葉螨AChE突變型的原核表達及活性測定

周王艷，韋顯星，高 溯，楊 金，李 博，王曉琴，卜春亞**

(1.北京農(nóng)學院 生物與資源環(huán)境學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京農(nóng)學院，北京 102206；2.北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100206)

朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)，是一種多食性世界性害螨，因其宿主廣泛，適應性強、繁殖迅速，嚴重危害農(nóng)林經(jīng)濟作物[1]。螨害輕則植株生長不良，重則整植株死亡[2]。乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是生物神經(jīng)傳導中的關鍵酶[3-5]。AChE是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的重要作用靶標[6-7]，這類農(nóng)藥與AChE活性中心部位不可逆地結合，抑制酶水解，使ACh大量積累，受持續(xù)性刺激，進而抽搐性死亡[8]，但該類農(nóng)藥常難降解且靶向性差，對非靶標有益生物存在威脅。

不同生物間AChE較保守，但存在一定差異。比較不同物種AChE差異，以此構建AChE突變型，為研制和篩選選擇性強的新型殺螨劑提供依據(jù)，這在蟲害防治中具重大意義[9]。2016年，Wang等[10]對家蠶AChE進行定點突變構建原核表達載體，進一步研究了突變與農(nóng)藥抗性和特異性之間的關聯(lián)。2015年韓晶玉等[11]對朱砂葉螨AChE進行同源結構建模，通過對比該螨AChE與人AChE功能位點以及周圍區(qū)域氨基酸序列和空間結構的差異性，找出了4個差異位點E316W，W156Y，V105Y，H369G，初步推斷這4個位點可能是螨AChE特有作用位點。本研究以此為理論依據(jù)，將朱砂葉螨AChE三點突變型V105Y/W156Y/E316W和W156Y/E316W/H369G，即位點VWE和WEH，插入pET-30a載體上進行體外表達，并純化AChE突變型蛋白，并與野生型蛋白活性進行差異分析，可為篩選新型選擇性殺螨劑提供試驗指向。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

菌株與載體：Trans1-T1、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞和pEasy-T1克隆載體均購自北京全式金生物有限公司，pET-30a載體為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室保存。

主要試劑：Primer STAR、EcoR I、XhoI購自Takara公司；TIANpure Mini Plasmid Kit購自天根生化科技(北京)有限公司；T4 DNA Ligase購自北京全式金生物有限公司；Protease Inhibitor Cocktail、eECL試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因擴增 以農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室保存的朱砂葉螨去疏水區(qū)的AChE突變型pCold II/ace質粒為模板，設計帶有EcoR I、XhoI位點的引物1ace-F：5’CCGCTCGAGAATGTTTTCTCCTCC3’和引物2 ace-R：5’CGCGAATTCCTAATTTGATGATCC 3’，PCR法擴增ace突變型基因，產(chǎn)物電泳分離鑒定，用試劑盒TIANgel Midi Purification Kit回收。

1.2.2 載體構建 將回收的ace片段連接T1載體轉化，藍白斑篩選陽性，經(jīng)菌液PCR和雙酶切驗證無誤，提取陽性質粒，進一步送測序鑒定。取測序正確的T1-ace質粒和pET-30a載體分別用EcoR I和XhoI雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。將其拼接后導入E.coliDH5α，進行驗證，即完成pET-30a/ace突變型載體構建。將陽性質粒轉化E.coliBL21(DE3)，進行PCR驗證。

1.2.3 誘導表達 將1.2.2構建好的E.coliBL21(DE3)陽性菌株劃線活化，挑取單菌落于3 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min活化培養(yǎng)3 h后，接入新LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，至對數(shù)生長期時加IPTG在37 ℃下誘導7 h后，收集菌體于-80 ℃保存。并進行SDS-PAGE鑒定，AChE突變型重組蛋白的大小約為66 kDa。

1.2.4 蛋白分離純化 取收集的菌體，以20 mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)重懸后，加入20 μL 1U/μL DNase、200 μL 10 mg/mL 溶菌酶、200 μL Protease Inhibitor Cocktail(100×)和200 μL 10 mg/mL PMSF，于4 ℃混合預裂解1 h，再經(jīng)超聲破碎儀破碎至溶液呈清亮米黃色，4 ℃，7 800 r/min離心收集并取上清，加入已平衡的Ni-NTA柱料于4 ℃結合2 h，后分步洗脫，測OD280nm值，收集流出峰，進行SDS-PAGE鑒定。

1.2.5 AChE突變型重組蛋白的Western Blot鑒定 對獲得蛋白的AChE特異性進行確認，將獲得的蛋白電泳轉移至PVDF膜上進行Western Blot驗證。按照康為世紀一步法eECL試劑盒操作，以兔源抗AChE多克隆抗體作一抗，結合二抗孵育45 min后漂洗，再以eECL曝光顯影。將鑒定正確的組分蛋白超濾濃縮，置換50 mM的Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液。按Thermo Scientific公司BCA試劑盒操作，繪制標準蛋白濃度曲線，測蛋白樣品的蛋白濃度。

以野生型的酶活性為100%，換算突變型的活性。將得到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，比對分析AChE野生型與突變型的酶活力差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 載體T1-ace突變型的構建

PCR擴增ace突變型基因，PCR產(chǎn)物電泳檢測，產(chǎn)物大小與目的片段一致，將擴增片段分離進行膠回收。將回收的擴增片段連接到T1載體，轉化Trans1-T1感受態(tài)細胞，藍白斑篩選陽性菌株，提取質粒用EcoR I和XhoI進行雙酶切驗證，獲得的2個片段的大小符合(圖1)，將陽性質粒送測，測序正確，表明成功構建了T1-ace突變型。

注：M.DNA Marker III 1.T1-ace/VWE；2.T1-ace/WEH Note: M. DNA Marker III 1. T1-ace/VWE; 2. T1-ace/WEH圖1 T1-ace 突變型質粒雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme digestion identification of T1-ace mutants

2.2 pET-30a/ace突變型重組載體構建

取測序正確的T1-ace突變型質粒和pET-30a空載體，分別以EcoR I和XhoI進行雙酶切后，膠回收雙酶切產(chǎn)物。用T4連接酶將回收的目的基因與pET-30a載體拼接，導入DH5α感受態(tài)中，篩選陽性菌株，菌液PCR檢測正確后，提取質粒進行雙酶切鑒定，切割的片段大小為5 422 bp和1 782 bp(圖2)，符合pET-30a載體與目的基因的大小，即重組載體連接成功。再將驗證正確的質粒送測，進一步驗證目的基因序列是否正確，結果表明測序正確，ace基因兩突變型的突變點分別為W156Y/E316W/H369G和V105Y/W156Y/E316W同預期突變位點相符，即目的重組載體構建成功。

注：M.DNA Marker III; 1.pET-30a/ace/VWE 雙酶切2.pET-30a/ace/WEH 雙酶切 Note: M.DNA Marker III; 1. pET-30a/ace/VWE; 2. pET-30a/ace/WEH圖2 pET-30a/ace 突變型(DH5α)質粒的雙酶切Fig.2 Restriction enzyme analysis of pET-30a/ace mutants

2.3 目的蛋白的表達與純化

將測序成功的質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，選擇陽性菌株進行PCR檢測，擴增出的片段與ace突變型基因大小一致，表明重組載體成功導入BL21(DE3)中，表達菌株構建完成。體外誘導表達的重組蛋白和Ni-NTA柱結合，梯度咪唑緩沖液洗脫純化后，對流出峰樣品進行SDS-PAGE鑒定(圖3)。由泳道1～2可看出在誘導7 h后有一個大小約為66 kDa的蛋白大量表達；泳道3～5看出，收集的菌體破碎后上清中存在大量的該蛋白，即誘導表達的蛋白具有較好的水溶性。用梯度濃度咪唑進行洗脫，由泳道7～9知，在200 mM的咪唑洗脫液中有明顯的目的條帶，其大小在66 kDa左右同目的蛋白大小一致，即成功純化出表達的重組蛋白。

注：a：AChE-VWE 重組蛋白；b：AChE-WEH 重組蛋白；M：蛋白 Marker；1：IPGT誘導0 h的全菌；2：IPTG誘導7 h的全菌；3：菌體破碎后離心的上清液；4：菌體破碎后離心的沉淀；5：結合Ni-NTA后的穿透液；6：40 mM咪唑洗脫的收集液； 7～9：200 mM咪唑洗脫的收集液Note:a. AChE-VWE recombinant protein; b. AChE-WEH recombinant protein; M. Protein Marker; 1. 0 h IPGT induction of whole bacteria; 2. 7 h IPTG induction of whole bacteria; 3. Supernatant, 4. Precipitate; 5. solutionnot binding with Ni-NTA; 6. 40 mM imidazole elution, 7-9. 200 mM imidazole elution圖3 AChE突變型誘導表達純化的SDS-PAGE鑒定Fig.3 SDS-PAGE identification of induced expression and purification of AChE recombinant protein

2.4 目的蛋白的Western Blot分析

對純化的重組蛋白，進行Western Blot驗證，發(fā)現(xiàn)在66 kDa處成功顯影一條特異條帶(圖4)，說明表達出的蛋白具有AChE特異性。

注：M.蛋白maker；1.AChE-VWE重組蛋白；2.AChE-WEH 重組蛋白Note:M. protein maker; 1. AChE-VWE recombinant protein;2. AChE-WEH recombinant protein圖4 重組蛋白的Western Blot結果Fig.4 Western Blot analysis of AChE recombinant protein

2.5 重組蛋白的活性分析

對純化后的目的蛋白，以改良Ellman法測重組蛋白的活性，采用數(shù)理統(tǒng)計方法分析野生型與突變型的活性差異。發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變型的活性雖降低但差異不顯著(圖5)。說明AChE蛋白在VWE和WEH的位點突變后，仍然具有活性。

注：ace/1 782.朱砂葉螨AChE野生型；VWE、WEH.朱砂葉螨AChE突變型；a.代表差異性顯著水平，標記字母相同表示相互間差異不顯著Note:ace/1 782.Tetranychus cinnabarinus AChE wild type;VWE，WEH. Tetranychus cinnabarinus AChE mutant.a. represents the significant level of difference, and the same letter of the mark means that the difference between them is not significant圖5 朱砂葉螨AChE野生型與突變型酶活力對比分析Fig.5 Comparative analysis of enzyme activities of Tetranychus cinnabarinus AChE wild type withthe mutants

3 討 論

朱砂葉螨這類害螨，對殺螨劑易產(chǎn)生抗藥性。乙酰膽堿酯酶是生物體重要的神經(jīng)酶，對神經(jīng)系統(tǒng)有十分重要作用，主要集中分布于蟲體的頭部與胸部[12]。AChE作為農(nóng)藥作用靶標，通過抑制AChE水解作用，導致ACh過多累積于突觸，致使害螨因神經(jīng)沖動、肌肉抽搐而死亡。

與傳統(tǒng)殺螨劑相比，新型殺螨劑以不同種屬AChE活性位點的差異來研發(fā)選擇性強的殺螨劑，該殺螨劑選擇性強，對害螨具較強毒性，減少對非靶標生物毒害性?，F(xiàn)有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥作用位點，是靶標與非靶標生物共有的，在大面積使用過程中易對人畜等非靶標生物造成一定影響。并且有機磷農(nóng)藥經(jīng)土壤、水等媒介，通過富集作用進入體內，并暴露、積累和殘留在環(huán)境中，對生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)造成破壞[13]。在近年的環(huán)境報道中，農(nóng)藥在殺死害蟲的同時也會誤殺非靶標昆蟲——蜜蜂，一種高經(jīng)濟效益昆蟲資源，在作物授粉保產(chǎn)增產(chǎn)中具重要意義，因此篩選出選擇性強的殺螨劑是十分具有必要性的。

另一方面減緩螨的抗藥性問題，隨著殺蟲劑長期濫用及過度依賴，導致昆蟲產(chǎn)生抗藥性[14-15]并可遺傳[16]。據(jù)近年調查與組學數(shù)據(jù)檢測結果表明[17]，隨著有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的大量濫用，可導致害蟲產(chǎn)生顯著抗藥性，AChE對殺蟲劑的敏感下降，其根本原因為AChE基因發(fā)生突變[18]。2013年，王舉梅對家蠶ace1進行三點突變，并得到突變前后對農(nóng)藥的敏感性有明顯變化[19]；2018年，楊茜對家蠅抗藥性與ace基因突變分析，檢測得到突變頻率較高位點[20]。突變對昆蟲的抗藥性有一定影響，但因突變位點不同，改變幅度大小有差異。生物之間的AChE比較保守[21]，以此相互對比。

為篩選出具新型高特異性的殺螨劑，可利用定點突變技術對螨特異性位點進行篩選，以此來鑒定殺螨劑特異性的差異。對比突變型VWE和WEH的蛋白活性發(fā)現(xiàn)二者活性都存在不同程度的降低，但沒有達到顯著水平，可能不同位點之間存在互補關系。

本研究成功構建pET-30a/ace表達載體，實現(xiàn)對AChE突變型原核高效表達系統(tǒng)構建，純化得到較高純度目的重組蛋白。通過測定AChE突變型活性，對比野生型有所降低但并無顯著差異，結果表明這兩種突變型未符合目的條件。但這為AChE功能和結構研究提供相應依據(jù)，同時為今后對于新型殺螨劑的篩選提供一定的創(chuàng)新性思路，也為后續(xù)大量深入研究奠定基礎。