牛大力黃酮類成分提取條件的優(yōu)化

勾 玲 唐 珍 蘇春藍(lán) 姚水蓮 盧海嘯*

（1.玉林師范學(xué)院 廣西玉林 537000；2.桂林旅游學(xué)院）

1 前言

牛大力是豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤M(fèi)illettia Speciosa Champ.的干燥根[1]，俗稱山蓮藕、血藤、大力薯等。在兩廣地區(qū)廣泛用作煲湯原料，是“舒筋健腰丸”“壯腰健腎丸”等十余種名優(yōu)中成藥的原料藥[2，3]。而目前對牛大力的研究主要集中于栽培[4]、多糖提取[5]、藥理活性[6]等方面，黃酮類成分加熱回流提取方面尚未見報(bào)道。本文以芒柄花素含量[7]和浸膏得率為指標(biāo)優(yōu)選牛大力黃酮類成分的最佳提取條件，為提高牛大力黃酮提取效率提供參考。

2 材料、儀器與方法

2.1 材料與儀器

材料：牛大力藥材飲片（廣西泰嶸藥業(yè)有限公司，170201）；芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物，F(xiàn)27J7S18516，純度≥98%）；乙腈、甲醇（色譜純）；冰已酸（分析純）；乙醇（工業(yè)乙醇）。

儀器：高效液相色譜儀（島津）；Inersustrain C18 柱；智能數(shù)顯恒溫水浴鍋；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；數(shù)控超聲清洗器；循環(huán)水式多用真空泵；純水機(jī)。

2.2 方法

2.2.1 芒柄花素含量的測定方法建立及結(jié)果

（1）色譜條件

Inersustrain C18 色譜柱，二極管陣列檢測器（PDA），流動(dòng)相比例為乙腈∶1%冰乙酸（37.2∶62.5），檢測波長：260 nm，流速：1.5 mL/min，柱溫：35℃，進(jìn)樣體積：10 μL。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品0.002 5 g，甲醇溶解，定容至25 mL 容量瓶中，配制成0.1 mg/ml 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用（1）中色譜條件，改變進(jìn)樣量，設(shè)置連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣量為 2、4、6、8、10、12 μL，以標(biāo)準(zhǔn)品各進(jìn)樣量所得峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，得到芒柄花素回歸方程：Y=272625X+29687，R2=0.999 9。表明芒柄花素在該色譜條件下呈良好的線性關(guān)系，色譜圖詳見圖1。

圖1 芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品

（3）精密度試驗(yàn)

取（2）中標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用（1）中色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得峰面積平均數(shù)為：2 749 491.17，標(biāo)準(zhǔn)方差為：5 820.43，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為：0.20%，表明儀器精密性良好。同樣的色譜條件下進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)與加樣回收率試驗(yàn)，RSD 均小于2.0%，方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。

2.2.2 制備供試品溶液制備方法

精密稱取牛大力中粉（過藥典4 號(hào)篩）1.001 6 g，加入50%工業(yè)乙醇10 mL，70℃水浴加熱回流提取1 h，提取完冷卻后補(bǔ)足損溶劑。濾紙過濾，取續(xù)濾液，過直徑為0.22 μm 微孔濾膜置1.5 mL 取樣瓶中，供試品中芒柄花素保留時(shí)間與對照品一致，出峰時(shí)間約在10.3 min。色譜圖詳見圖2。

圖2 供試品中的芒柄花素

（1）芒柄花素含量計(jì)算公式

其中，A供—供試品峰面積；A對—對照品峰面積；W—供試品重量，g。

（2）浸膏得率計(jì)算公式

其中，M1—干浸膏重量；M2—藥材重量；V—提取液體積，mL。

2.2.3 牛大力提取的單因素試驗(yàn)方法

牛大力提取的單因素試驗(yàn)方法詳見表1。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3 結(jié)果和討論

3.1 粒度對牛大力提取效果的影響

粒度對牛大力提取效果的影響顯著，粗粉、中粉、細(xì)粉的浸膏得率（%）分別為 3.16±0.08、4.3±0.133、6.6±0.231，芒柄花素含量（μg/g）分別為 56.76±1.36、64.6±2.65、83.56±2.51。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，顆粒越細(xì)，提取物的浸膏得率和芒柄花素含量越高。粗粉提取率和芒柄花素含量都較低，而細(xì)粉浸膏得率和芒柄花素含量都是最高的，提取時(shí)應(yīng)選擇細(xì)粉。

3.2 料液比對牛大力提取效果的影響

料液比對牛大力提取效果的影響結(jié)果詳見表2。

表2 料液比對浸膏得率和芒柄花素含量的影響

由表2 可知，料液比越低，浸膏得率越大，且當(dāng)料液比為1∶20 時(shí)，芒柄花素含量最高。同等條件下，粒度越細(xì)，提取溶劑與藥材粉末的比表面積接觸越大，提取越充分，料液比越低，溶解在提取劑中的物質(zhì)比例越高。從本研究可以看出，粒度越小，料液比越低，提取物浸膏得率都呈明顯上升趨勢，當(dāng)料液比較低時(shí)，增加了料液體系間有效成分的濃度差?？紤]到降低能耗和功效成分的有效提取，選擇細(xì)粉、1∶20料液比比較合適。

3.3 提取溶劑濃度對牛大力提取效果的影響

提取溶劑濃度對牛大力提取效果的影響結(jié)果詳見表3。

表3 提取溶劑濃度對浸膏得率和芒柄花素含量的影響

由表3 可知，隨著提取溶劑中乙醇含量的增加，提取浸膏得率逐步下降，而芒柄花素是先升高后急劇下降再升高的趨勢，當(dāng)使用90%工業(yè)已醇提取時(shí)，芒柄花素含量達(dá)到最大值。牛大力中含有豐富的多糖等水溶性物質(zhì)，乙醇作為提取溶劑可以除去一些親水性的黏液質(zhì)、果膠、淀粉和部分多糖及其他水溶性雜質(zhì)；在乙醇濃度40%～90%時(shí)，水溶性浸出物溶出減少，浸膏得率逐步降低，90%乙醇提取時(shí)芒柄花素含量是40%乙醇提取的將近1.5 倍?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)效率，選擇80%乙醇進(jìn)行提取較為合適。

3.4 提取溫度對牛大力提取效果的影響

提取溫度對牛大力提取效果的影響顯著，50℃、60℃、70℃、80℃、90℃時(shí)的浸膏得率（%）分別為 3.00±0.13、3.44±0.14、2.76±0.12、3.73±0.14、3.70±0.15，芒柄花素含量（μg/g）分別為 74.02±2.94、81.83±2.65、86.51±2.01、90.12±2.55、29.12±1.12。

隨著提取溫度的升高，浸膏得率呈現(xiàn)升高后降低再升高的趨勢，芒柄花素含量在80℃前都呈緩慢上升趨勢，90℃時(shí)急劇下降。表明不同的提取溫度對牛大力中芒柄花素的提取有一定的影響，在50℃～80℃內(nèi)，隨著溫度的升高，芒柄花素的含量呈上升趨勢，在90℃時(shí)提取液中芒柄花素含量急劇下降，這可能是芒柄花素的酚羥基在高溫下易被氧化[8，9]，導(dǎo)致部分芒柄花素結(jié)構(gòu)受到破壞，因此提取溫度應(yīng)低于90℃。考慮到實(shí)際生產(chǎn)效率及可操作性，選擇80℃作為提取溫度比較合適。

3.5 提取次數(shù)對牛大力提取效果的影響

提取次數(shù)對牛大力提取效果的影響顯著，1～5 次提取梯度中，浸膏得率（%）分別為 3.00±0.14、6.78±0.24、7.69±0.22、8.30±0.27、8.26±0.25，芒柄花素含量（μg/g）分別為 85.11±2.64、100.00±3.65、106.00±3.21、110.02±3.55、110.94±2.32。

隨著提取次數(shù)的增加，浸膏得率和芒柄花素含量都逐步升高，在提取4 次與5 次時(shí)增幅較小，提取次數(shù)對浸膏得率和芒柄花素含量都有明顯的影響，提取超過3 次后，升高趨勢已不明顯，說明原藥材中芒柄花素等在提取3 次后已接近全部溶出?？紤]生產(chǎn)效率和成本問題，選擇提取2 次較為合適。

3.6 提取時(shí)間對牛大力提取效果的影響

提取時(shí)間對牛大力提取效果的影響顯著，其中1、1.5、2、3、4 h 的浸膏得率（%）分別為 2.91±0.10、2.98±0.14、3.39±0.16、4.12±0.12、2.37±0.09，芒柄花素含量（μg/g）分別為 87.52±2.34、93.78±2.65、87.56±2.31、56.52±2.45、57.43±1.62。

隨著提取時(shí)間的延長，浸膏得率在3 h 以前呈上升趨勢，提取時(shí)間在4 h 時(shí)顯著降低，而芒柄花素含量在1.5 h 提取時(shí)間時(shí)達(dá)到最高，提取時(shí)間在1～1.5 h時(shí)，芒柄花素含量逐漸增多，超過2 h 后芒柄花素含量急劇降低，可能是長時(shí)間高溫加熱狀態(tài)下，芒柄花素的酚羥基被氧化從而造成提取液中芒柄花素含量降低?？紤]生產(chǎn)效率和成本問題，選擇提取時(shí)間為1.5 h較為合適。

4 結(jié)論

通過對牛大力熱回流提取工藝的單因素考察試驗(yàn)，最終確定了提取牛大力的最佳工藝條件為：細(xì)粉、80%乙醇提取、料液比1∶20、提取溫度80℃、提取時(shí)間1.5 h、提取次數(shù)2 次。