基于適配體識別的側(cè)向?qū)游龇焖贆z測單核細胞增生李斯特氏菌

盧春霞， 李紅敏， 孫鳳霞， 康立超， 陳 亞， 任江濤*， 馬朝陽

（1.長江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 408100；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 分析測試中心，新疆 石河子 832000；3.重慶市涪陵食品藥品檢驗所，重慶408100；4.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）簡稱單增李斯特菌，為革蘭氏陽性無芽孢桿菌，是一種重要的人畜共患病的病原菌，可引起人和多種動物的疾病[1]，致死率為20%～30%。該菌分布范圍廣，危害性大，環(huán)境耐受性較強，被世界衛(wèi)生組織列為食品中四大食源性致病菌之一[2]。因此，發(fā)展快速、準(zhǔn)確、操作簡便的的單核細胞增生李斯特氏菌檢測方法是預(yù)防食源性疾病發(fā)生的重要手段，對保證食品安全具有重要意義。

目前，針對該菌的鑒定和檢測方法主要有3種：1）微生物培養(yǎng)法；2）特異性 DNA 雜交；3）免疫分析技術(shù)。其中，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法耗時長、效率低，無法滿足快速檢測需求?；谔禺愋訢NA雜交的PCR技術(shù)和核酸探針技術(shù)具有較高的靈敏度，但對工作人員和檢測設(shè)備的要求較高，在基層不易推廣應(yīng)用。基于免疫分析原理的EEISA和膠體金試紙條檢測技術(shù)雖然具有操作簡便、檢測時間短等優(yōu)點，但抗體的制備需要免疫動物、成本高、抗體易失活。因此，迫切需要發(fā)展高靈敏、成本低、實用性強的食源性致病菌快速檢測技術(shù)。

近年來，核酸適配體（Aptamer）作為一種新型的識別分子逐漸成為研究熱點，其本質(zhì)是一段單鏈寡核苷酸可折疊成發(fā)夾、莖環(huán)、假結(jié)體及G-四鏈體等二級或三級結(jié)構(gòu)，通過氫鍵、范德華力等與靶分子相互作用而形成穩(wěn)定的復(fù)合物，其空間結(jié)構(gòu)的多樣性幾乎可以與所有種類的靶分子（細胞因子[3]、蛋白[4]、生物毒素[5]、金屬離子[6]、小分子物質(zhì)[7]、細胞[8]、微生物[9]等）發(fā)生結(jié)合。與傳統(tǒng)的抗體相比，核酸適配體具有應(yīng)用范圍廣，制備簡單，變性與復(fù)性可逆，易于標(biāo)記和保存等優(yōu)點。因此，適配體作為一種新型識別分子在分析領(lǐng)域成為人們關(guān)注的焦點[10]。

目前，針對食源性致病菌的快速檢測方法中，試紙條由于操作簡單、快速、低成本，肉眼可見結(jié)果等優(yōu)點，非常適用于大量樣品的初篩及食品安全監(jiān)督等領(lǐng)域的現(xiàn)場檢測。目前，已有采用適配體試紙條檢測微生物[11-12]、抗生素[13-14]、生物毒素[15-16]、小分子物質(zhì)[17]、金屬離子[18]的文獻報道，但鮮有針對單核細胞增生李斯特氏菌檢測方法的研究報道。因此，作者以該病原菌的核酸適配體為識別分子，以納米金為檢測信號，構(gòu)建快速、簡便的適配體檢測試紙條，為單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）ATCC6538-1、大腸埃希氏菌 （Escherichia coli）O157：H7 ATCC25922、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19155、 阪崎腸桿 菌（Bntorobater sakazakii）ATCC29544： 新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測試中心提供。

氯金酸（HACl4·3H2O）：購自百靈威科技有限公司；磷酸三（2-氯乙基）酯（TCEP）、吐溫-20、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、聚乙二醇（PEG-20000）、鏈霉親和素、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十六燒基三甲基漠化胺（CTAB）、三磷酸脫氧腺苷（dATP）、曲拉通X-100（Triton-100）、牛血清白蛋白（BSA）、瓊脂糖等購自生物工程（上海）股份有限公司；檸檬酸三鈉、濃鹽酸、硝酸、庶糖等分析純試劑：購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為超純水（≥18.2 MΩ·cm）；玻璃纖維膜（8906）、硝酸纖維素膜（CN140），吸水紙（H-1）、PVC 底板（J-B6）：購自上海捷寧生物科技有限公司；Milipere Amicon Ultra-0.5超濾離心管（UFC5030 BK）：購自上?？捣€(wěn)生物科技有限公司。

單核細胞增生李斯特氏菌核酸適配體[19]：上海生工生物技術(shù)有限公司合成。適配體和探針的具體序 列 如下：apt 1：5′-SH-C6-TAC TAT CGC GGA GAC AGC GCG GGA GGC ACC GGG GA-3′；apt 2：5′-Bio-TAG CGT GGG TAA CCG TGT TGG GGG GTG CCA CGG TC-3′；apt 1 互補 DNA：5′-Bio-TC CCC GGT GCC TCC CGC GCT GTC TCC GCG ATA GTA-5′和 3′。

1.2 儀器與設(shè)備

FEI Tecnai G2 F20場發(fā)射透射電子顯微鏡：美國FEI公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計（UV-2800）：尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；HM3030/HM3035 XYZ三維劃膜噴金儀、GD300滾動式手動裁紙刀、ZQ4200數(shù)控感應(yīng)斬切機：上海金標(biāo)生物科技有限公司產(chǎn)品；5424R臺式冷凍離心機：德國艾本德公司產(chǎn)品；SA224S-CW天平：德國 Sartorius公司產(chǎn)品；MS3 basic渦旋混合器：德國IKA公司產(chǎn)品；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)：成都超純科技有限公司產(chǎn)品；ZK-82B真空干燥箱：上海市實驗儀器廠產(chǎn)品；RCT basic package1磁力加熱攪拌器：德國IKA公司產(chǎn)品；Powerpac 300電泳儀：美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；Gel Doc XR System凝膠成像系統(tǒng)：美國BIORAD公司產(chǎn)品；pH計：上海 Metller Toledo公司產(chǎn)品；BSD-100振蕩培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制 0.01 mol/L PBS磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）：稱取 KCl 0.2 g，NaCl 8 g，KH2PO40.24 g，Na2HPO41.44 g，超純水定容至 1 L；重懸液：0.01mol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液中包含質(zhì)量分數(shù)5%BSA、0.25%吐溫-20、10%蔗糖；適配體稀釋液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）溶液中包含 5 mmol/L KCl、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2；玻璃纖維膜處理液：0.1 mol/L Tris-HCl溶液中包含質(zhì)量分數(shù)1%NaCl、0.5%吐溫-20、1%BSA、2%蔗糖和 1%曲拉通X-100。

1.3.2 菌株活化與處理 將鼠傷寒沙門氏菌，金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157：H7、單核細胞增生李斯特氏菌分別接種到經(jīng)過高壓滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌液于3 000 r/min，4℃下離心5 min，去除上清液，用無菌0.01 mol/L PBS緩沖液（pH 7.4）清洗2次，去除多余的培養(yǎng)基，然后無菌PBS緩沖液重新懸浮，通過平板計數(shù)法得出食源性致病菌的濃度，4℃保存?zhèn)溆肹20]。

1.3.3 膠體金的制備與表征 根據(jù)檸檬酸還原法[21]，向錐形瓶（王水浸泡24 h）中加入質(zhì)量分數(shù)0.01%氯金酸溶液100 mL，置于磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰后持續(xù)2 min，迅速加入2 mL質(zhì)量分數(shù)1%的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)攪拌加熱，直到溶液變成透亮的酒紅色，繼續(xù)加熱10 min后停止加熱，攪拌使其冷卻，4℃保存?zhèn)溆谩２⒉捎米贤饪梢姽夤舛扔嫼屯干潆婄R對膠體金質(zhì)量進行鑒定。

1.3.4 納米金-適配體復(fù)合物（AuNPs-apt 1）的制備將 13 μL 10 μmol/L 的適配體加入 2 μL 1 mmol/L的TCEP溶液，常溫避光活化1 h。取制備好的膠體金1 mL，用K2CO3溶液調(diào)pH值至7.4，10 000 r/min，4 ℃離心 10 min，棄去 900 μL 上清，剩于 100 μL 體系加入到活化體系中，渦旋混勻，常溫下偶聯(lián)反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入 9 μL 100 μmol/L 的 dATP 溶液，室溫反應(yīng)1 h。封閉結(jié)束后，加入10 uL 1 mol/L NaCl溶液，老化30 min，置于4℃繼續(xù)老化過夜。將偶聯(lián)物1 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，用100 μL重懸液復(fù)溶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 試紙條的制備 玻璃纖維膜的處理：將玻璃纖維膜按規(guī)格裁成條狀，在處理液中浸泡2 h，37℃烘箱中烘干，分別作為結(jié)合墊和樣品墊，用三維平面點膜噴金儀將AuNPs-apt 1復(fù)合探針均勻的噴涂到結(jié)合墊上，25℃烘箱烘干備用；捕獲探針和質(zhì)控探針的制備：將75 μL 10 μmol/L的生物素化apt 2與25 μL 1 mg/mL鏈霉親和素溶液混合，室溫反應(yīng)2小時，反應(yīng)溶液移到超濾離心管，6 000 r/min，4℃離心20 min，除去沒有反應(yīng)的核酸。用0.01 mol/L PBS緩沖液洗涂2次。收集超濾管內(nèi)的溶液，用PBS定容至原體積，4℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑯拥姆椒ㄌ幚砘パaDNA探針，即得到捕獲測探針和質(zhì)控探針；T、C線的制備：利用噴金儀將制備好的檢測和質(zhì)控探針以0.7 μL/cm的噴速噴到NC膜上，分別作為T線（檢測線）和C線（質(zhì)控線），25℃烘箱中烘干備用；試紙條的組裝：將處理好的樣品墊、結(jié)合墊、NC膜和吸水墊依次圖1黏貼于PVC底板上，相鄰粘貼物之間的重疊部分長度為2 mm，T線與C線間隔距離為7mm，用切條機切成 4 mm寬的試紙條，與干燥劑一起裝于鋁箔袋中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試紙條性能測定

1.4.1 試紙條檢測限 用無菌PBS緩沖液（0.01mol/L，pH 7.4）將單核細胞增生李斯特氏菌梯度稀釋成系列濃度，以無菌PBS緩沖液設(shè)空白對照，將制備好的試紙條插入到待測溶液中，5 min后觀察結(jié)果，實驗重復(fù)3次，將T線（檢測線）消失前的菌液濃度定為檢測限。

1.4.2 特異性測試 將單核細胞增生李斯特氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157：H7、阪崎腸桿菌用無菌PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）分別稀釋成濃度為4×106cfu/mL的菌液，用試紙條進行檢測，測試試紙條的特異性。每個實驗3個重復(fù)。

1.4.3 樣品檢測 樣品增菌參照GB 4789.30-2010執(zhí)行[22]，無菌操作取樣 25 g（mL）加入到均質(zhì)袋中，然后加入225 mL的LB 1增菌液，充分均質(zhì)，置于（30±1）℃培養(yǎng) 24 h，混勻。 增菌完成后，取1 mL增菌液于 9 mL LB 2增菌液中，（30±1）℃培養(yǎng) 24 h。取200 μL菌液到酶標(biāo)板中，將試紙條插入菌液，5 min后判讀結(jié)果。同時采用GB 4789.30-2010進行驗證[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理

試紙條檢測原理如圖1，以固定在結(jié)合墊上AuNPs-apt 1為識別分子，T線上的鏈霉親和素-生物素化apt 2為捕獲探針，利用雙適配體夾心模式檢測樣品中單核細胞增生李斯特氏菌。當(dāng)樣品中有待測目標(biāo)物時，目標(biāo)物和結(jié)合墊上的AuNPs-apt 1復(fù)合探針特異結(jié)合，隨著毛細管作用層析到硝酸纖維素膜上，再與T線上的apt 2發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙適配體夾心模式，在檢測線上顯現(xiàn)出紅色沉淀線；多余的AuNPs-apt 1繼續(xù)向前，與質(zhì)控線上包被的互補DNA鏈發(fā)生結(jié)合，納米材料富集使C控線顯色。如果樣品中無目標(biāo)物，AuNPs-apt 1在T線上不產(chǎn)生富集，繼續(xù)層析遷移與C線上的互補DNA鏈發(fā)生結(jié)合，試紙條T線不顯色，而C線顯色。

圖1 納米探針標(biāo)記-適配體識別的試紙條檢測原理圖Fig.1 Schematic illustration of aptamer-based lateral flow strip for detection of targets

2.2 納米金質(zhì)量鑒定

有研究表明，納米金（AuNPs）的大小及形貌對偶聯(lián)核酸的效率和檢測靈敏度至關(guān)重要，球形AuNPs偶聯(lián)核酸的效率最高，試紙條的顏色是由金粒子聚集到一定程度時形成肉眼可見的信號。如果其粒徑過小，產(chǎn)生的顏色較淡，影響試紙條靈敏度；粒徑過大，不穩(wěn)定，AuNPs容易聚集成藍色，且會因位阻效應(yīng)影響其在NC膜上的流動性，通常15～30 nm的AuNPs是最合適的[23-24]。作者制備的AuNPs最大吸收峰波長為 520 nm（圖2a），為膠體金的特征吸收峰，吸收峰尖銳無雜峰，可說明所制AuNPs粒徑均一。通過透射電鏡表征結(jié)果顯示 （圖2b），AuNPs粒徑約為20 nm，形貌為球型，分散性良好，粒徑均一。以上結(jié)果表明制備的AuNPs大小適中，適合核酸適配體的標(biāo)記。

圖2 納米金紫外光譜圖和透射電鏡圖Fig.2 Absorption spectrum and TEM images of the synthesized nanogold

2.3 納米金與適配體的偶聯(lián)

為了驗證巰基化的apt 1成功修飾到納米金表面，設(shè)計了瓊脂糖凝膠電泳實驗，如圖3所示，泳道1出現(xiàn)了38 bp的清晰條帶，為單增李斯特菌 apt 1，泳道 2為AuNPs-apt1復(fù)合物的條帶，可以看出AuNPs-apt 1復(fù)合物的遷移率較之a(chǎn)pt 1遲緩較多，金標(biāo)記核酸適配體后相對分子質(zhì)量增大，因此，適配體的遷移的速率遠遠高于AuNPs-apt復(fù)合物。綜合以上，可初步判斷巰基化的apt 1成功偶聯(lián)到AuNPs表面。

圖3 適配體1和AuNPs-apt 1瓊脂糖電泳圖Fig.3 The agarose electrophoresis of the apt 1 and AuNPs-apt 1

2.4 條件優(yōu)化

圖4 納米金溶液pH值優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Determination of the optimal pH value for goldaptamer

2.4.1 納米金標(biāo)記適配體體最佳pH值的確定 納米金有一個標(biāo)記核酸適體的最佳pH值，在加入一定量的核酸適體后，不同pH條件下，穩(wěn)定性不同[25]。納米金標(biāo)記適配體最佳pH值的測定結(jié)果如圖4所示，當(dāng)標(biāo)記所用納米金溶液pH在7.0～8.0時，金溶液顏色未變化，說明在該pH范圍內(nèi)形成的金標(biāo)適配體復(fù)合物最穩(wěn)定。因此，作者選擇pH 7.4為納米金標(biāo)記適配體的最佳pH。

2.4.2 納米金表面適配體濃度優(yōu)化 納米金溶液對離子強度的變化比較敏感，當(dāng)有NaCl存在時，納米金粒子表面離子的靜電排斥被屏蔽，金顆粒將立即發(fā)生不可逆的沉聚，溶液由紅色變?yōu)樗{色（如圖5空白對照CK）。如果金溶液中加入巰基（-SH）修飾的適配體，通過巰基與納米金之間形成的Au-S共價鍵，使其適配體牢固結(jié)合在納米金表面，納米金顆粒在溶液中的穩(wěn)定性提高，即使加入鹽溶液，膠體金也不會聚集變色。因此，合適的適配體濃度對提高金溶液穩(wěn)定性和檢測靈敏度較為重要，濃度過低，金溶液不穩(wěn)定會變藍色，且捕獲的目標(biāo)物較少；若濃度過高，金表面適配體過量，則造成浪費。本研究固定NaCl終濃度為80 mmol/L[26]，采用目測法確定適配體最佳濃度。實驗結(jié)果見圖5，當(dāng)適配體終濃度為0.5 μmol/L時，膠體金發(fā)生聚集，此時的適配體濃度不足以穩(wěn)定膠體金；當(dāng)適配體終濃度≥1 μmol/L時，膠體金溶液保持紅色不變，說明此時納米金-適配體體系穩(wěn)定，且基本達到飽和狀態(tài)。因此，選擇1 μmol/L為穩(wěn)定納米金溶液的最小適配體濃度。

圖5 適配體濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimum of aptamer concentration by visual inspection

2.4.3 AuNPs-apt 1復(fù)合物最佳包被量 AuNPsapt 1包被量過多，容易造成浪費，也會使得背景信號提高，包被量太少，在高濃度的待測靶標(biāo)條件下很容易飽和，影響響應(yīng)信號的顯示。作者將AuNPsapt 1 探針分別稀釋 0×、2×、4×、6×，固定體積噴于結(jié)合墊上，檢測濃度為4×106cfu/mL的單增李斯特菌溶液，比較試紙條的T線顯色情況。結(jié)果如圖6所示，當(dāng)AuNPs-apt 1以原濃度包被時，T線顯色較明顯，隨著AuNPs-apt 1濃度的減小，T線顯色逐漸減弱或者消失。

2.4.4 T線最佳包被量 將生物素化apt 2-鏈霉親和素用PBS緩沖液分別稀釋0、2、4、6倍，按0.7 uL/cm噴于NC膜上，37℃烘箱中烘干2 h，制備成試紙條。檢測濃度為4×106cfu/mL的單核細胞增生李斯特氏菌溶液，比較T線顯色情況。從圖7種可以看出，當(dāng)apt 2-鏈霉親和素稀釋超過2×，T線顯色明顯減弱或者消失，因此，apt 2-鏈霉親和素復(fù)合物稀釋倍數(shù)選擇為2。

圖6 AuNPs-apt 1包被量對T線顯色的影響Fig.6 Visual color changes at the test lines with different concentrations of AuNP-apt

圖7 Apt 2-鏈霉親和素包被濃度對T線顯色的影響Fig.7 Visual color changes at the test lines with different concentrations of apt 2-streptavidin

2.5 試紙條檢測性能

2.5.1 試紙條檢測限 通過對系列濃度的單核細胞增生李斯特氏菌溶液進行檢測，觀察不同試紙條的顯色信號，確定試紙條檢測限。結(jié)果如圖8所示，隨著菌液濃度的降低，試紙條上的檢測信號逐漸減弱。當(dāng)濃度為 4×103cfu/mL時，檢測線顏色明顯變?nèi)酰陀?×102cfu/mL時，檢測線肉眼完全不可見。因此，試紙條對單核細胞增生李斯特氏菌的裸眼可視檢測限為4×103cfu/mL。

2.5.2 試紙條特異性 對試紙條進行交叉反應(yīng)實驗，以確定其對單核細胞增生李斯特氏菌的特異性，結(jié)果如圖9所示，當(dāng)濃度為4×106cfu/mL的單核細胞增生李斯特氏菌檢測后，試紙條為陽性，其余的食源性致病菌檢測結(jié)果為陰性，表明該試紙條對單核細胞增生李斯特氏菌具有很好的特異性。

圖8 試紙條檢測不同濃度的單核細胞增生李斯特氏菌Fig.8 Sensitivity of the aptamer-based lateral flow strip for Listeria monocytogenes

圖9 試紙條特異性測試結(jié)果Fig.9 Specificity of the aptamer-based lateral flow strip for Listeria monocytogenes

2.5.3 實際樣品檢測 將制備的試紙條用于定性檢測不同食品中的單核細胞增生李斯特氏菌，然后與國標(biāo)法[22]相對比。檢測結(jié)果表明，作者研究制備適配體試紙條檢測結(jié)果與國標(biāo)方法一致（表1）。該方法檢測速度快、操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于大批量樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的快速定性檢測。

表1 與國家標(biāo)準(zhǔn)方法對樣品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測結(jié)果對比Table 1 Listeria monocytogenes detected in real samples by proposed method and national standard method

3 結(jié)語

構(gòu)建了一種基于雙適配體夾心模式的層析試紙條，該試紙條具檢測速度快，特異性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點，與傳統(tǒng)的膠體金試紙條比較，成本更低，并成功用于食品中單核細胞增生性李斯特氏菌的檢測，為批量樣品的初篩和食品安全監(jiān)管提供了技術(shù)支撐。