桑葚花色苷提取條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

高林森，柴岳平，溫吉更，李亞麗，郭燁

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與經(jīng)濟(jì)研究所，河北 石家莊 050051；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050031）

桑葚果是桑屬植物中的一種成熟果實(shí)，營(yíng)養(yǎng)豐富，口感較好，其果肉化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用十分廣泛[1]。桑葚不僅含有鈣、鋅、鐵、錳等礦物質(zhì)元素，還含有胡蘿卜素等黃酮類物質(zhì)以及蘆丁等藥理成分，是國(guó)家衛(wèi)生部列出的保健農(nóng)產(chǎn)品之一[2～5]。當(dāng)今，桑葚果汁享有“二十一世紀(jì)的最佳健康食品”之美譽(yù)。

桑葚果花色苷對(duì)人體具有多種保健功能。桑葚富含多酚類物質(zhì)，其中主要為花色苷類化合物，以桑椹紅作為著色劑已經(jīng)列入我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 2760—2004），有著巨大的加工潛力[6]。早在1972 年，日本學(xué)者報(bào)道了桑葚果中的花色苷含有矢車菊-3-葡萄糖苷、牽?；?3-蕓香糖苷和天竺葵-3-葡萄糖苷3 種成分[7]。2004 年Liu 等[8]等通過高效液相色譜法，從桑葚果中分離出4 種花色苷成分。

桑葚具備藥理活性的緣由是其含有某些生物活性物質(zhì)[9]。研究表明，成熟的桑葚果實(shí)含有豐富的花色苷物質(zhì)，膳食花色苷具有抗氧化[10，11]、抗腫瘤[12～14]、抗炎癥[15]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[16]等優(yōu)良且廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是抗腫瘤活性具有天然、低毒、高效等優(yōu)點(diǎn)[17，18]。

將成熟桑葚洗滌、打碎、冷凍干燥，得到桑葚干粉。將桑葚干粉在酸化乙醇中浸泡提取，離心，真空抽濾，濾液旋蒸除去乙醇，石油醚萃取取除去脂類，最后真空抽濾，得到桑葚花色苷粗提物水溶液，待測(cè)。并對(duì)提取過程中的重要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。確定了最佳提取條件，并對(duì)不同地區(qū)生長(zhǎng)的桑葚花色苷含量進(jìn)行了差異性分析，旨為桑葚花色苷的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科研依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桑葚樣品采自邢臺(tái)市、衡水市和滄州市，品種主要有無核大十、黑珍珠、紅果2 號(hào)、白玉王、黑珍珠、桂花蜜、紅果2 號(hào)、白葚子、臺(tái)灣長(zhǎng)桑。

試劑有醋酸鈉（純度98%，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）、氯化鉀（分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠）、60～80 ℃石油醚（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）、鹽酸（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司） 和乙醇（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）。

所用儀器或設(shè)備有冷凍干燥箱、超聲波清洗器、-80 ℃冰箱等（表1）。

表1 試驗(yàn)儀器或設(shè)備的型號(hào)及其生產(chǎn)廠商Table 1 Test instruments and equipments and their manufacturers

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑葚花色苷的提取 將桑葚清洗干凈，晾干后打漿，冷凍干燥至桑葚干粉，貯存于-80 ℃低溫冰箱中，備用。稱取桑葚干粉0.500 0 g 于試管中，加酸化乙醇溶液（85%乙醇與1.5 mol/L HCl 按照體積比85∶15 配制而成） 20 mL 溶解，60 ℃浸泡提取90 min，將提取液以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液；取沉淀重復(fù)上述操作，合并2 次提取液。真空抽濾2次得到的上清液，將濾液旋蒸除去乙醇，利用石油醚萃取除去脂類[19]，最后真空抽濾，得到桑葚花色苷粗提物水溶液，待測(cè)。

1.2.2 花色苷總含量的測(cè)定 采用pH 值示差法[20]測(cè)定提取物水溶液中的花色苷總含量。將待測(cè)提取液定容到10 mL，吸取樣品2 mL 置于2 只試管中，一支試管中加入1 mL pH 值1.0 的緩沖液（0.2 mol/L 氯化鉀溶液與0.2 mol/L 鹽酸溶液按體積比25∶67 配制而成），另一支加入pH 值4.5 的緩沖液（0.2 mol/L 醋酸鈉溶液用0.2 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至4.5），得到待測(cè)液。以蒸餾水作為空白對(duì)照，利用紫外分光光度計(jì)，分別在波長(zhǎng)520 nm 和700 nm 處測(cè)定2 種待測(cè)液的吸光值（A）。根據(jù)公式，計(jì)算桑葚的花色苷總含量：

桑葚花色苷總含量（mg/g）=（A/εL）×MW×DF×V/M

A=（A510nm，pH值1.0-A700nm，pH值1.0）-（A510nm，pH值4.5-A700nm，pH值4.5）

式中，A 為吸光值，ε 為消光系數(shù)26 900；L 為光程（1.0 cm）；MW 為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的分子量（449.38）；DF 為稀釋因子；V 為待測(cè)樣品提取液的體積（mL）；M 為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素試驗(yàn)對(duì)適宜提取條件的篩選 本試驗(yàn)考察的提取條件因素有酸化乙醇中的乙醇濃度、乙醇與HCl 的體積比（V乙醇：VHCl）、提取時(shí)間、提取次數(shù)和提取溫度5 個(gè)。將其中的4 個(gè)因素固定，變化某個(gè)因素的水平，根據(jù)花色苷提取量確定單因素的適宜水平。

1.2.3.1 提取次數(shù)對(duì)提取液中花色苷含量的影響。在溶劑中乙醇濃度85%、V乙醇∶VHCl＝90∶10、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min 條件下，分別提取1、2 和3 次。

1.2.3.2 提取溫度對(duì)提取液中花色苷含量的影響。在溶劑中乙醇濃度85%、V乙醇∶VHCl＝90∶10、提取時(shí)間90 min 條件下，提取溫度分別設(shè)定為50、60、70、80和90 ℃，提取1 次。

1.2.3.3 提取時(shí)間對(duì)提取液中花色苷含量的影響。在溶劑中乙醇濃度85%、V乙醇∶VHCl＝90 ∶10、提取溫度60 ℃條件下，提取時(shí)間分別設(shè)定為72、80、88、96、104 和112 min，提取1 次。

1.2.3.4 乙醇濃度對(duì)提取液中花色苷含量的影響。提取溶劑中的乙醇濃度分別設(shè)定為72%、80%、88%、96%和100%，在V乙醇∶VHCl＝90 ∶10、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min 條件下提取1 次。

1.2.3.5 V乙醇∶VHCl對(duì)提取液中花色苷含量的影響。在溶劑中乙醇濃度85%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min條件下，V乙醇∶VHCl分別設(shè)定為75∶25、80 ∶20、85∶15、90 ∶10、95∶5，提取1 次。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取條件的優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取合適的3 個(gè)因素，利用Design Expert 8.0 軟件采取Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過三因素三水平的響應(yīng)面分析法對(duì)花色苷提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷提取工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取次數(shù)的選擇 隨著提取次數(shù)的增加，花色苷提取量呈逐漸增加趨勢(shì)，其中提取3 次處理的花色苷提取量分別較提取2 次、提取1 次處理提高了7.89%和13.10%，提取2 次處理的花色苷含量較提取1 次處理僅提高了4.83%，增幅均較?。▓D1）。從經(jīng)濟(jì)和環(huán)保角度考慮，確定適宜的提取次數(shù)為1 次。

2.1.2 提取溫度的選擇 隨著提取溫度的升高，花色苷提取量呈先增加后降低的趨勢(shì)變化，其中提取溫度為60 ℃時(shí)指標(biāo)值最大，為1.85 mg/L（圖2）。提取溫度為50 ℃時(shí)花色苷提取量最低，溫度升高后花色苷提取量迅速增加，與升溫后花色苷擴(kuò)散到提取溶劑中的速度加快有關(guān)；溫度達(dá)到一定程度后繼續(xù)升高時(shí)提取量逐漸下降，與溫度過高造成花色苷降解[21]有關(guān)。因此，確定適宜的提取溫度為60 ℃。

2.1.3 提取時(shí)間的選擇 隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷提取量呈先增加后降低的趨勢(shì)變化，其中提取時(shí)間為90 min 時(shí)指標(biāo)值最大，為1.87 mg/L（圖3）。因此，確定適宜的提取時(shí)間為90 min。

2.1.4 乙醇濃度的選擇 隨著乙醇濃度的增大，花色苷提取量呈先增加后降低的趨勢(shì)變化，其中乙醇濃度為80%時(shí)指標(biāo)值最大，為1.92 mg/L（圖4）。乙醇濃度較低時(shí)，溶液體系極性較差，影響花色苷的溶出，造成花色苷提取量低；乙醇濃度增大后有利于花色苷的溶出，花色苷提取量逐漸提高；但是乙醇濃度過大時(shí)桑葚粉中的其他雜質(zhì)也會(huì)溶出，影響花色苷含量的測(cè)定，導(dǎo)致花色苷提取量有所下降[22]。因此，確定適宜的乙醇濃度為80%。

2.1.5 V乙醇：VHCl的選擇 隨著V乙醇∶VHCl的增大，花色苷提取量呈先增加后降低的趨勢(shì)變化，其中V乙醇∶VHCl為85∶15 時(shí)指標(biāo)值最大，為1.97 mg/L（圖5）。因此，確定適宜的V乙醇∶VHCl為85∶15。

2.2 花色苷提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，V乙醇∶VHCl、提取溫度、乙醇濃度對(duì)花色苷提取量影響較大，因此選擇這3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。

表2 響應(yīng)面分析的因素及其水平編碼Table 2 Factors and their level codes by response surface analysis

2.2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 利用Design Expert 8.0 軟件對(duì)不同因素與水平組合的試驗(yàn)結(jié)果（表3） 進(jìn)行分析，得到花色苷含量（Y）對(duì)自變量A（V乙醇：VHCl）、B（提取溫度） 和C（乙醇濃度） 的回歸方程：

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 3 Box-Behnken test design and results

Y=2.03+0.28A-0.097B+0.081C-0.056AB-0.032AC-0.12BC-0.25A2-0.46B2-0.25C2

2.2.2 方差分析 對(duì)得出的回歸方程進(jìn)行方差分析，模型P＜0.01，相關(guān)性達(dá)到了極顯著水平（表4），說明選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性。失擬項(xiàng)P（0.591 7） ＞0.01，相關(guān)性不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.980 1，說明提取率的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有很好的擬合度。因此，該模型擬合效果較好，可以用此模型來分析和預(yù)測(cè)桑葚花色苷的提取工藝。

各因素對(duì)花色提取量的影響順序?yàn)锳（V乙醇：VHCl）＞B（提取溫度） ＞C（乙醇濃度），其中V乙醇：VHCl對(duì)花色提取量的影響達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），提取溫度和乙醇濃度對(duì)花色苷提取量的影響達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

2.2.3 各因素之間的交互作用 提取溫度、V乙醇：VHCl、乙醇濃度交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響可以從響應(yīng)圖面直觀反映出來[21]。提取溫度與乙醇濃度的交互作用達(dá)到了顯著水平（圖6～8）。

2.2.4 回歸模型的驗(yàn)證 通過該回歸方程，求得優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)為乙醇與HCl 體積比87.77 ∶12.23、提取溫度58.41 ℃、乙醇濃度85.815%。該條件下，花色苷的提取量為2.13 mg/g。

考慮到實(shí)際操作的簡(jiǎn)便性，將優(yōu)化后的工藝條件修正為乙醇與HCl 體積比90 ∶10、提取溫度60 ℃、乙醇濃度85%，并在此條件下進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該條件下花色苷的提取含量為2.22 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值（2.13 mg/L） 的相對(duì)誤差小于2%。因此，應(yīng)用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)結(jié)果可靠。

2.3 不同種植條件桑葚花色苷含量的比較

將多產(chǎn)地不同品種的桑葚凍干后，利用上述所得的最優(yōu)試驗(yàn)條件進(jìn)行花色苷提取。10 個(gè)參試桑葚品種的花色苷含量為1.035～1.973 mg/L，不同品種之間差異較大，其中產(chǎn)自衡水地區(qū)的黑珍珠花色苷含量最高（表5）。檢測(cè)結(jié)果為河北省桑葚產(chǎn)品研發(fā)以及花色苷的進(jìn)一步利用提供了理論依據(jù)。

表5 桑葚中的花色苷含量（n=5，春季）Table 5 Anthocyanin content in mulberry (n=5，spring)

3 結(jié)論與討論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，提取液中酸化乙醇濃度、乙醇與HCl 體積比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)均對(duì)桑葚花色苷提取率有影響。響應(yīng)面回歸分析結(jié)果表明，提取過程中提取溫度與乙醇濃度的交互作用對(duì)花色苷提取率的影響最為顯著。采用響應(yīng)面法建立花色苷提取率的二次多項(xiàng)擬合方程，由模型優(yōu)化花色苷的提取條件為：提取液酸化乙醇中乙醇濃度85%，乙醇與HCl 體積比90 ∶10，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間90 min，提取1 次。在此條件下，桑葚果花色苷提取量可達(dá)2.22 mg/L。對(duì)不同地區(qū)生長(zhǎng)的桑葚花色苷含量進(jìn)行了差異性分析，發(fā)現(xiàn)不同品種的花色苷含量差異較大，這為桑葚產(chǎn)品研發(fā)以及花色苷的進(jìn)一步利用提供了理論依據(jù)。

桑葚保健功能已經(jīng)引起了人們的興趣，花色苷的功能顯著，桑葚為花色苷的重要來源之一，對(duì)高收率桑葚花色苷的提取工藝進(jìn)行研究并提供指導(dǎo)，對(duì)桑葚花色苷類產(chǎn)品的分析及功能性食品和藥品的研發(fā)奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。