無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)篩查拷貝數(shù)變異的臨床應(yīng)用價(jià)值探討

謝潤(rùn)桂 魏順娣 何曉旋 江建榮 何怡

【摘要】 目的 探討無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT）篩查拷貝數(shù)變異（CNVs）的臨床應(yīng)用價(jià)值。

方法 選擇2017年5月至2019年10月，因NIPT發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)變異而選擇產(chǎn)前診斷的孕婦共52例，利用G顯帶核型分析及微陣列式基因芯片雜交法（CMA）對(duì)羊水細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，并比較三種方法的檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算陽性預(yù)測(cè)值。

結(jié)果 52例羊水CMA檢測(cè)結(jié)果證實(shí)CNVs 25例，其中與NIPT結(jié)果符合致病性CNVs 15例;與NIPT結(jié)果符合臨床意義不明確CNVs 7例;與NIPT結(jié)果符合良性CNVs 3例。NIPT檢測(cè)CNVs陽性預(yù)測(cè)值為48.1%（25/52）。13例NIPT提示CNVs片段<5 Mb的樣本中有10例與CMA結(jié)果相符，其中3例異常位于引起微缺失/微重復(fù)綜合征（MDs）的區(qū)域，另外39例CNVs片段≥5 Mb的樣本中有15例與CMA結(jié)果相符。MDs區(qū)域的CNVs占致病性CNVs的5/15（33.3%），其中有3例片段<5 Mb（60.0%），位于MDs區(qū)域的CNVs片段的陽性預(yù)測(cè)值為5/8（62.5%）。夫妻雙方備用血驗(yàn)證結(jié)果顯示：致病性CNVs親本來源占4/15，臨床意義不明確CNVs為親本來源占4/7。隨訪發(fā)現(xiàn) CMA 結(jié)果正常、良性的 CNVs和臨床意義不明確 CNVs 孕婦均選擇繼續(xù)妊娠，產(chǎn)后隨訪均未發(fā)現(xiàn)新生兒表型異常; 致病性CNVs 孕婦大多選擇終止妊娠，1例位于MDs 區(qū)域的CNVs胎兒出生后出現(xiàn)表型異常。

結(jié)論 NIPT用于篩查CNVs具有較高陽性預(yù)測(cè)值，能夠檢測(cè)出各種類型的CNVs，特別是染色體MDs區(qū)域的CNVs，具有良好的臨床應(yīng)用前景。同時(shí)，該技術(shù)仍存在一定的假陽性，應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合其他產(chǎn)前診斷方法做出準(zhǔn)確診斷。

【關(guān)鍵詞】 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè);拷貝數(shù)變異;微陣列式基因芯片雜交法;微缺失/微重復(fù)綜合征

中圖分類號(hào)：R714.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.04.006

Discussion on the clinical value of noninvasive prenatal screening for copy number variation

XIE Rungui，WEI Shundi，HE Xiaoxuan，JIANG Jianrong，HE Yi

（Center of Prenatal Diagnosis，Dongguan Maternal and Child Health Hospital，Dongguan 523107，Guangdong，China）

【Abstract】 Objective To explore the clinical value of noninvasive prenatal testing（NIPT） in screening for copy number variations（CNVs）.

Methods From May 2017 to October 2019，52 pregnant women were selected for prenatal diagnosis because of chromosomal structural variations found in NIPT.Amniotic fluid cells were detected by g-banding karyotype analysis and CMA，and the test results of the three methods were compared to calculate the positive predictive value.

Results Results of 52 cases of amniotic fluid CMA confirmed CNVs in 25 cases，including 15 cases of pathogenic CNVs，which was consistent with NIPT result.Variants of unknown significance was 7 cases，which was consistent with NIPT result.3 cases of benign CNVs was consistent with NIPT results.The positive predictive value of CNVs detected by NIPT was 48.1%（25/52）.13 cases of NIPT suggested that 10 of the samples <5 Mb of the CNVs fragment were consistent with the CMA results，3 of which were abnormal in the region causing microdeletion /microrepetition syndromes（MDs）.In addition，15 of the samples≥5 Mb of the CNVs fragment in 39 cases were consistent with the CMA results.CNVs in the MDs region accounted for 5/15（33.3%） of the pathogenic CNVs，including 3 fragments<5 Mb（60.0%），and the positive predictive value of CNVs fragments located in the MDs region was 5/8（62.5%）.The verification results of blood reserve of husband and wife showed that the source of pathogenic CNVs accounted for 4/15 of the parents，variants of unknown significance accounted for 4/7 of the parents.Follow-up revealed that pregnant women with normal CMA results，benign CNVs and unclear clinical significance CNVs all chose to continue their pregnancy，and no phenotypic abnormality was found in postpartum follow-up.Most of the pregnant women with pathogenic CNVs chose to terminate their pregnancy.One pathogenic CNVs fetus located in the MDs region showed phenotypic abnormalities after birth.

Conclusion NIPT has a high positive predictive value for screening CNVs，and can detect many types of CNVs，especially CNVs in the chromosomal MDs region，which has a good clinical application prospect.At the same time，there are still some false positives in this technique，which should be further combined with other prenatal diagnosis methods to make an accurate diagnosis.

【Key words】 noninvasive prenatal testing;copy number variations;microarray gene chip hybridization;microdeletion/microduplication syndrome

基于游離DNA的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（noninvasive prenatal testing，NIPT）是利用大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)（massively parallel sequencing，MPS）對(duì)包含母體及胎盤來源的所有游離DNA片段進(jìn)行深度測(cè)序，并利用生物信息分析技術(shù)確定游離DNA片段的來源，再與正常的參比樣本比較，然后獲得每條染色體各個(gè)位置相對(duì)的劑量信息，從而判斷染色體是否異常。目前，NIPT已廣泛用于13三體、18三體和21三體的產(chǎn)前篩查，并擴(kuò)展應(yīng)用到性染色體非整倍體和部分拷貝數(shù)變異（Copy numbervariations，CNVs）的篩查[1～2]。不同于整條性染色體數(shù)目增加或者減少的性染色體非整倍體，CNVs一般指染色體長(zhǎng)度為大于1 kb的DNA片段的缺失、插入、重復(fù)，屬于染色體上超微結(jié)構(gòu)的失衡。NIPT檢測(cè)性染色體非整體和CNVs的陽性率及陽性預(yù)測(cè)值均較高，一些研究已證實(shí)NIPT確實(shí)能夠發(fā)現(xiàn)CNVs[3]。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析難以發(fā)現(xiàn)CNVs，常見檢測(cè)CNVs的方法有Fish、QF-PCR和微陣列式基因芯片雜交法（CMA），其中致病性CNVs 可導(dǎo)致具有復(fù)雜臨床表現(xiàn)的胎兒微缺失/微重復(fù)綜合征（MDs）[4]。絕大多數(shù)MDs在宮內(nèi)發(fā)育期間基本無異常表現(xiàn)（宮內(nèi)發(fā)育遲緩、羊水過多/過少、特征性的臟器畸形是部分微缺失綜合征的唯一表現(xiàn)）;缺乏有力的產(chǎn)前篩查指標(biāo)或方法是目前最困難的挑戰(zhàn)[5]。目前CNVs檢測(cè)多用于新生兒發(fā)育遲緩、智力低下患者，在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用尚缺乏有力證據(jù)。本研究對(duì)NIPT產(chǎn)前篩查CNVs的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選擇2017年5月至2019年10月，因NIPT發(fā)現(xiàn)CNVs陽性而選擇在我院產(chǎn)前診斷的孕婦共52例，年齡21～42 歲，中位年齡31.5歲，NIPT平均孕周18.2周。NIPT排除有以下既往史病例：1年內(nèi)異體輸血史、1年內(nèi)移植手術(shù)史（胚胎移植手術(shù)除外）、4周內(nèi)免疫治療史和干細(xì)胞治療史。對(duì)入選孕婦進(jìn)行遺傳咨詢，建議羊膜腔（18～22周）穿刺術(shù)取樣進(jìn)行產(chǎn)前診斷，穿刺平均孕周20.6周，行G顯帶核型分析及CMA檢測(cè)。本研究經(jīng)東莞市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參加孕婦簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 NIPT檢測(cè)方法

樣本采集孕婦靜脈血7～10 mL，使用CellFree DNA BCT 管，采血后顛倒混勻8～10次，24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行血漿分離。首先將血樣在4℃下以1600×g離心10分鐘，以使血漿與外周血細(xì)胞分離。將血漿部分小心地轉(zhuǎn)移到聚丙烯管中，并在4℃下以16 000×g離心10分鐘，以沉淀剩余的細(xì)胞。基因組DNA提取、測(cè)序文庫構(gòu)建和質(zhì)量控制用試劑盒（S10020，Capital genomics）提取基因組DNA，測(cè)定基因組DNA濃度，然后在-20℃保存。根據(jù)晶芯胎兒染色體非整倍體T21、T18、T13檢測(cè)試劑盒（CFDA注冊(cè)許可證第0153400300號(hào)）的說明書進(jìn)行文庫構(gòu)建、質(zhì)量控制和匯集。使用晶芯Bioelectron Seq 4000系統(tǒng)（CFDA注冊(cè)許可號(hào)20153400309）半導(dǎo)體測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序讀數(shù)被過濾并與人類參考基因組（HG19）比對(duì)。

1.2.2 染色體核型分析方法

羊水經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后，用秋水仙素處理，根據(jù)低滲、固定、滴片、烤片、消化和G顯帶步驟，完成制片，采用LEICA GSL-120全自動(dòng)染色體掃描儀獲得染色體中期分裂象，核型分析和命名按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名國(guó)際體制進(jìn)行。

1.2.3 CMA檢測(cè)方法

抽取孕婦羊水，并采集夫妻雙方外周血備用。若發(fā)現(xiàn)臨床不明確的CNVs或者致病性CNVs則對(duì)父母?jìng)溆醚M(jìn)行CMA檢測(cè)，以判斷CNVs來源和性質(zhì)。運(yùn)用美國(guó)Affymetrix公司的CytoScan HD探針檢測(cè)，按照廠家的標(biāo)準(zhǔn)操作說明書進(jìn)行操作，主要步驟包括： DNA提取、酶切、連接、PCR、PCR產(chǎn)物鑒定、PCR產(chǎn)物純化、定量、片段化、片段化的QC質(zhì)量控制、標(biāo)記、雜交、洗滌、染色、掃描和數(shù)據(jù)分析。根據(jù)CNVs出現(xiàn)的位置、片段大小、缺失或重復(fù)，是否含有OMIM基因、是否已有文獻(xiàn)明確致病臨床意義，是否大于3 Mb，是否為親本來源等情況進(jìn)行判斷，參照DECPHER、OMIM、UCSCR等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)果判讀。根據(jù)美國(guó)ACMG指南[5]分為：良性CNVs （benign CNVs）、臨床意義不明確的CNVs （variants of unknown significance VOUS）、 致病性CNVs （pathogenic CNVs）。

1.2.4 隨訪

52例孕婦在分娩前后1個(gè)月由專職護(hù)士進(jìn)行兩次電話隨訪，分別隨訪孕期胎兒發(fā)育情況、妊娠結(jié)局和新生兒表型情況。

2 結(jié)? 果

2.1 NIPT 結(jié)果

52例CNVs樣本的片段大?。?3例CNVs<5 Mb，39例CNVs≥5 Mb，CNVs樣本提示異常類型：重復(fù)22例，缺失24例，同時(shí)存在缺失和重復(fù)6例。8例在位于MDs區(qū)域的CNVs中有6例片段小于5 Mb，見表1。

2.2 染色體核型分析和CMA 檢測(cè)結(jié)果

52例病例的介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果：羊水核型正常44例，異常8例，異常核型結(jié)果均與NIPT提示的CNVs相符，且片段均大于5 Mb，并位于非MDs區(qū)域。羊水CMA檢測(cè)結(jié)果證實(shí)CNVs 25例，其中與NIPT結(jié)果符合致病性CNVs 15例;與NIPT結(jié)果符合臨床意義不明確CNVs 7例;與NIPT結(jié)果符合良性CNVs 3例。NIPT檢測(cè)CNVs陽性預(yù)測(cè)值為48.1%（25/52），25例CMA檢測(cè)提示CNVs病例的介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果見表2。13例NIPT提示CNVs片段<5 Mb的樣本中有10例與CMA結(jié)果相符，其中3例異常位于引起MDs的區(qū)域，另外39例CNVs片段≥5 Mb的樣本中有15例與CMA結(jié)果相符。MDs區(qū)域的CNVs占致病性CNVs的5/15（33.3%），其中有3例片段<5 Mb（60.0%），位于MDs區(qū)域的CNVs片段的陽性預(yù)測(cè)值為5/8（62.5%），52例NIPT檢測(cè)提示CNVs樣本的三種檢測(cè)方法結(jié)果見表3。夫妻雙方備用血驗(yàn)證結(jié)果顯示：致病性CNVs親本來源占4/15，臨床意義不明確CNVs為親本來源占4/7。

2.3 隨訪結(jié)果

CMA結(jié)果正常、良性的CNVs和臨床意義不明確CNVs孕婦均選擇繼續(xù)妊娠，產(chǎn)后隨訪均未發(fā)現(xiàn)新生兒表型異常。15例致病性CNVs中有10例選擇引產(chǎn)，5例繼續(xù)妊娠。繼續(xù)妊娠病例包括2例X染色體異常、1例親本來源CNVs和2例MDs，產(chǎn)后隨訪反饋：2例MDs中1例表型異常，另1例失訪，其余3例暫時(shí)表型正常。25例CMA檢測(cè)結(jié)果提示CNVs病例的隨訪結(jié)果見表4。

3 討? 論

NIPT篩查胎兒的CNVs具有良好的臨床應(yīng)用前景。CNVs發(fā)生在染色體上罕見、新生、片段相對(duì)大、含有臨床相關(guān)基因和已確定的綜合征，稱為致病性CNVs，如果遺傳自健康雙親，或者普遍存在于正常人中未表現(xiàn)出病理學(xué)表型的，稱為良性CNVs，其余的稱為臨床意義不明CNVs。致病性CNVs出現(xiàn)在特定染色體上并含有重要基因的區(qū)域就可能引起MDs，可導(dǎo)致嚴(yán)重智力低下、發(fā)育遲緩、生長(zhǎng)發(fā)育異常等，在胎兒中發(fā)生率為1.0%～1.7%[6]。常見的MDs有22q11微缺失綜合征、22q11微重復(fù)綜合征、Angelman綜合征、貓叫綜合征等至少67種，發(fā)病率在1/4000至1/5000之間。MDs傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查模式為：孕中期B超檢查發(fā)現(xiàn)胎兒發(fā)育異?；蛘咂鞴倩?，介入性手術(shù)獲得胎兒的組織，基因芯片或新一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)胎兒DNA的CNVs。B超檢測(cè)從形態(tài)上辨別胎兒發(fā)育異常和畸形，不能檢測(cè)胎兒器官功能異常和胎兒智力異常，漏診率高。NIPT檢測(cè)對(duì)象為胎兒的游離DNA，直接判斷游離DNA是否存在CNVs，是否引起MDs，相比B超篩查有明顯優(yōu)勢(shì)。NIPT能從全基因組范圍篩查出致病性CNVs和MDs，本研究發(fā)現(xiàn)，28.8%的致病性CNVs檢出率遠(yuǎn)高于產(chǎn)前超聲篩查發(fā)現(xiàn)胎兒存在多個(gè)器官異常時(shí)約9.5%的致病性CNVs檢出率[7]。 隨著測(cè)序技術(shù)的改進(jìn)以及生物信息分析軟件的完善、更多大樣本研究，NIPT篩查CNVs將更加合理和準(zhǔn)確[8]。產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)（ISPD）2015年聲明中指出NIPT檢測(cè)胎兒CNVs可用于臨床意義明確或已知嚴(yán)重表型的疾病[9]。本研究52例NIPT陽性樣本中檢測(cè)到15例致病性CNVs，有5例可引起MDs，其中3例片段小于5 Mb的占60.0%，陽性預(yù)測(cè)值為62.5%，高于非MDs區(qū)域。因此，NIPT報(bào)告審核時(shí)，必須注意MDs區(qū)域出現(xiàn)的CNVs。NIPT能夠在產(chǎn)前篩查出各種類型的CNVs，包括染色體MDs區(qū)域的CNVs。

CNVs驗(yàn)證應(yīng)選用CMA作為驗(yàn)證方法。染色體核型分析方法使用顯微鏡觀察染色體的帶紋變化，一般只能辨別5～10 Mb的染色體結(jié)構(gòu)異常，而染色體核型分析并不適用于驗(yàn)證CNVs。本研究染色體核型分析CNVs的檢出率僅為32.0%，檢測(cè)到的異常片段均大于5 Mb，與以上推斷一致。目前全基因組范圍檢測(cè) CNVs 研究的方法有： CMA、SNP分型芯片技術(shù)和新一代測(cè)序技術(shù)。CMA通過一次雜交可對(duì)全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)的染色體拷貝數(shù)量的變化進(jìn)行檢查，分辨率在10 kb左右，能夠檢測(cè)所有染色體結(jié)構(gòu)失衡，包括非整倍體和所有已知引起智力障礙/多發(fā)性先天畸形的復(fù)發(fā)性染色體失衡。目前一些產(chǎn)前診斷中心已將此方法用于產(chǎn)前診斷CNVs[10]。CMA可用于CNVs的驗(yàn)證，但必須注意，NIPT檢測(cè)結(jié)果與CMA并不完全一致。NIPT檢測(cè)CNVs是基于測(cè)序匹配Reads獲得染色體上不同位置DNA片段的劑量信息。在目前測(cè)序深度條件下，測(cè)序得到Reads經(jīng)過了過濾、篩選和換算， NIPT檢測(cè)DNA片段的劑量和位置變化并不精確。而CMA檢測(cè)卻能夠精確地檢測(cè)DNA劑量和位置變化。本研究中NIPT和CMA發(fā)現(xiàn)CNVs異常類型（缺失或重復(fù)）均一致，但CNVs區(qū)域的大小和位置不完全一致。如果NIPT和羊水CMA均提示染色體相近位置出現(xiàn)相同類型的CNVs，說明NIPT提示信號(hào)為真信號(hào)，均應(yīng)判斷為真陽性。

CNVs來源驗(yàn)證及胎兒轉(zhuǎn)歸隨訪是評(píng)價(jià)NIPT篩查CNVs臨床效果的重要方法。CNVs的來源是預(yù)測(cè)胎兒預(yù)后的一個(gè)重要因素，CMA檢測(cè)夫妻備用血可確定CNVs來源。如果CNVs來源于親本，且親本臨床表型正常，則患病風(fēng)險(xiǎn)低，如系新發(fā)突變，則應(yīng)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道、涉及基因、片段大小、超聲檢查結(jié)果、生育史等綜合判斷。本研究中25例真陽性樣本中共有8例來源于親本，驗(yàn)證結(jié)果可幫助臨床醫(yī)生遺傳咨詢和判斷胎兒的預(yù)后。15例致病性CNVs中5例繼續(xù)妊娠，其中2例為涉及X染色體異常的女胎。由于女性有2條X染色體且存在互補(bǔ)效應(yīng)，其中1條X染色體異常對(duì)胎兒的表型影響較小;1例系母親來源，母親表型正常。3例嬰兒出生后均未出現(xiàn)表型異常。另外2例CNVs會(huì)引起MDs，1例產(chǎn)后出現(xiàn)了MDs，另1例失訪。

NIPT檢測(cè)CNVs存在假陽性病例現(xiàn)象。NIPT檢測(cè)時(shí)，由于孕婦外周血的胎兒游離DNA含量?jī)H占血漿總游離DNA的19%左右，并且與母體游離DNA混雜在一起，大量的母體血漿游離DNA背景會(huì)給胎兒游離DNA的檢測(cè)和分析造成干擾，如果母親染色體異常、DNA拷貝數(shù)異常、母血中胎兒DNA含量低以及母親罹患腫瘤等情況，都會(huì)引起NIPT假陽性。另外，NIPT檢測(cè)胎兒游離DNA來源胎盤滋養(yǎng)層，胎盤與胎兒雖然由同一個(gè)合子發(fā)育和分化形成，但如果在孕期出現(xiàn)限制性胎盤嵌合、雙胎一胎凋亡等情況可導(dǎo)致胎兒和胎盤DNA不一致，也會(huì)引起NIPT假陽性[11～12]。本研究發(fā)現(xiàn)NIPT用于篩查CNVs的陽性預(yù)測(cè)值為48.1%（25/52），假陽性率為51.9%（27/52），與盧建等人報(bào)道的NIPT篩查T18和T13的假陽性率達(dá)51.1%和51.9%相近[13]。這說明NIPT用于篩查CNVs具有與T18和T13篩查相似的臨床價(jià)值， NIPT可用于產(chǎn)前篩查CNVs，但必須通過介入性產(chǎn)前診斷確診。另外，本研究無法收集到計(jì)算真陰性和假陰性所需的同期NIPT檢測(cè)其他孕婦的篩查結(jié)果、產(chǎn)前診斷結(jié)果和隨訪數(shù)據(jù)，無法計(jì)算陰性預(yù)測(cè)值、敏感度、特異性和約登指數(shù)等篩檢指標(biāo)。因此，本研究對(duì)NIPT篩查CNVs的效果評(píng)價(jià)不夠全面，仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NIPT用于篩查CNVs具有較高陽性預(yù)測(cè)值，能夠檢測(cè)出各種類型的CNVs，特別是染色體MDs區(qū)域的CNVs，具有良好的臨床應(yīng)用前景。同時(shí)，該技術(shù)仍存在一定的假陽性，應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合其他產(chǎn)前診斷方法做出準(zhǔn)確診斷。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-01-12 修回日期：2020-03-24）

（編輯：梁明佩）