抑制低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2表達(dá)對Alzheimer’s病細(xì)胞模型絲裂原活化蛋白激酶信號通路影響的機(jī)制研究

王麗玲，李焰生，王鵬飛

Alzheimer’s病(AD)是老年人最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為記憶和認(rèn)知功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并可伴有各種神經(jīng)精神癥狀[1-2]。國際AD協(xié)會針對全球AD對經(jīng)濟(jì)影響的評估報(bào)告稱，2018年全球約有5 000萬人患有癡呆，到2050年這一數(shù)字將增至1.52億，是現(xiàn)在的三倍之多。據(jù)估計(jì)，2018年全球社會癡呆相關(guān)成本為1萬億美元，到2030年這一數(shù)字將增至2萬億美元[3]。AD的神經(jīng)病理改變大體表現(xiàn)為以海馬和皮質(zhì)為主的全腦萎縮，腦溝回增寬及腦室增大，鏡下主要表現(xiàn)為神經(jīng)元外由β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成的老年斑以及神經(jīng)元內(nèi)由tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)[4]。迄今為止，已有許多AD的假說，主要包括淀粉樣蛋白假說、tau蛋白過度磷酸化假說、神經(jīng)元凋亡假說、自由基損傷及免疫炎癥假說、神經(jīng)遞質(zhì)代謝障礙假說等。但任一假說都不足以全面闡述AD的發(fā)病機(jī)制。越來越多的證據(jù)顯示，遺傳、環(huán)境和衰老因素共同參與了AD的發(fā)生發(fā)展[5]。

低密度脂蛋白受體(LDLR)是一種進(jìn)化上古老而又高度保守的基因家族，屬于Ⅰ型跨膜受體，在結(jié)構(gòu)上具有高度相似性。所有成員胞外段都有配體結(jié)合域、表皮生長因子樣富含半胱氨酸重復(fù)序列和包含β螺旋的YWTD基序，同時也都含有一個單次跨膜區(qū)及50～200個氨基酸不等且有NPXY基序的胞內(nèi)段，胞內(nèi)段可能參與受體內(nèi)吞和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)1是LDLR家族第一個被發(fā)現(xiàn)的成員，廣泛表達(dá)于全身各組織器官，尤其是腦組織，在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞中均存在表達(dá)。病理研究證實(shí)，腦組織LRP1的表達(dá)在AD患者中顯著下降，LRP1在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中可以直接與Aβ結(jié)合，從而促進(jìn)其在血-腦屏障中的清除[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在原代神經(jīng)元細(xì)胞中干擾LRP1的表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡增加[7]。在小鼠前腦神經(jīng)元中特異性地敲除LRP1可引起脂質(zhì)代謝異常，并導(dǎo)致進(jìn)行性年齡依賴的樹突棘退化、突觸丟失、神經(jīng)炎癥、小鼠記憶功能下降等全面神經(jīng)退行性病變[8]。而同樣屬于LDLR家族的LRP2在結(jié)構(gòu)上與LRP1非常相似，是一種廣泛表達(dá)與全身的多配體受體。既往研究認(rèn)為，LRP2主要表達(dá)于室管膜細(xì)胞、毛細(xì)血管和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞[9]，在腦毛細(xì)血管和脈絡(luò)叢上皮參與ApoJ和Aβ復(fù)合物的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)及降解[9-11]，并且LRP2在脈絡(luò)膜叢中的表達(dá)及其功能隨年齡增長、AD發(fā)生而降低[12-14]。此外，LRP2在脈絡(luò)叢有助于類胰島素生長因子1(IGF-1)、瘦素的轉(zhuǎn)運(yùn)入腦組織，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[12-13,15]。上皮細(xì)胞選擇性敲除LRP2小鼠呈現(xiàn)明顯的焦慮行為，學(xué)習(xí)能力受損和記憶障礙，與AD的癥狀十分相似[16]。本研究小組既往研究顯示，rs3755166多態(tài)性可能是中國大陸漢族人群AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素，rs3755166位點(diǎn)由G突變?yōu)锳后，LRP2基因轉(zhuǎn)錄活性明顯下降，可能是其導(dǎo)致AD易感的機(jī)制[17]。這些都說明LRP2在AD發(fā)病及進(jìn)程中具有重要作用和研究價(jià)值。

越來越多的證據(jù)表明，LRP2不僅表達(dá)于室管膜細(xì)胞、毛細(xì)血管和脈絡(luò)叢上皮等細(xì)胞中，亦廣泛表達(dá)于皮質(zhì)及海馬等神經(jīng)元中[18]。然而，目前對于LRP2在神經(jīng)元細(xì)胞中的功能知之甚少。Aβ是老年斑的主要成分，大量的研究證明過量的Aβ可以通過激活caspase-3引起神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[19-20]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，該通路參與AD的發(fā)病發(fā)展[21]。那么在Aβ處理的AD細(xì)胞模型中的LRP2表達(dá)是否存在異常？由于LRP2與LRP1結(jié)構(gòu)相似，亦是多配體受體，它是否會如同LRP1一樣在神經(jīng)元細(xì)胞中具有抗凋亡作用發(fā)揮對細(xì)胞的保護(hù)性作用？在神經(jīng)元細(xì)胞中調(diào)控LRP2的表達(dá)對神經(jīng)元細(xì)胞及其對Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否具有調(diào)控作用呢？LRP2與MAPK信號通路直接存在何種關(guān)系呢？基于以上這些問題本研究展開了深入的探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及分組 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞購于American type culture collection，分為空白對照組、陰性對照(SC)組、LRP2 siRNA-1(siLRP1)組、LRP2 siRNA-2(siLRP2)組、siLRP2+Aβ組和SC+Aβ組。

1.1.2 常用試劑 JNK抑制劑SP600125(美國Cell signaling Technology公司)；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(大連寶生物工程有限公司)，anti-Lrp2(美國Abcam公司)，anti-GAPDH(AF0006，碧云天生物技術(shù))，anti-cleaved Caspase-3(Merck Millipore公司)，anti-Caspase-3(8G10)(美國Cell signaling Technology公司)，anti-p-ERK1/2(美國Cell signaling Technology公司)，anti-ERK1/2(美國Cell signaling Technology公司)，anti-p-JNK(美國Cell signaling Technology公司)，anti-JNK(美國Cell signaling Technology公司)，anti-p-p38 MAPK(美國Cell signaling Technology公司)，anti-p38 MAPK(美國Cell signaling Technology公司)，羊抗鼠IgG(HRP標(biāo)記)抗體(美國Sigma公司)，羊抗兔IgG(HRP標(biāo)記)抗體(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y細(xì)胞)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%的青-鏈霉素混合物的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，放置于37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中。六孔板種植SH-SY5Y細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，待融合度為70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后更換培養(yǎng)液。

1.2.2 細(xì)胞活力的測定及Aβ1-42處理濃度的選擇 不同濃度(0 μmol、5 μmol、10 μmol、20 μmol、30 μmol)Aβ1-42(購于Sigma公司，ddH2O溶解后37 ℃培養(yǎng)箱放置3 d，形成聚集態(tài))處理SH-SH5Y細(xì)胞24 h后，選擇細(xì)胞活力下降50%的Aβ1-42濃度作為AD細(xì)胞模型處理濃度。采用噻唑藍(lán)比色法(MTT)測定細(xì)胞活力。將細(xì)胞種植在96孔板中，密度為2 000 cells/每孔，邊緣孔用PBS充填減少蒸發(fā)。在5%的CO2孵育箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。第2 d細(xì)胞貼壁后去培養(yǎng)液，每孔加入90 μl培養(yǎng)液和10 μl 5 mg/L的MTT，37 ℃孵育4 h。小心吸去MTT，加入200 μl DMSO溶解結(jié)晶。室溫?fù)u晃避光孵育15 min后用多功能酶標(biāo)儀測定，設(shè)定波長為570 nm，參考波長為630 nm。在檢測LRP2干擾后對細(xì)胞活力影響時，以(轉(zhuǎn)染組-空白對照組)/(SC組-空白對照組)比值作為相對細(xì)胞活力。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次復(fù)孔在3個以上。

1.2.3 LRP2 siRNA轉(zhuǎn)染方法 LRP2 siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，序列如下：siRNA-1：5′-GUG GAG AAA UGA CAG UUA UTT-3′，5′-AUA ACU GUC AUU UCU CCA CTT-3′；siRNA-2：5′-GGA CUU GUG UUG AUA UUG ATT-3′，5′-UCA AUA UCA ACA CAA GUC CTT-3′；Scrambled siRNA：5′-UUC UUC GAA CGU GUC ACU TT-3′，5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。將SH-SY5Y細(xì)胞用胰酶消化后按1∶3接種至孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞長至約70%融合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染具體操作參照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。

1.2.4 LRP2 mRNA水平的檢測 于轉(zhuǎn)染24 h及48 h采用RT-PCR檢測各組LRP2 mRNA水平。Trizol(Invitrogen公司)提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄引物用試劑盒(大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Homo LRP2及GAPDH基因序列由NCBI neucleotide數(shù)據(jù)庫獲得，PCR引物通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，并經(jīng)Primer Blast比對序列正確且特異，由上海英俊生物技術(shù)公司合成。引物序列：(1)LRP2引物序列(5′-3′)：F：TAG GGC TTA TGT TCT GGA CT，R：TGG GCA CTG ACT TAT TGT AT；(2)GAPDH引物序列(5′-3′)：F：CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT，R：AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC。PCR反應(yīng)體系參照PCR反應(yīng)試劑盒(Takara公司)說明書，LRP2 PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min→95 ℃變性30 s→ 55 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個循環(huán)后于72 ℃再延伸10 min。GAPDH PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min→95 ℃變性30 s→ 60 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增28個循環(huán)后于72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.5 細(xì)胞凋亡的檢測 六孔板種植SH-SY5Y細(xì)胞，培養(yǎng)24 h待融合度為70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后更換培養(yǎng)液。每孔加入20 μmol Aβ1-42處理24 h，異硫氰酸酯(FITC)Annexin V Apoptosis Detection試劑盒(美國BD公司)染色，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 LRP2、Caspase-3、Anti-Caspase 3，Cleaned Caspase 3蛋白表達(dá)水平的檢測 于LRP2 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后采用Western blotting法檢測LRP2蛋白表達(dá)水平，LRP2 siRNA轉(zhuǎn)染48 h，并予Aβ1-42處理24 h后，采用Western blotting法檢測Caspase-3、Anti-Caspase 3，Cleaned Caspase 3蛋白表達(dá)水平。RIPA蛋白裂解液提取蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取40 μg蛋白，加至10% SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5% BSA封閉，加入一抗anti-Lrp2(1∶1 000)、anti-GAPDH(1∶3 000)、anti-Caspase 3，Cleaned Caspase 3(1∶1 000)、anti-Caspase-3(8G10)(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入相應(yīng)的二抗。室溫封閉2 h后，TBST洗膜，在膜上加入新鮮配置的顯影液(Millipore公司)，然后采用ChemiDocTMMP imaging system(Bio-Rad公司)進(jìn)行顯影和分析。

1.2.7 MAPKs信號通路(ERK、p38以及JNK磷酸化)表達(dá)水平的檢測 siLRP2組、SC組、siLRP2+Aβ組和SC+Aβ組細(xì)胞采用JNK抑制劑SP600125(200 ng/ml)預(yù)處理1 h，隨后與Aβ1-42共處理細(xì)胞24 h。Western blotting法檢測各組(p-ERK1/2)/ERK、p-p38/p38和p-JNK/JNK，稀釋比例為1∶1 000。

2 結(jié) 果

2.1 干擾LRP2后對AD細(xì)胞生存活力的影響 以5 μmol、10 μmol、20 μmol、30 μmol Aβ1-42處理組細(xì)胞活力分別為80%、63%、52%、42%。與空白對照組比較，10 μmol、20 μmol、30 μmol濃度Aβ1-42處理的SH-SH5Y細(xì)胞活力顯著下降(均P<0.05)。Aβ1-4220 μmol時SH-SY5Y細(xì)胞活力下降明顯(52%)，因此選擇20 μmol作為AD細(xì)胞模型處理濃度。LPR2 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后給予20 μmol Aβ處理24 h，siLRP2+Aβ組細(xì)胞活力(40.7±1.9%)顯著低于SC+Aβ組(54.5±7.5%)(P<0.05)。

2.2 Aβ對SH-SY5Y細(xì)胞LRP2蛋白表達(dá)水平的影響 見圖1。Aβ處理前，SH-SY5Y細(xì)胞LRP2/GAPDH蛋白相對表達(dá)水平為100%，Aβ1-42(20 μmol)處理后LRP2/GAPDH蛋白相對表達(dá)水平為(77.3±15.3)%。與處理前比較，Aβ1-42處理后LRP2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 LRP2蛋白表達(dá)電泳圖

2.3 各組LRP2 mRNA及蛋白表達(dá)的比較 見表1、圖2。與空白對照組比較，siRNA-1組、siRNA-2組LRP2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05～0.01)，SC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 SC+Aβ組及siLRP2+Aβ組細(xì)胞凋亡率的比較 見圖3。SC+Aβ組細(xì)胞凋亡率[(32.4±3.0)%]顯著低于siLRP2+Aβ組[(51.8±4.2)%](P<0.01)。

2.5 抑制LRP2表達(dá)對MAPKs信號通路的影響 見表2、圖4。SC+Aβ組及siLRP2+Aβ組(p-ERK1/2)/ERK與SC組及siLRP2組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與SC+Aβ組相比，siLRP2+Aβ組(p-ERK1/2)/ERK差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SC+Aβ組及siLRP2+Aβ組p-p38/p38顯著高于SC組及siLRP2組(均P<0.01)。與SC+Aβ組相比，siLRP2+Aβ組p-p38/p38差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SC+Aβ組及siLRP2+Aβ組p-JNK/JNK顯著高于SC組及siLRP2組(均P<0.01)。與SC+Aβ組比較，siLRP2+Aβ組p-JNK/JNK顯著增高(P<0.01)。

表1 各組LRP2 mRNA及蛋白相對表達(dá)(%)組別LRP2 mRNALRP2蛋白SC組98.5±16.196.8±1.6siRNA-1組48.8±26.9▲58.7±1.4▲siRNA-2組65.8±26.1△66.7±4.3▲空白對照組100100 注:與空白對照組比較△P<0.05,▲P<0.01

圖2 各組SH-SY5Y細(xì)胞LRP2表達(dá)情況 A：各組LRP2 mRNA電泳圖；B：各組LRP2蛋白電泳圖

圖3 SC+Aβ組及siLRP2+Aβ組細(xì)胞凋亡率 左下象限表示FITC-/碘化丙啶(PI)-，代表正常細(xì)胞；右下象限表示FITC+/PI-，代表早期凋亡細(xì)胞；左上象限表示FITC-/PI+，代表死亡細(xì)胞；右上象限表示FITC+/PI+，代表晚期凋亡細(xì)胞

表2 抑制LRP2表達(dá)對MAPKs信號通路的影響(%)組別(p-ERK1/2)/ERKp-p38/p38p-JNK/JNKSC組100100100SC+Aβ組144.0±44.5202.5±63.7▲△129.8±20.7▲△siLRP2組91.6±11.795.6±5.3112.4±7.7siLRP2+Aβ組150.8±45.5212.9±17.5▲△231.5±48.4*▲△ 注:與SC組比較▲P<0.01;與SC+Aβ組比較*P<0.01;與siLRP2+Aβ組比較△P<0.01

圖4 抑制LRP2表達(dá)對MAPK信號通路的影響 A：(p-ERK1/2)/ERK電泳圖；B：p-p38/p38電泳圖；C：p-JNK/JNK電泳圖

2.6 JNK抑制劑對Aβ1-42誘導(dǎo)的Caspase-3激活的影響 見圖5。未經(jīng)JNK抑制劑處理的SC組、siL-RP2組細(xì)胞的Cleaved Caspase-3相對表達(dá)與經(jīng)JNK抑制劑處理的細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

圖5 Capase-3激活的電泳圖

3 討 論

AD的主要病理學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)大量神經(jīng)原纖維纏結(jié)、老年斑形成以及大量的神經(jīng)元丟失[4]。Smale等[22]最初用TUNEL染色觀察到AD患者腦組織中存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，AD患者海馬區(qū)TUNEL染色陽性細(xì)胞較同齡對照明顯增加。許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)老年斑的主要成分Aβ可以通過激活Caspase-3、引起線粒體功能障礙促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23-25]。Caspase-3屬于Caspase蛋白家族，是凋亡的終末執(zhí)行分子。AD患者的神經(jīng)元中亦檢測到激活的Caspase-3和斷裂的DNA片段[26]。

近年來，LDLR及其所介導(dǎo)的胞內(nèi)信號系統(tǒng)在AD發(fā)病中的作用日益成為關(guān)注的焦點(diǎn)。LRP2作為LDLR家族中最重要的成員，在Aβ代謝中的重要作用逐漸被認(rèn)識。研究發(fā)現(xiàn)，LRP2在脈絡(luò)膜叢與凝溶膠蛋白相互作用，通過胞吞作用將Aβ經(jīng)血-腦屏障清除出腦內(nèi)[27]。同時，具有神經(jīng)保護(hù)作用的類胰島素生長因子1(IGF-1)、瘦素需在LRP2的介導(dǎo)下才能從外周進(jìn)入中樞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能[12-13,15]。本研究小組既往研究發(fā)現(xiàn)，LRP2啟動子處的多態(tài)rs3755166與AD密切相關(guān)，rs375166 G>A位點(diǎn)的堿基變異可能影響DNA序列與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性，導(dǎo)致LRP2表達(dá)的相對下降，并使其保護(hù)性作用下降繼而增加AD的易感性[16]，強(qiáng)烈提示LRP2表達(dá)下調(diào)或功能障礙可能參與AD的發(fā)病。

盡管研究顯示LRP2在脂蛋白代謝中起到了一定的作用，但目前對于LRP2對神經(jīng)元的存活是否有直接作用還未明確。為了闡明神經(jīng)元表達(dá)的LRP2在AD發(fā)病中的作用，本研究采用Aβ1-42處理SH-SY5Y作為AD細(xì)胞模型，以不同濃度Aβ1-42(5 μmol、10 μmol、20 μmol、30 μmol)處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h。結(jié)果顯示，Aβ1-42在10 μmol濃度下開始影響SH-SY5Y細(xì)胞活力，在20 μmol濃度時SH-SY5Y細(xì)胞活力明顯下降(52%)，因此選擇20 μmol作為AD細(xì)胞模型處理濃度。與空白對照組相比，Aβ1-42(20 μmol)處理后的AD細(xì)胞模型LRP2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，提示LRP2可能參與AD的發(fā)病機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，siLRP2+Aβ組細(xì)胞活力[(40.7±1.9)%]顯著低于SC+Aβ組[(54.5±7.5)%](P<0.05)，SC+Aβ組細(xì)胞凋亡率[(32.4±3.0)%]顯著低于siLRP2+Aβ組[(51.8±4.2)%](P<0.01)，提示抑制LRP2表達(dá)可以使Aβ1-42的細(xì)胞毒性增加。

MAPKs是廣泛表達(dá)的絲氨酸/酪氨酸激酶，是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要由ERK、JNK和p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組成，可被一系列細(xì)胞外的刺激信號激活并介導(dǎo)信號從細(xì)胞膜向細(xì)胞核傳導(dǎo)，與細(xì)胞炎癥反應(yīng)[28]、凋亡等密切相關(guān)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可以通過激活JNK及p38通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[29]。Aβ可以通過激活ERK和AKT信號通路參與AD疾病進(jìn)展[30]。為了明確該途徑是否參與抑制LRP2的表達(dá)促進(jìn)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，本研究在SH-SY5Y細(xì)胞系中干擾LRP2后，予以Aβ刺激細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步觀察ERK、p38以及JNK蛋白磷酸化的變化。結(jié)果顯示，抑制LRP2表達(dá)后JNK磷酸化水平增加，而ERK和p38磷酸化無明顯變化。為了明確JNK信號通路是否直接介導(dǎo)了抑制LRP2促進(jìn)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，本研究在Aβ刺激前先予以JNK特異性抑制劑SP600125預(yù)處理，結(jié)果顯示，JNK抑制劑不能逆轉(zhuǎn)LRP2抑制導(dǎo)致的Caspase-3激活增加，提示JNK信號通路可能不是直接發(fā)揮作用的。研究顯示，在海馬及皮質(zhì)神經(jīng)元中抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)磷酸化可增強(qiáng)Caspase-3的活化，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡[31]。本研究小組前期通過免疫熒光和免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中LRP2可以與AKT發(fā)生相互作用，調(diào)控其磷酸化水平參與AD發(fā)病發(fā)展[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，AKT信號通路與JNK通路存在交互作用[33]，抑制PI3K/AKT信號通路可以促進(jìn)JNK激活[34]。因此，推測抑制LPR2后對JNK通路的影響可能是受AKT磷酸化水平改變而活化的繼發(fā)(次要)調(diào)節(jié)途徑。這一推測仍需要在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究采用20 μmol Aβ1-42的SH-SY5Y細(xì)胞作為AD細(xì)胞模型，觀察到在AD細(xì)胞模型中LRP2蛋白表達(dá)下調(diào)。通過小干擾RNA抑制LRP2表達(dá)后，可以促進(jìn)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。抑制LRP2表達(dá)后JNK磷酸化水平增加，ERK和p38磷酸化無明顯變化。JNK抑制劑不能逆轉(zhuǎn)LRP2抑制導(dǎo)致的Caspase-3激活增加，提示JNK信號通路可能不是直接發(fā)揮作用的。因此，本研究推測抑制LRP2表達(dá)促進(jìn)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能并不影響MAPKs信號通路，具體機(jī)制有待于更深入的研究。