(jié)果表明，無論是采用水提取法還是模擬人體胃腸道消化環(huán)境的仿生提取法，炮制后的菲牛蛭抗凝活性均有所降低，尤其以滑石粉燙制降低更嚴重。因此，從抗凝活性角度考慮，建議臨床使用時避免高溫炮制。