一測(cè)多評(píng)法測(cè)定6種大豆異黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

李 秀， 馬家輝， 顧 陽(yáng)， 楊 燕， 成向榮

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

大豆異黃酮是豆類生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，在大豆及其制品中含量豐富。作為豆類及其制品中重要的生物活性物質(zhì)，其抗氧化等生理活性[1-6]，受到營(yíng)養(yǎng)學(xué)家廣泛關(guān)注。人們從大豆中成功分離出的大豆異黃酮已經(jīng)達(dá)到12種，包括3種游離型異黃酮苷元、3種異黃酮葡萄糖苷、3種異黃酮乙酰基葡萄糖苷和3種異黃酮丙二?；咸烟擒誟7-8]。其中，異黃酮乙?；咸烟擒?、丙二?；咸烟擒赵诙怪破芳庸み^(guò)程中較不穩(wěn)定，且對(duì)照品極難制備與獲取。目前美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)AOAC主要通過(guò)對(duì)大豆及其制品進(jìn)行提取、皂化后進(jìn)行HPLC測(cè)定大豆異黃酮苷元及葡萄糖苷的含量[9]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)6種大豆異黃酮的測(cè)定主要參照《保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法 高效液相色譜法》（GB/T23788-2009）[10]和《糧油檢測(cè) 大豆異黃酮含量測(cè)定 高效液相色譜法》（GB/T26625-2011）[11]。這兩種國(guó)標(biāo)方法均是對(duì)大豆苷、大豆苷元、黃豆苷元、黃豆黃素、染料木苷、染料木素等6種大豆異黃酮進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，需要購(gòu)置多個(gè)對(duì)照品配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測(cè)效率相對(duì)較低且增加檢測(cè)成本[12]。

“一測(cè)多評(píng)”法 （quantitative analysis of multicomponents by single-marker， QAMS）是近年來(lái)主要應(yīng)用于中藥領(lǐng)域的多成分質(zhì)量控制的研究方法，它運(yùn)用成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，采用單個(gè)易獲得的對(duì)照品對(duì)多個(gè)成分進(jìn)行定量，實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分（對(duì)照品沒(méi)有或難以供應(yīng)）的同步測(cè)定，目前已用于解決中藥質(zhì)量控制中缺乏對(duì)照品這一瓶頸問(wèn)題[13-15]。作者以豆制品中含量豐富、對(duì)照品易得的大豆苷為參照，通過(guò)分析大豆苷、大豆苷元、黃豆苷元、黃豆黃素、染料木苷、染料木素等6種大豆異黃酮在高效液相色譜行為學(xué)上的差異，基于它們的結(jié)構(gòu)共性，尋找在色譜行為學(xué)及光譜學(xué)上的內(nèi)在聯(lián)系，以此建立大豆異黃酮的一測(cè)多評(píng)分析方法，并運(yùn)用于常見的大豆及其制品中大豆異黃酮的含量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆苷、大豆苷元、黃豆苷元、黃豆黃素、染料木苷、染料木素：江蘇永健公司產(chǎn)品；甲醇（色譜純）、甲酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀：島津公司產(chǎn)品；1525高效液相色譜儀：沃特世公司產(chǎn)品；1100高效液相色譜儀；Inertsil ODS-SP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Ultimate AQ C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）、Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）：安捷倫公司產(chǎn)品；UV2300雙光束紫外可見分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 稱取腐竹、豆腐干、千張、大豆和豆腐樣品10～50 g，粉碎，55℃真空干燥 24 h，進(jìn)一步粉碎后過(guò)100目篩，精密稱取0.2 g，置于試管中，加入5 mL甲醇，密塞，超聲提取30 min，用甲醇補(bǔ)足原質(zhì)量，離心過(guò)濾，濾液備用。

1.3.2 對(duì)照品處理 精確稱取大豆苷14.4 mg，大豆苷元3.0 mg，黃豆黃苷3.0 mg，黃豆黃素1.2 mg，染料木苷1.2 mg，染料木素6 mg，置于100 mL燒杯中，混合，先加少量甲醇溶解后，移入200 mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為72、15、15、6、6、30 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，并等比例稀釋2.5倍5次，得到6個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度的溶液，以制作混合對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定線性范圍。

另精確稱取大豆苷14.4 mg，大豆苷元3.0 mg，黃豆黃苷3.0 mg，黃豆黃素1.2 mg，染料木苷1.2mg，染料木素6 mg，先加少量甲醇溶解后，分別移入200 mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為 72、15、15、6、6、30 μg/mL 的單一對(duì)照品溶液，與混合對(duì)照品一樣分別按等比例稀釋2.5倍5次，得到6個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度的6組單一對(duì)照品溶液，以制作6種大豆異黃酮單一對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 色譜條件 采用島津LC-20A高效液相色譜儀進(jìn)行大豆異黃酮的檢測(cè)，色譜柱：InertsilODS-SPC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫 30℃；進(jìn)樣量 10 μL；雙檢測(cè)波長(zhǎng)262 nm和248 nm；流量1.0 mL/min；流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸水溶液，B為甲醇，并設(shè)計(jì)了3組洗脫程序：

0～60 min，B： 體積分?jǐn)?shù) 55%等度洗脫；0～20 min，B：35%～55%梯度；20～35 min，B：55%等度洗脫；0～30 min，B：30%～90%梯度洗脫。

1.3.4 建立一測(cè)多評(píng)分析方法

1）線性關(guān)系考察 分別精密吸取6個(gè)質(zhì)量濃度梯度的混合對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，按1.3.3色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品溶液的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算6種大豆異黃酮的回歸方程，確定線性范圍。

2）相對(duì)校正因子、相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的計(jì)算 分別精密吸取6個(gè)不同質(zhì)量濃度的單一對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，按1.3.3色譜條件測(cè)定。對(duì)262 nm下的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，按公式1計(jì)算以大豆苷為內(nèi)參物，對(duì)黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的相對(duì)校正因子fk/m；按公式2計(jì)算以大豆苷為內(nèi)參物的相對(duì)保留時(shí)間Tm/k。計(jì)算262 nm和248 nm下的峰面積比值，即為相對(duì)峰面積，記為A262/248[16]。

式（1）、（2）中：Wk為內(nèi)參物k的質(zhì)量濃度；Ak為內(nèi)參物k的峰面積；Wm為待測(cè)成分m的質(zhì)量濃度；Am為待測(cè)成分m的峰面積；Tk，Tm分別為待測(cè)成分和內(nèi)參物的保留時(shí)間。

3）精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣6次，按1.3.3色譜條件測(cè)定，記錄262 nm下的色譜圖，測(cè)定峰面積。計(jì)算6種大豆異黃酮各成分峰面積的RSD值。

4）穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，分別在 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)， 精密吸取 10 μL 注入高效液相色譜儀中，按1.3.3色譜條件測(cè)定，記錄262 nm下的色譜峰，測(cè)定峰面積。計(jì)算6種大豆異黃酮各成分峰面積的RSD值。

5）重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取腐竹樣品粉末0.2 g，共6份，按1.3.1樣品溶液的處理方法制備后，精密吸取10 μL按1.3.3色譜條件進(jìn)樣，記錄262 nm下的色譜圖，測(cè)定峰面積。采用一測(cè)多評(píng)分析方法，大豆苷的含量按外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定，再結(jié)合相對(duì)校正因子，按如下公式3計(jì)算樣品中另外5種大豆異黃酮的含量[17]。

式（3）中：Wk為內(nèi)參物k的質(zhì)量濃度；Ak為內(nèi)參物k的峰面積；Wm為待測(cè)成分m的質(zhì)量濃度；Am為待測(cè)成分m的峰面積。

6）加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取適量已測(cè)定含量的樣品粉末6份，分別加入一定量的大豆苷、黃

1.3.5 耐用性試驗(yàn) 在1.3.3色譜條件下，改用安捷倫和沃特世的高效液相色譜儀以及UltimateAQC18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，進(jìn)行測(cè)定，記錄 262 nm 下的色譜圖，測(cè)定峰面積，計(jì)算以大豆苷為內(nèi)參物，對(duì)于黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的相對(duì)校正因子，考察3個(gè)不同品牌的高效液相色譜儀以及3根不同品牌的色譜柱對(duì)其相對(duì)校正因子的影響。

在1.3.3色譜條件下，改變流量（0.9，1.0，1.1，1.2 mL/min）和柱溫（25， 30， 35 ℃），進(jìn)行測(cè)定，記錄262 nm下的色譜圖，測(cè)定峰面積，計(jì)算以大豆苷為內(nèi)參物，對(duì)于黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的相對(duì)校正因子，考察流速和溫度對(duì)其相對(duì)校正因子的影響。

1.3.6 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按照1.3.5的步驟，記錄262 nm和248 nm下的色譜圖，測(cè)定峰面積。并記錄262 nm下6種大豆異黃酮的保留時(shí)間，然后以大豆苷為內(nèi)參物，計(jì)算對(duì)黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的相對(duì)保留時(shí)間。

1.3.7 驗(yàn)證比對(duì) 精密吸取樣品溶液、混合對(duì)照品溶液以及單一大豆苷對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，按1.3.3色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算待測(cè)樣品中的6種大豆異黃酮含量。并將常規(guī)的外標(biāo)法實(shí)測(cè)含量與一測(cè)多評(píng)計(jì)算的含量采用夾角余弦值進(jìn)行比較，公式如式（5），驗(yàn)證建立的一測(cè)多評(píng)分析方法的準(zhǔn)確性[19]。豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素對(duì)照品溶液，按1.3.2樣品溶液的處理方法制備加標(biāo)樣品后，分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀中，按1.3.3色譜條件測(cè)定，記錄262 nm下的色譜圖，測(cè)定峰面積。按如下公式計(jì)算加樣回收率[18]。

對(duì)建立的一測(cè)多評(píng)分析方法進(jìn)行應(yīng)用與驗(yàn)證時(shí)，按如下公式6計(jì)算兩種方法的相對(duì)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 一測(cè)多評(píng)方法的建立

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化 6種大豆異黃酮的甲醇溶液在200～400 nm進(jìn)行紫外波長(zhǎng)下掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異黃酮分別在208、248、262 nm處出現(xiàn)明顯吸收峰（圖1）。為了減少溶劑的干擾的影響，選用262 nm作為HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)為了較好地識(shí)別待測(cè)色譜峰，選用248 nm作為輔助的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 6種大豆異黃酮的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet spectra of six soybean isoflavones

周光明等人[20]在測(cè)定綠豆芽4種大豆異黃酮含量時(shí)，液相色譜條件采用的流動(dòng)相為A：體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸水溶液，B：乙腈；洗脫程序?yàn)椋?～10 min，B：5%～80%；10～16 min，B：80%；16～22 min，B：80%～5%。于寒松等人[8]在測(cè)定12種大豆異黃酮時(shí)，液相色譜條件采用的流動(dòng)相為A：體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸水溶液，B：體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸的乙腈溶液。洗脫程序?yàn)椋?～80 min，B：體積分?jǐn)?shù)13%～40%。作者參考了上述的色譜條件，并設(shè)計(jì)了3組洗脫程序（見實(shí)驗(yàn)方法1.3.3）?？紤]到大豆及其制品中存在較多的水溶性成分，可能對(duì)待測(cè)目標(biāo)成分形成干擾，因此控制待測(cè)目標(biāo)成分在10 min后出峰。其中洗脫程序（2）可以較好的分離所測(cè)的6個(gè)大豆異黃酮，且分析所需的總時(shí)間較短，可在35 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)6個(gè)目標(biāo)大豆異黃酮，優(yōu)于另外兩個(gè)洗脫程序。

經(jīng)優(yōu)化后，確定高效液相色譜分析條件如下：色譜儀：島津LC-20A高效液相色譜儀；色譜柱：Inertsil ODS-SP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸水溶液，B為甲醇；洗脫程序如下；流量為 1.0 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm和248 nm。

2.1.2 線性關(guān)系 對(duì)6個(gè)梯度質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC分析，色譜圖如圖2所示。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到6種大豆異黃酮對(duì)照品的回歸方程，見下表1。分析結(jié)果表明，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素在各自的線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.999 9）。

2.1.3 相對(duì)校正因子 按實(shí)驗(yàn)方法1.3.3進(jìn)行大豆異黃酮對(duì)照品的混標(biāo)分析，根據(jù)公式1計(jì)算以大豆苷為內(nèi)參物，對(duì)黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的相對(duì)校正因子[21]，結(jié)果如下表2所示。在262 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，相對(duì)校正因子分別為f大豆苷/黃豆黃苷=1.078 6，f大豆苷/染料木苷=1.918 5，f大豆苷/大豆苷元=1.897 2，f大豆苷/黃豆黃素=3.070 0，f大豆苷/染料木素=3.168 4，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.10%、1.85%、1.76%、1.40%和0.56%，RSD均＜2.0%，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果平行性較好[22]。

2.1.4 精密度 對(duì)同一混合對(duì)照品溶液進(jìn)行精密度試驗(yàn)，結(jié)果顯示大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素RSD值分別為0.90%、0.90%、0.88%、0.85%、0.87%和 1.12%， 表明本方法精密度良好。

圖2 6個(gè)質(zhì)量濃度梯度的混合對(duì)照品色譜圖Fig.2 HPLC analysis of six soybean isoflavones with different concentrations

2.1.5 穩(wěn)定性 對(duì)同一混合對(duì)照品溶液進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果顯示大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素RSD值分別為1.71%、1.63%、1.81%、1.75%、1.88%和 1.08%，表明該樣品在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性 以腐竹為待測(cè)樣品進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，采用外標(biāo)法測(cè)定腐竹中大豆苷的含量，一測(cè)多評(píng)法測(cè)定其它5種大豆異黃酮的含量。結(jié)果顯示大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素 RSD值分別為 1.13%、2.05%、2.05%、2.02%、2.19%和2.23%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率 大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的加樣回收率分別為 102.71% 、99.57% 、100.24% 、97.36% 、99.35% 和98.14%，其 RSD分別為 0.42%，0.38%、1.64%、1.49%、2.20%和0.52%，結(jié)果表明方法的加樣回收率良好。

表1 6種大豆異黃酮的回歸方程及線性范圍（262 nm）Table 1 Regressive equations and liner range of six soybean isoflavones

表2 大豆苷對(duì)其他5種大豆異黃酮的校正因子Table 2 RCF of daidzein to 5 other soybean isoflavones

2.2 耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性評(píng)價(jià)

2.2.1 不同色譜柱及高效液相色譜儀考察 分析不同品牌液相和不同色譜柱下，大豆異黃酮之間的相對(duì)校正因子，結(jié)果如表3所示。大豆苷對(duì)于其他5種大豆異黃酮的相對(duì)校正因子的平均值為f大豆苷/黃豆黃苷=1.114 1，f大豆苷/染料木苷=1.950 0，f大豆苷/大豆苷元=1.876 4，f大豆苷/黃豆黃素=3.083 7，f大豆苷/染料木素=3.257 4，其RSD值分別為 2.26%、1.83%、2.22%、2.66%、和2.77%，均小于3%，表明本方法適用范圍廣，可適用于不同的儀器和色譜柱，便于推廣應(yīng)用。

2.2.2 流量與柱溫的考察 不同流量的條件下對(duì)6種大豆異黃酮進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算大豆苷對(duì)于其他5種大豆異黃酮的相對(duì)校正因子的RSD值，分別為0.06%、0.14%、0.14%、0.12%和0.25%；在不同溫度的條件下HPLC分析發(fā)現(xiàn)，5種大豆異黃酮的相對(duì)校正因子RSD值分別為0.15%、0.06%、0.15%、0.13%和0.21%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPLC分析時(shí)的流量、柱溫對(duì)6種大豆異黃酮的一測(cè)多評(píng)分析中相對(duì)校正因子的影響極小。

2.2.3 大豆異黃酮色譜峰的指認(rèn) 在僅使用1個(gè)對(duì)照品時(shí)，如何指認(rèn)待測(cè)樣中其他5種大豆異黃酮的色譜峰是影響一測(cè)多評(píng)法高效性、準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。目前，一測(cè)多評(píng)分析過(guò)程中通常采用相對(duì)保留時(shí)間差、光譜相關(guān)色譜進(jìn)行色譜峰指認(rèn)[14]。作者通過(guò)計(jì)算大豆異黃酮與內(nèi)參物大豆苷的相對(duì)保留時(shí)間，以及262、248 nm下色譜峰面積的比值，從而判斷其他5種待測(cè)大豆異黃酮色譜峰的準(zhǔn)確位置。

在改變儀器型號(hào)、色譜柱型號(hào)、流量、柱溫等條件下，分別考察相對(duì)保留值和保留時(shí)間差在不同品牌儀器和不同品牌色譜柱中的重現(xiàn)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間差的波動(dòng)較為明顯，相對(duì)保留值的波動(dòng)相對(duì)較小，采用相對(duì)保留值法進(jìn)行大豆異黃酮類成分色譜峰的定位較為可行。在3個(gè)不同品牌高效液相色譜儀和3根不同品牌色譜柱的條件下，其他5種大豆異黃酮對(duì)于大豆苷的相對(duì)保留時(shí)間分別為T黃豆黃苷/大豆苷=1.10，T染料木苷/大豆苷=1.38，T大豆苷元/大豆苷=2.32，T黃豆黃素/大豆苷=2.47，T染料木素/大豆苷=2.85，如下表 4 所示。 在不同流量條件下，其相對(duì)保留時(shí)間分別為1.10、1.43、2.41、2.51和2.93。在不同溫度條件下，其相對(duì)保留時(shí)間分別為 1.09、1.42、2.34、2.44 和 2.88。在檢測(cè)條件變動(dòng)情況下，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜5%，表明改變這些條件對(duì)其相對(duì)保留時(shí)間的影響不大。

另外，在雙波長(zhǎng)的檢測(cè)條件下，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的平均相對(duì)峰面積比值 A262/248分別為 0.95、1.20、1.42、0.76、1.08 和 1.50，如下表 5 所示。因此，可以在相對(duì)保留時(shí)間基礎(chǔ)上，參照雙波長(zhǎng)下的峰面積比值對(duì)大豆異黃酮的色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確指認(rèn)。

表3 不同品牌液相和不同色譜柱測(cè)得的相對(duì)校正因子Table 3 RCF of daidzein to 5 other soybean isoflavones in different HPLC instruments and columns

表4 不同儀器色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間Table 4 Relative retention time in different instruments and columns

2.3 一測(cè)多評(píng)法準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

以6份腐竹提取液為待測(cè)樣品，分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定提取液中6種大豆異黃酮的含量，結(jié)果分別如表6所示。計(jì)算其他5種大豆異黃酮的一測(cè)多評(píng)計(jì)算含量與外標(biāo)法實(shí)測(cè)含量的夾角余弦值，分別為0.999 98，1.000 00，0.999 99，0.999 98和0.999 99，表明2種方法測(cè)得的含量沒(méi)有顯著性差異，所建立的一測(cè)多評(píng)分析方法有良好的準(zhǔn)確性。

表5 262 nm與248 nm波長(zhǎng)下峰面積的比值Table 5 Peak area ratio of 262 nm to 248 nm

表6 外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法測(cè)定腐竹中6種異黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 6 Contents of six isoflavones in yuba determined by external standard method and QAMS （μg/g）

2.4 一測(cè)多評(píng)法的再驗(yàn)證與應(yīng)用

對(duì)腐竹、豆腐干、千張、大豆和豆腐等豆制品提取液進(jìn)行HPLC分析，采用一測(cè)多評(píng)法計(jì)算6種大豆異黃酮的含量，結(jié)果見圖3。此外，采用外標(biāo)法計(jì)算和驗(yàn)證5種豆制品中大豆異黃酮的含量，按公式6計(jì)算兩種測(cè)定方法下的相對(duì)誤差，結(jié)果顯示黃豆黃苷的測(cè)定相對(duì)誤差為0.06%～1.43%，染料木苷的測(cè)定相對(duì)誤差為0.57～3.65%，大豆苷元的測(cè)定相對(duì)誤差為0.95%～3.72%，黃豆黃素的測(cè)定相對(duì)誤差為0.85%～3.95%，染料木素的測(cè)定相對(duì)誤差為0.07%～2.74%。參考周園等的研究[23]，比較一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法的相對(duì)誤差小于5%，說(shuō)明建立的一測(cè)多評(píng)分析方法測(cè)定結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性和可信度。

對(duì)選取的豆制品中大豆異黃酮含量測(cè)定結(jié)果表明，豆制品中大豆異黃酮以染料木苷、大豆苷為主，異黃酮苷元含量相對(duì)較低，豆腐干中大豆異黃酮的含量高于其他豆制品。研究表明，大豆異黃酮在加工過(guò)程中不同組分間易發(fā)生轉(zhuǎn)化，如加熱導(dǎo)致大豆異黃酮苷分解成苷元[8]。此外，不同氣候、產(chǎn)地等因素，也是導(dǎo)致豆制品原料中大豆異黃酮含量差異的重要因素。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)豆制品中不同大豆異黃酮的定量分析不多，系統(tǒng)評(píng)價(jià)日常膳食中大豆異黃酮的含量，是分析居民大豆異黃酮日攝入量與健康相關(guān)性的重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，而一測(cè)多評(píng)分析技術(shù)可極大促進(jìn)膳食營(yíng)養(yǎng)素、功能因子的含量測(cè)定。

圖3 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定豆制品中大豆異黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.3 Contents of soybean isoflavones in bean products determined by QAMS

3 結(jié) 語(yǔ)

膳食中的天然功能因子，如黃酮、酚酸等，許多以系列衍生物的形式存在，具有結(jié)構(gòu)共性和差異性。通過(guò)分析黃豆苷元、黃豆苷、染料木素、染料木苷、黃豆黃素、黃豆黃苷等6種大豆異黃酮在高效液相色譜行為學(xué)上的差異，基于它們的結(jié)構(gòu)共性，尋找在色譜行為學(xué)及光譜學(xué)上的內(nèi)在聯(lián)系，研究建立了6種大豆異黃酮的一測(cè)多評(píng)方法。通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立了6種大豆異黃酮間的相對(duì)校正因子（262 nm，f大豆苷/黃豆黃苷=1.114 1，f大豆苷/染料木苷=1.950 0，f大豆苷/大豆苷元=1.876 4，f大豆苷/黃豆黃素=3.083 7，f大豆苷/染料木素=3.257 4），以相對(duì)保留時(shí)間（T黃豆黃苷/大豆苷=1.10，T染料木苷/大豆苷=1.38，T大豆苷元/大豆苷=2.32，T黃豆黃素/大豆苷=2.47，T染料木素/大豆苷=2.85）和相對(duì)峰面積（A262/248分別為 0.95，1.20，1.52，0.83，1.08，1.50）對(duì)大豆異黃酮的色譜峰進(jìn)行了準(zhǔn)確指認(rèn)。

對(duì)建立的一測(cè)多評(píng)方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，研究表明本方法精密度高，供試品穩(wěn)定良好，結(jié)果重復(fù)性及加樣回收率高，耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性均表現(xiàn)良好，在不同型號(hào)儀器、色譜柱、流量、柱溫等條件下均可進(jìn)行，便于推廣。對(duì)日常豆制品中異黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明一測(cè)多評(píng)法測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法結(jié)果相對(duì)誤差小，所建立的一測(cè)多評(píng)法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于大豆異黃酮的快速定量分析及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)。