HCY及MTHFR多態(tài)性與冠心病易感性的關(guān)系

遲潔 宮艷艷 鄭霄 楊娜 姚筱

冠心病是指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，隨著吸煙、高血脂、糖尿病和高血壓等多種危險(xiǎn)因素的影響，其患病率呈逐年升高的傾向。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是含硫氨基酸的蛋白質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，Hcy明顯增加血管粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而參與冠心病的發(fā)生發(fā)展[1]。謝軍等[2]研究亦表明，高Hcy血癥史心腦血管病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。葉酸代謝相關(guān)酶亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是Hcy代謝過(guò)程的主要蛋白酶，可能受地域、種族等多種因素的影響。MTHFR 基因突變影響MTHFR 酶活性，最終影響Hcy代謝，而關(guān)于Hcy及MTHFR多態(tài)性與冠心病易感性之間關(guān)系的確切結(jié)論尚未明確[3]。本研究探討血漿Hcy及MTHFR C677T、A1298C多態(tài)性與冠心病的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2018年1月至2019年1月期間心內(nèi)科住院部收治的185例冠心病患者作為病例組，年齡40～86歲，同期選取180例年齡相匹配的非冠心病患者作為對(duì)照組。2組在性別比、年齡、體重指數(shù)、吸煙史、高血壓病史、高脂血癥病史和遺傳病家族史等一般資料之間的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組一般資料之間的比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：病例組患者符合冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)冠脈造影證實(shí)右冠狀動(dòng)脈、回旋支、左前降支、左主干中血管狹窄>50%。對(duì)照組排除冠心病的診斷，全部研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)和倫理志愿書(shū)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)[5]：嚴(yán)重肝腎功能障礙、自身免疫性疾病、心力衰竭、糖尿病、銀屑病、硬皮病、貧血、消化道病變、腫瘤、風(fēng)濕性疾病、甲狀腺功能低下、近期服用阿扎立平、避孕藥、環(huán)孢素、甲氧芐氨嘧啶、甲氨蝶呤、卡馬西平、苯妥英鈉、維生素B12、維生素B6、葉酸等影響Hcy代謝的藥物。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血漿Hcy：全部研究對(duì)象采集空腹(禁食12 h)靜脈血10 ml置于EDTA抗凝管內(nèi)，1 h內(nèi)采用離心轉(zhuǎn)速(3 000 r/min)，離心半徑(8 cm)進(jìn)行離心操作5 min，使用全自動(dòng)生化分析儀(日立7 600，日本Hitachi公司)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定血漿Hcy水平，嚴(yán)格按照試劑盒(深圳奧薩制藥公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，正常參考值為1～10 μmol/L。

1.3.2 MTHFR：使用無(wú)菌棉拭子在口腔內(nèi)側(cè)刮拭40次以上，以略鼓起為適宜，采集口腔黏膜上皮細(xì)胞，采用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)MTHFR C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)基因型。首先使用核酸提取試劑盒(上海百傲科技公司)提取脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)。PCR引物(MTHFR C677T-上游5’-GAAAAGCTGCGTGATGATG-3’，下游5’-TTGAAGGAGAAGGTGTC-3’，MTHFR A1298C-上游5’-AAGAAGAAGACTTCAAA-3’、下游5’-TGGGGGGA

GGAGCTGAC-3’)。Taqman-MGB 探針基因序列(MTHFR C677T-V2 5’-AATCGGCTCCCGC-3’、MTHFR

C677T-M2 5’-AATCGACTCCCGC-3’，MTHFR A1298C-V2 5’-ACACTTGCTTCACT-3’、MTHFR A1298C-M2 5’-ACACTTTCTTCAC T-3’)。試劑盒和儀器均由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems，ABI)公司提供，使用Taqman-MGB技術(shù)檢測(cè)，對(duì)2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，體系10 μl(去離子水3.5 μl，Taqman-MGB 探針0.5 μl，Taqman Universal Master Mix 5 μl，20 mg/L DNA模板1 μl)，條件：95 ℃預(yù)變性10 min→(92℃變性15 s、60℃退火延長(zhǎng)1 min)×20cycles，擴(kuò)增→(89℃變性15 s、60℃退火延長(zhǎng)1.5 min)×30cycles，擴(kuò)增。在熒光定量 PCR 儀(7900，ABI 公司)的熒光端讀取樣品孔，軟件分析各樣本的基因分型。

2 結(jié)果

2.1 2組MTHFR位點(diǎn)基因頻率分布情況 MTHFR C677T位點(diǎn)基因型主要包括 TT、CT和CC，MTHFR A1298C位點(diǎn)基因型主要包括 CC、AC和AA。病例組MTHFR C677T、A1298C 位點(diǎn)基因多態(tài)性的檢驗(yàn)結(jié)果符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡(χ2=1.014、0.501，P>0.05)，對(duì)照組檢驗(yàn)結(jié)果亦符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(χ2=0.415、0.741，P>0.05)，表明樣本具有群體代表性。病例組MTHFR C677T位點(diǎn)TT基因型頻率和T等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，CC基因型頻率和C等位基因頻率明顯低于對(duì)照組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，2組MTHFR A1298C位點(diǎn)CC、AC、AA基因型頻率和等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2、3。

表2 2組MTHFR位點(diǎn)基因頻率分布情況 例(%)

表3 2組MTHFR等位基因頻率分布情況 例(%)

2.2 2組血漿Hcy水平的關(guān)系 病例組血漿Hcy水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，按MTHFR C677T基因型分布，2組 TT、CT和CC基因型血清Hcy水平依次降低，TT基因型血清Hcy水平明顯高于CT和CC基因型，CT基因型血清Hcy水平明顯高于CC基因型(P<0.05)。按MTHFR A1298C基因型分布，CC、AC和AA血清Hcy水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

組別HcyMTHFR C677TTTCTCCMTHFR A1298CCCACAA病例組(n=185)17.54±11.0322.01±13.0116.61±9.96*12.36±8.01*#15.14±6.9416.02±8.0118.58±9.91對(duì)照組(n=180)10.85±8.1214.11±5.0111.02±3.98*9.01±4.02*#10.23±4.1510.39±5.2811.17±6.03t值6.5847.6167.0055.0298.1767.9068.601P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與TT比較，*P<0.05；與CT比較，#P<0.05

2.3 Hcy及MTHFR位點(diǎn)基因與冠心病易感性的關(guān)系 攜帶MTHFR C677T TT位點(diǎn)基因型和Hcy>10 μmol/L是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=2.068，2.154，P<0.001)，攜帶MTHFR C677T CC位點(diǎn)基因型是冠心病的獨(dú)立保護(hù)因素(OR=0.502，P<0.001)。見(jiàn)表5。

表5 MTHFR位點(diǎn)基因與冠心病易感性的關(guān)系

3 討論

Hcy是蛋氨酸的中間代謝產(chǎn)物，其含量增加導(dǎo)致血管粥樣硬化的機(jī)制主要包括：(1)通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞Fas，增加血管內(nèi)皮素-1，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。(2)通過(guò)氧化自由基、抑制前列環(huán)素和一氧化氮的形成，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和高血壓。(3)通過(guò)誘導(dǎo)祖細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和促進(jìn)膠原纖維形成導(dǎo)致血管平滑肌增生和血管硬化。易志強(qiáng)等[6]研究表明，高Hcy血癥是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。MTHFR是Hcy再甲基化代謝途徑的主要蛋白酶，且具有多態(tài)性[7]。當(dāng)MTHFR基因突變可導(dǎo)致酶活性下降，導(dǎo)致Hcy代謝異常而導(dǎo)致血漿Hcy水平增高。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，MTHFR多態(tài)性與高血壓及冠心病具有緊密的關(guān)系[8]。而胡晨鳴等[9]研究則表明，MTHFR多態(tài)性與冠心病無(wú)明顯關(guān)系。因此，臨床上更致力于Hcy及MTHFR多態(tài)性與冠心病易感性之間關(guān)系的研究。

本研究結(jié)果顯示，與非冠心病患者比較，冠心病患者血漿Hcy水平明顯增高，與陳映慧等[10]結(jié)果相一致。Hcy的機(jī)體代謝可能受維生素B12、維生素B6、葉酸和MTHFR代謝酶活性等因素的影響[11]。其中MTHFR代謝酶是Hcy代謝途徑中的主要蛋白酶之一，其活性下降可能導(dǎo)致血漿Hcy水平明顯增高。MTHFR基因突變可能導(dǎo)致酶活性明顯降低，Hcy水平明顯升高，進(jìn)而增加冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，MTHFR基因主要包括MTHFR C677T、MTHFR A1298C位點(diǎn)，但研究發(fā)現(xiàn)這2個(gè)位點(diǎn)基因與冠心病關(guān)系的研究結(jié)論尚不一致，甚至相反[12]。本研究顯示，MTHFR C677T位點(diǎn)基因型主要包括 TT、CT和CC ，其中以CT型所占比例最高，MTHFR A1298C位點(diǎn)基因型主要包括CC、AC和AA，其中以AA型所占比例最高，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果[13]一致。進(jìn)一步研究顯示，冠心病患者M(jìn)THFR C677T位點(diǎn)TT基因型頻率和T等位基因頻率較非冠心病患者明顯增高，CC基因型頻率和C等位基因頻率較非冠心病患者明顯降低，提示MTHFR C677T位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病具有緊密的關(guān)系，攜帶T等位基因的人群出現(xiàn)冠心病的風(fēng)險(xiǎn)較高，T等位基因可作為冠心病的易感基因[14]。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，MTHFR C677T TT基因型血清Hcy水平明顯高于CT和CC基因型，CT基因型血清Hcy水平明顯高于CC基因型，與何冠軍等[15]研究結(jié)果相一致。由此可推斷，與攜帶MTHFR C677T CT、CC位點(diǎn)基因型患者比較，攜帶TT基因可更明顯促使Hcy水平升高，加重冠心病的風(fēng)險(xiǎn)[16]。而本研究就MTHFR A1298C基因型分布進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者與非冠心病患者2組MTHFR A1298C位點(diǎn)CC、AC、AA基因型頻率和A、C等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且CC、AC和AA基因型血清Hcy水平無(wú)明顯差異，可見(jiàn)MTHFR A1298C基因多態(tài)性與冠心病無(wú)明顯關(guān)系，與相關(guān)研究結(jié)果[17]一致。趙艷梅等[18]研究表明，MTHFR C677T位點(diǎn)基因突變可能導(dǎo)致蛋白酶由于熱不穩(wěn)定所致活性降低，導(dǎo)致Hcy再甲基化代謝異常，最終導(dǎo)致Hcy水平明顯增高，增加冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。可見(jiàn)Hcy及其代謝酶MTHFR 活性的異常改變是冠心病的易感因素。筆者認(rèn)為，在冠心病的預(yù)防和治療期間，重視Hcy及其代謝酶(MTHFR)多態(tài)性對(duì)臨床干預(yù)方案的制定具有重要的指導(dǎo)作用，但由于冠心病受多種病理因素的影響，在制定臨床干預(yù)方案期間仍需綜合考慮地域、性別、年齡、合并癥等因素。因此，MTHFR C677T位點(diǎn)基因多態(tài)性可能參與冠心病的發(fā)生發(fā)展期間。

綜上所述，攜帶MTHFR C677T TT位點(diǎn)基因型和Hcy>10 μmol/L是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，攜帶MTHFR C677T CC位點(diǎn)基因型是冠心病的獨(dú)立保護(hù)因素，Hcy升高和MTHFR TT基因廣泛分布可作為冠心病的易感因素參與疾病發(fā)生發(fā)展期間。但由于本研究樣本量較少，結(jié)果容易出現(xiàn)偏倚，更確切的結(jié)論尚有待多中心大樣本的研究探討。