UPLC-MS/MS 法測(cè)定復(fù)方甘草片中甘草酸含量不確定度評(píng)定

陳高健 周日秀 湯麗昌

摘 要：本文的目的是對(duì)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定復(fù)方甘草片中甘草酸的含量進(jìn)行不確定度評(píng)定，通過(guò)建立不確定度評(píng)估的數(shù)學(xué)模型來(lái)對(duì)不確定度的各主要分量進(jìn)行分析計(jì)算，得出合成不確定度及擴(kuò)展不確定度。結(jié)果顯示，當(dāng)復(fù)方甘草片中甘草酸的測(cè)定結(jié)果為49.90mg/g時(shí)，在95%的置信區(qū)間下，其擴(kuò)展不確定度為7.8mg/g，k=2。因此得出結(jié)論，采用UPLC-MS/MS法測(cè)定復(fù)方甘草片中甘草酸的含量，發(fā)現(xiàn)其不確定度的主要來(lái)源為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，該評(píng)估模型能夠?yàn)闄z測(cè)復(fù)方甘草片中甘草酸的不確定度評(píng)估提供一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法? 復(fù)方甘草片? 甘草酸? 不確定度

復(fù)方甘草片為常用復(fù)方制劑，其成分包括甘草浸膏粉、阿片粉、樟腦、八角茴香油、苯甲酸鈉等，屬于鎮(zhèn)咳祛痰類(lèi)非處方藥品[1]。UPLC-MS/MS具有較好的選擇性和靈敏度，特別適用于復(fù)雜樣品的分析。事實(shí)上，其測(cè)得結(jié)果只是被測(cè)量的估計(jì)值，而完整的測(cè)量結(jié)果還應(yīng)包括被測(cè)量的估計(jì)值及不確定度[7，8]。因此，本文在建立UPLC-MS/MS法[2]測(cè)定復(fù)方甘草片中甘草酸含量的基礎(chǔ)上，根據(jù)相關(guān)的規(guī)范和指南[3，4]并參考相關(guān)文獻(xiàn)[5，6]對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定，以期為UPLC-MS/MS法測(cè)定復(fù)方甘草片中甘草酸的含量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司;G6460三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫公司;S1-T256渦旋混合器;CPX5800H-C超聲波清洗機(jī)，美國(guó)必能信上?？茖?dǎo)儀器有限公司;XA205DU萬(wàn)分之一電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

甘草酸對(duì)照品（批號(hào)：G-004-170414）供實(shí)驗(yàn)室藥品檢驗(yàn)用，成都瑞芬思生物科技有限公司;復(fù)方甘草片（批號(hào)：190202）為市售品;色譜甲醇、色譜甲酸，Thermo;超純水為Milipore 制備。

1.2 供試品溶液的制備

取復(fù)方甘草片20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)后稱(chēng)取約1片量，置于100mL量瓶中，然后加入適量甲醇-水（1︰1），超聲提取處理（300W，250KHZ）30min，取出后放冷;用甲醇-水（1︰1）稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取濾液1mL置于100mL容量瓶中;用甲醇-水（1︰1）稀釋至刻度，搖勻后用0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液即得標(biāo)準(zhǔn)供試品溶液，備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)取甘草酸對(duì)照品15.67mg于50mL容量瓶中，加甲醇并搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液;精密吸取10mL儲(chǔ)備液，置于100mL容量瓶中，加甲醇并搖勻，作為對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00、2.00、5.00、10.00、20.00mL，分別置于100mL容量瓶中，然后加甲醇并稀釋至刻度，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，供UPLC-MS/MS測(cè)試。

1.4 分析條件

Agilent EclipsePlus-C18色譜柱（2.1×50mm，1.8μm）;流動(dòng)相：0.1甲酸乙腈-0.1%甲酸水（70︰30，V/V）;流速：0.2mL/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：5μL。采用電噴霧負(fù)電離源模式（Electronic spray ion，ESI-），掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple reaction monitoring，MRM）;霧化氣壓力：30psi;干燥氣溫度：300℃;干燥氣流速：8L/min;毛細(xì)管電壓：4000V;碎裂電壓：165V;定量離子碰撞能：45eV，定性離子碰撞能：50eV。

1.5 測(cè)量模型

甘草酸含量的計(jì)算式：

式中，X為樣品中甘草酸的含量（mg），C為供試品溶液中甘草酸質(zhì)量濃度（mg/mL），V為樣品溶液的定容體積（mL），M為樣品取樣量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量不確定度的來(lái)源

由測(cè)量模型可知，檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度主要包括樣品稱(chēng)量μrel（M）、樣液定容μrel（V）、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制μrel（C）、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合μrel（X）、樣品重復(fù)性測(cè)試μrel（rep），以及加樣回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel（R）。

2.2 各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評(píng)定

2.2.1 天平稱(chēng)取試樣質(zhì)量M引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel（M）的評(píng)定

稱(chēng)取的試樣質(zhì)量為0.1500g。天平檢定證書(shū)上的最大允許誤差為±0.0001g，故由兩次測(cè)量組成（稱(chēng)量空盤(pán)1次、盤(pán)加試樣1次），按均勻分布，取包含因子k=? ? 。

天平稱(chēng)取試樣質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

μrel（M）=8.2×10-5/0.1500=5.5×10-4。

2.2.2 試樣溶液制備的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel（V）的評(píng)定

試樣溶液定容由100mL容量和1mL單標(biāo)吸量管產(chǎn)生，使用的兩種容量器具引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定[7，8]結(jié)果見(jiàn)表1。

注：水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1。

樣品稀釋過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μ1，rel（C）

2.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度μ1，rel（C1）

測(cè)量所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)甘草酸的純度為98.0%，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)得知相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為±2.0%，k=2，則μ1，rel（C1）=μ（Cs）/Cs=2%/2=1.0×10-2。

2.2.3.2標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel（C2）

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液不確定度由50、100mL容量和10mL單標(biāo)吸量管產(chǎn)生，對(duì)所使用容量器具引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定[7，8]結(jié)果見(jiàn)表2。

注：水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1。

標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μ1，rel（C3）

吸取對(duì)照品溶液1.00、2.00、5.00、10.00、20.00mL，置于100mL容量瓶中，對(duì)所使用容量器具引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定[7，8]結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合時(shí)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel（X）

根據(jù)工作站及采集數(shù)據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)量，以響應(yīng)值（A-）與濃度（C）作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到擬合的線性回歸方程：A=a+b×C=323.4×C+73.33，其中截距a=73.33，斜率b=323.4，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。由工作曲線擬合時(shí)引入的不確定度源于其殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，殘差為測(cè)定值（A）與標(biāo)注曲線擬合值（? ? ）之差的絕對(duì)值（|A-? ?|），殘差的計(jì)算見(jiàn)表4。

標(biāo)準(zhǔn)曲線殘差標(biāo)準(zhǔn)差為：

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合時(shí)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel（rep）的評(píng)定

取待測(cè)樣品溶液，按試樣方法分別進(jìn)行6次測(cè)定，測(cè)定結(jié)果分別為49.87、50.23、48.98、50.39、51.11、48.79mg/g，平均值為49.90mg/g，標(biāo)準(zhǔn)偏差Srep=0.8823，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 。

2.2.6 添加回收率引入的不確定度μrel（R）的評(píng)定

對(duì)樣品進(jìn)行6次加標(biāo)回收試驗(yàn)，添加水平為0.1567μg/mL，回收率分別為100.2%、99.5%、98.1%、98.2%、97.3%和98.4%，平均回收率為98.6%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.050，由回收率引入的相對(duì)不確定度為? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?。

2.3 甘草酸含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度

將各項(xiàng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別列于表5，計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

根據(jù)GB/T 27418-2017測(cè)量不確定度評(píng)定和表示法[3]，采用UPLC-MS/MS測(cè)定甘草酸含量結(jié)果的合成不確定度為U（X）=49.90×7.9×10-2=3.9mg/g，取包含因子k（95）=2，則甘草酸的擴(kuò)展不確定度為Urel=2×3.9=7.8mg/g。因此，其真實(shí)結(jié)果可表示為（49.90±7.8）mg/g，k=2。

3 結(jié)論

由計(jì)算結(jié)果可知，本試驗(yàn)測(cè)量不確定度的主要來(lái)源是甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。因此，需要重點(diǎn)考慮標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)系列的稀釋過(guò)程中引入的不確定度分量。試驗(yàn)應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程，繪制好標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇合理的線性范圍，確保測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。經(jīng)研究，本試驗(yàn)建立的不確定度評(píng)定方法可為UPLC-MS/MS測(cè)定復(fù)方甘草片中甘草酸含量提供一定的科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華人民共和國(guó)藥典2015年版.二部[S].2015：796.

[2] 湯麗昌.UPLC-MS/MS測(cè)定復(fù)方甘草片中甘草酸含量[J].現(xiàn)代食品，2019，12：162-164.

[3] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 27418-2017《測(cè)量不確定度評(píng)定和表示法》[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

[4] 中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS-GL006：2019 化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[S].2019.

[5] 陳晨，陳妍，倪煒華，等.高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸的不確定度評(píng)定[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2019，10（9）：2660-2663.

[6] 楊秀培，肖丹，山桂云，等.白酒中己酸乙酯測(cè)定的不確定度評(píng)估[J]. 食品科學(xué)，2006，27（07）： 214-218.

[7] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 12806-2011《實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器單標(biāo)線容量瓶》[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[8] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[S].北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2007.