大鯢肌肉與皮中膠原蛋白比較研究

董夢堯 陳德經(jīng) 楊慧 金文剛

摘 要：針對(duì)大鯢肉中肌基質(zhì)蛋白和大鯢皮提取的膠原蛋白基礎(chǔ)特性進(jìn)行比較研究。采用酸法、胃蛋白酶法提取大鯢肌基質(zhì)蛋白和大鯢皮中的膠原蛋白，測定膠原蛋白的分子質(zhì)量、光譜特性、羥脯氨酸含量、微觀結(jié)構(gòu)與黏度。結(jié)果表明：大鯢皮、大鯢肉中肌基質(zhì)蛋白的酸溶性膠原蛋白提取率分別達(dá)18.29%和7.08%，酶提膠原蛋白提取率分別為25.67%和18.65%;酸提大鯢皮、大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白羥脯氨酸含量分別為（16.05±0.16）%和（10.49±0.42）%，酶提分別為（18.04±0.08）%和（8.67±0.12）%;酸提與酶提膠原蛋白紫外光譜及紅外光譜特性基本相似，酸提大鯢皮膠原蛋白的種類比肌基質(zhì)蛋白中提取的膠原蛋白種類更多，酶提大鯢皮中膠原蛋白電泳條帶比肌基質(zhì)蛋白中提取的膠原蛋白條帶更為清晰，但分子質(zhì)量基本一致;掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，酸提的2 種來源膠原蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較酶提更為完整;2 種來源的膠原蛋白黏度存在顯著差異（P<0.05）。大鯢肉中肌基質(zhì)蛋白與大鯢皮膠原蛋白特性相同，可作為補(bǔ)充膠原蛋白制品及化妝品原料進(jìn)行開發(fā)。

關(guān)鍵詞：大鯢;大鯢皮;大鯢肌基質(zhì)蛋白;膠原蛋白;比較

Comparative Study on Collagen in Muscle and Skin of Giant Salamander

DONG Mengyao1， CHEN Dejing1，2，*， YANG Hui1， JIN Wengang1，2

（1.College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong 723001， China;

2.Shaanxi Bio-Resource Key Laboratory， Shaanxi University of Technology， Hanzhong 723001， China）

Abstract： In this paper， the basic properties of collagens extracted from the muscle matrix protein and skin of giant salamander were evaluated and compared with each other. Acetic acid treatment followed by pepsin hydrolysis was used to extract collagen， and the molecular mass， spectral characteristics， hydroxyproline content， microstructure and viscosity of the collagens were determined. The results showed that the extraction yields of acid-soluble collagen from the skin and muscle matrix protein were 18.29% and 7.08%， and the extraction yields of collagen from the resulting residues with pepsin were 25.67% and 18.65%， respectively. The content of hydroxyproline was （16.05 ± 0.16）% and （10.49 ± 0.42）% for the acid-soluble collagens from the skin and muscle matrix protein， and （18.04 ± 0.08）% and （8.67 ± 0.12）% for the pepsin-extracted collagens， respectively. The ultraviolet and infrared spectral characteristics of the acid-extracted collagens were basically similar to those of the enzyme-extracted collagens， and more types of acid-extracted collagen were extracted from the skin than from the muscle matrix protein. The enzyme-extracted collagen from the skin showed more clear electrophoretic bands than that from the muscle matrix protein， but the molecular masses of them were similar to each other. Scanning electron microscopic （SEM） observation demonstrated that the reticular structure of acid-extracted collagens from both sources was more complete than that of enzyme-extracted collagens. A significant difference was found in the viscosity of collagens from the two sources （P < 0.05）， despite having the same properties as each other. Hence， they can be developed as raw materials for collagen supplement and cosmetics.

Keywords： giant salamander; giant salamander skin; muscle matrix protein of giant salamander; collagen; comparison

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200917-226

中圖分類號(hào)：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）12-0011-07

引文格式：

董夢堯， 陳德經(jīng)， 楊慧， 等. 大鯢肌肉與皮中膠原蛋白比較研究[J]. 肉類研究， 2020， 34（12）： 11-17. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200917-226.? ? http：//www.rlyj.net.cn

DONG Mengyao， CHEN Dejing， YANG Hui， et al. Comparative study on collagen in muscle and skin of giant salamander[J]. Meat Research， 2020， 34（12）：? 11-17. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200917-226.? ? http：//www.rlyj.net.cn

大鯢（Andrias davidianus）俗稱“娃娃魚”，屬脊索動(dòng)物門、兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科[1]。大鯢的種類包括中國大鯢、日本大鯢和美洲隱鰓鯢，中國大鯢的人工養(yǎng)殖范圍極廣，主要集中在湖南、陜西等地。漢中大鯢養(yǎng)殖規(guī)模占全國的70%以上[2]。大鯢渾身都是寶，黏液、皮膚、肌肉、骨頭和油脂均有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，大鯢機(jī)體中肌肉占比達(dá)體質(zhì)量的50%左右，皮占比5%左右。經(jīng)常食用大鯢有益智、延緩衰老、提高造血和免疫功能的功效，同時(shí)也可預(yù)防心腦血管疾病、惡性貧血和惡性腫瘤等疾病[3]。

大鯢肉粉中含有抗疲勞、抗免疫的功能成分[4]。

李莉等[5]對(duì)大鯢肌肉、大鯢皮的營養(yǎng)成分進(jìn)行比較，得出大鯢肉、尾脂和大鯢皮均具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。大鯢肉中含有肌原纖維蛋白、肌漿蛋白、堿溶性蛋白和肌基質(zhì)蛋白，將肌漿蛋白、肌原纖維蛋白提取后的剩余肉渣部分主要為肌基質(zhì)蛋白。楊慧等[6]從大鯢肌肉中分離出肌漿蛋白、肌原纖維蛋白及肌基質(zhì)蛋白，并對(duì)幾種蛋白特性進(jìn)行測定，結(jié)果表明，從大鯢肌肉中獲得的3 類蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能完整。肌基質(zhì)蛋白主要包含膠原蛋白和彈性蛋白，且二者均為構(gòu)成結(jié)締組織的主要成分。膠原蛋白為一個(gè)或幾個(gè)由α-鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，以不溶性大分子與蛋白多糖、糖蛋白等黏合在一起的形式存在于組織內(nèi)[7]。膠原蛋白為構(gòu)成肌肉結(jié)締組織的主要成分，與肌肉的柔嫩、老化密切相關(guān)。膠原蛋白存在于大鯢皮中的結(jié)締組織，不僅是肌膚真皮層中支撐皮膚構(gòu)架的主要“黏合劑”，也與彈力纖維一起構(gòu)成網(wǎng)狀的支撐體，使皮膚細(xì)胞變得豐滿，呈現(xiàn)彈性與潤澤，保持皮膚細(xì)膩光滑，有效防止肌膚老化。膠原蛋白的提取方法主要包括酸法[8-9]、堿法[7]、鹽法[10]、熱水法[11]和酶法[12-14]。酸法提取一般可不破壞膠原蛋白結(jié)構(gòu)，但提取獲得的膠原蛋白分子質(zhì)量較大，且提取率較低，不利于人體消化吸收。酶解法較為常見，提取條件溫和。目前有關(guān)膠原蛋白的提取研究主要集中于豬皮、魚皮等。王錫念等[15]比較不同提取方式對(duì)鮟鱇魚魚皮中膠原蛋白的提取效果，結(jié)果顯示，利用超聲-雙酶法提取率最佳;韓瑋等[16]以羅非魚皮為研究對(duì)象，將通過微生物發(fā)酵法、熱水法、酸法、堿法制備的膠原蛋白進(jìn)行比較，結(jié)果表明，微生物發(fā)酵法制備膠原蛋白得率顯著高于熱水法和堿法，發(fā)酵法制備得到的膠原蛋白具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，較高的溶解性、持水性和乳化性，并具有一定的吸水、吸油性;

趙然等[17]對(duì)國內(nèi)外水產(chǎn)動(dòng)物提取膠原蛋白方式進(jìn)行綜述，表明從水產(chǎn)動(dòng)物獲取膠原蛋白前景良好;肖嵐等[18]對(duì)豬皮中膠原蛋白進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)酶解豬皮中膠原蛋白具有抗氧化性。有關(guān)來源于大鯢的膠原蛋白研究主要集中于大鯢皮，李莉等[19]通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取大鯢皮膠原蛋白的工藝條件，得出最優(yōu)條件為加酶量16.5%、液料比15 mL/g、酶解時(shí)間29 h;李靜等[20]得出利用高溫高壓可提高利用大鯢皮制作膠原蛋白肽的提取率;周艷華等[21-22]優(yōu)化大鯢皮酶解工藝，得出制備抗氧化肽最佳工藝為酶添加量7 000 U/g、pH 8.5、55 ℃條件下酶解4 h，羥自由基清除率為83.15%，并作毒理學(xué)評(píng)價(jià);徐陽等[23]以大鯢膠原蛋白多肽粉制得口服液并作安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，在15 g/kg mb劑量下，SD大鼠未見異常，無異常死亡;歐陽力劍等[24]對(duì)大鯢皮中膠原蛋白及應(yīng)用進(jìn)行綜述。然而有關(guān)大鯢肌肉中膠原蛋白及肌基質(zhì)蛋白的深入報(bào)道極少。

本研究以大鯢肌肉中提取獲得的肌基質(zhì)蛋白與大鯢皮為原料，分別用乙酸、胃蛋白酶提取膠原蛋白，比較2 種來源、同種提取方式獲得的膠原蛋白異同，對(duì)大鯢肌肉提取可溶性蛋白后的肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白進(jìn)行開發(fā)利用，為大鯢肌基質(zhì)蛋白的高附加值利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鯢肉、大鯢皮 陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

冰乙酸 天津永晟精細(xì)化工有限公司;胃蛋白酶（酶活力3 000～3 500 U/mg） 安徽宏達(dá)生物工程有限公司;氯化鈉、檸檬酸 天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司;L-羥脯氨酸、氯胺T 上海源葉生物科技有限

公司;無水乙酸鈉、正丙醇、檸檬酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;二甲氨基苯甲醛、高氯酸、異丙醇 無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津儀器公司;DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;JA5003分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;PE28 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;TGL-20M冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;VERTEX70傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司;飛鈉（Phenom）臺(tái)式掃描電子顯微鏡 美國FEI公司;SNB-2數(shù)字黏度計(jì) 上海倫捷機(jī)電儀表有限公司;DZF-6050真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DYCZ-24DN垂直電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鯢皮與肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白的提取

1.3.1.1 大鯢皮中膠原蛋白的提取

稱取新鮮大鯢皮50.0 g，按料液比1∶10（m/V）加入0.10 mol/L氫氧化鈉，于4 ℃浸泡過夜，中間更換3 次浸泡液，流水沖洗后人工去除大鯢皮上的肌肉和油脂，加入5 g碳酸氫鈉和0.5 g檸檬酸揉搓大鯢皮除去脂肪，再用酵母發(fā)酵去味，用流水徹底洗凈大鯢皮，切成0.5 cm×0.5 cm的小片，放入聚乙烯袋中，保存在-40 ℃?zhèn)溆谩?/p>

準(zhǔn)確稱取處理后大鯢皮100.0 g，按液料比1∶20（m/V）加入0.5 mol/L乙酸，于4 ℃冰箱提取24 h（不時(shí)攪拌），取出后用紗布過濾，而后將初濾液置于高速冷凍離心機(jī)中離心（4 ℃、10 000 r/min、15 min），取上清液，加入NaCl至終濃度為0.9 mol/L。將此溶液置于4 ℃冰箱中鹽析過夜后，轉(zhuǎn)移到截留分子質(zhì)量為7 000 Da的透析袋中，去離子水透析3 d，真空冷凍干燥后即得酸溶性膠原蛋白粉末[5]。

對(duì)酸提后紗布過濾的剩余物繼續(xù)用胃蛋白酶進(jìn)行酶解，調(diào)節(jié)體系pH值為5.0，40 ℃水浴鍋中酶解4 h，酶解結(jié)束后于100 ℃水浴加熱10 min滅酶，取出后用紗布過濾，將初濾液置于高速冷凍離心機(jī)中離心（4 ℃、10 000 r/min、15 min），取上清液，加入NaCl至終濃度為0.9 mol/L，4 ℃鹽析過夜后，轉(zhuǎn)移到截留分子質(zhì)量為7 000 Da的透析袋中，用去離子水透析2 d，真空冷凍干燥后即得胃蛋白酶解膠原蛋白粉末。

膠原蛋白酸提取率、胃蛋白酶提取率按照式（1）～（2）計(jì)算。

（1）

（2）

式中：m1為酸溶性膠原蛋白干粉質(zhì)量/g;m2為酸提前大鯢皮質(zhì)量/g;m3為胃蛋白酶解膠原蛋白干粉質(zhì)量/g;m4為胃蛋白酶提取前大鯢皮質(zhì)量/g。

1.3.1.2 大鯢肉肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白的提取

稱取已絞碎的大鯢肉糜50.0 g，加入4 倍體積0.05 mol/L、pH 7.5的磷酸鹽緩沖液，在磁力攪拌輔助下提取3 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀物中再加入上述磷酸鹽緩沖液，重復(fù)上述操作，將上清液合并即得水溶性肌漿蛋白。向沉淀中加入4 倍含0.6 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖溶液，磁力攪拌輔助提取8 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，重復(fù)上述操作，合并上清液，即得鹽溶性肌原纖維蛋白。所得沉淀用蒸餾水反復(fù)洗滌5 次，即得肌基質(zhì)蛋白。將肌基質(zhì)蛋白冷凍干燥，研磨成粉末置于-12 ℃冰箱備用[7]。

準(zhǔn)確稱取冷凍干燥的肌基質(zhì)蛋白粉末5.00 g，其余操作與膠原蛋白酸法提取率、胃蛋白酶法提取率計(jì)算同1.3.1.1節(jié)。

1.3.2 紫外光譜測定

將分別從大鯢肉肌基質(zhì)蛋白、大鯢皮中采用不同提取方式制備的1 mg/mL膠原蛋白溶液置于紫外-可見分光光度計(jì)卡槽中，測定200～800 nm波長范圍的吸光度，間隔1 nm，繪制吸光度隨波長變化的曲線圖。

1.3.3 紅外光譜測定

采用溴化鉀壓片法[25]：準(zhǔn)確稱取200.0 mg溴化鉀粉末6 份，5 份分別與1 mg膠原蛋白凍干粉樣品混勻，另1 份作空白對(duì)照，置于瑪瑙缽體中研成細(xì)粉后進(jìn)行壓片。使用紅外光譜儀測定4 000～400 cm-1內(nèi)的透過率。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）測定分別對(duì)從大鯢肉肌基質(zhì)蛋白、大鯢皮中制備的膠原蛋白進(jìn)行SDS-PAGE測定[26]。

1.3.5 膠原蛋白中羥脯氨酸含量測定

1.3.5.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

稱取50.0 mg L-羥脯氨酸于100 mL容量瓶中，加蒸餾水充分溶解，加入200 μL 3 mol/L硫酸溶液，蒸餾水定容，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取5.00 mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液至500 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，再分別吸取10、20、30、40 mL于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容，得到標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度依次為0.5、1.0、1.5、2.0 ?g/mL（臨用時(shí)配制）。以L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度（?g/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為

y=0.207x+0.017（R2=0.999 7）。

1.3.5.2 試樣羥脯氨酸含量測定

稱取0.4 g樣品于具塞三角瓶中，加入3 mL 3 mol/L硫酸溶液，蓋緊塞子，105 ℃干燥箱恒溫16 h。將經(jīng)硫酸水解后的溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，取1 mL 3 mol/L硫酸溶液洗滌三角瓶，將洗滌液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用蒸餾水定容備用。

移取4 mL處理好的樣品溶液于比色管中，加入2 mL氯胺T溶液，室溫下放置20 min后避光加入2 mL顯色劑，用塑料薄膜進(jìn)行封口。將比色管迅速放入60 ℃水浴鍋中水浴20 min，取出后用流水冷卻比色管至少3 min，室溫下放置30 min，以蒸餾水為空白對(duì)照，測定558 nm波長處的吸光度，帶入L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出試樣中羥脯氨酸質(zhì)量濃度。羥脯氨酸含量按式（3）計(jì)算[27]。

（3）

式中：X為樣品中羥脯氨酸含量/%;ρ為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣中羥脯氨酸質(zhì)量濃度/（?g/mL）;m為樣品質(zhì)量/g;V為吸取試樣溶液的體積/mL。

1.3.6 膠原蛋白掃描電子顯微鏡觀察

取少許膠原蛋白冷凍干燥粉末，將直徑12 mm雙面碳導(dǎo)電膠片粘貼在釘型樣品臺(tái)上，而后將樣品均勻覆蓋在膠片表面，用鑷子將釘型樣品臺(tái)夾起放置于電鏡標(biāo)準(zhǔn)樣品杯中，旋轉(zhuǎn)樣品杯，動(dòng)力除塵器吹幾次除去灰塵后放置于電鏡載物臺(tái)，調(diào)節(jié)最佳視野和放大倍數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.7 黏度測定

取冷凍干燥后膠原蛋白，制備50 mL 2.5 mg/mL膠原蛋白溶液于室溫靜置20 min后，用SNB-2黏度計(jì)SP2、SP3轉(zhuǎn)子測定黏度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖，Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢皮和大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白提取率

酸法提取膠原蛋白主要是由于乙酸可以破壞膠原蛋白分子間的離子鍵，使蛋白發(fā)生膠原纖維膨脹而溶解，酶法則是利用蛋白酶使膠原蛋白溶解。

由圖1可知，利用酶法提取得到的大鯢皮和大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白的提取率均優(yōu)于酸法提取。大鯢皮膠原蛋白酸法提取率為肌基質(zhì)蛋白酸法提取率的2 倍以上?？傮w分析，大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白含量低于大鯢皮，大鯢皮中2 種膠原蛋白總提取率比肌基質(zhì)蛋白中總提取率高18.23%。

2.2 大鯢皮和大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白的紫外光譜

測定結(jié)果色氨酸（280 nm）、酪氨酸（275 nm）和苯丙氨酸（257 nm）等在近紫外區(qū)會(huì)出現(xiàn)較強(qiáng)的光吸收。

由圖2～3可知，大鯢皮、大鯢肌基質(zhì)蛋白的酸法提取、胃蛋白酶提取膠原蛋白最大吸收峰均位于232 nm波長附近，與顧賽麒等[28]研究的大鯢皮膠原蛋白、鯰魚皮膠原蛋白（233 nm）[29]、鰱魚皮膠原蛋白（232 nm）[30]的最大紫外吸收峰波長基本一致。其次在250～280 nm波長處也都有吸收峰，酸提法得到的2 種膠原蛋白在257 nm波長處有苯丙氨酸的特征吸收峰，胃蛋白酶提取得到的2 種膠原蛋白在280 nm波長處有色氨酸的特征吸收峰，大鯢皮中提取獲得的膠原蛋白較大鯢肉中提取獲得的膠原蛋白吸收峰更顯著。2 種來源、不同提取方式獲得的膠原蛋白紫外吸收特性差異不明顯。

2.3 大鯢皮和大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白紅外光譜測定結(jié)果

由圖4～5可知：酸提大鯢皮中膠原蛋白在酰胺A帶（3 390 cm-1左右）有明顯吸收峰，酸提肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白有近似吸收峰出現(xiàn);酸提肌基質(zhì)蛋白、大鯢皮中膠原蛋白均在酰胺B帶（2 955 cm-1左右）、酰胺Ⅰ帶（1 730 cm-1左右）、酰胺Ⅱ帶（1 600 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1 250 cm-1）有特征吸收峰。酶提法所得膠原蛋白特征吸收峰較多，在酰胺A帶、酰胺B帶等也有特征峰出現(xiàn)，2 種膠原蛋白頻率相似，但各特征吸收頻率上吸收強(qiáng)度相差較大。2 種酸提膠原蛋白和2 種酶提膠原蛋白與顧賽麒等[28]研究結(jié)果相似，表明從大鯢肉肌基質(zhì)蛋白、大鯢皮中提取的膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)均較為完整。

2.4 大鯢皮和大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白的SDS-PAGE結(jié)果

1. 大鯢皮酸法提取膠原蛋白;2. 大鯢皮酶法提取膠原蛋白;3. 大鯢肌基質(zhì)蛋白酸法提取膠原蛋白;4. 大鯢肌基質(zhì)蛋白酶法提取膠原蛋白。

由圖6可知，酸法和酶法提取大鯢肌基質(zhì)蛋白、大鯢皮中的膠原蛋白均包含α1、α2亞基，分子質(zhì)量93～130 kDa，也有分子質(zhì)量約200 kDa的β鏈，均與已報(bào)道的Ⅰ型膠原蛋白特征一致[31]，也與已報(bào)道的大鯢皮膠原蛋白電泳圖條帶相似[30]。酸提的2 種膠原蛋白分子質(zhì)量相差不大，基本符合Ⅰ型膠原蛋白特性，但大鯢皮中蛋白種類比肌基質(zhì)蛋白中種類更多，而酶法提取的大鯢皮中膠原蛋白條帶亮度比大鯢肌基質(zhì)蛋白中提取的膠原蛋白條帶亮度更大。

2.5 大鯢皮和大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白的羥脯氨酸含量

由表1可知，從大鯢皮中提取的2 種膠原蛋白羥脯氨酸含量最高，分別為（16.05±0.16）%和（18.04±0.08）%。大鯢肌基質(zhì)蛋白中羥脯氨酸含量為（4.42±0.16）%，2 種提取方式所得膠原蛋白中，酸提法得到的膠原蛋白羥脯氨酸含量最高，為（10.37±0.23）%，與不同提取所得大鯢皮膠原蛋白相比仍較低。

2.6 大鯢皮和大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果由圖7可知，乙酸提取大鯢肌基質(zhì)蛋白中的膠原蛋白交聯(lián)緊密，呈現(xiàn)致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，說明乙酸提取法能夠很好保持膠原蛋白原有結(jié)構(gòu)。經(jīng)胃蛋白酶水解后，膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)變化較大，交聯(lián)片段明顯被切碎。

由圖8可知，大鯢皮粉的結(jié)構(gòu)呈網(wǎng)狀塊，酸法提取所得膠原蛋白較肌基質(zhì)蛋白中的膠原蛋白片狀較大，交聯(lián)性好，但是有小分子物質(zhì)聚焦在片狀結(jié)構(gòu)上。酶法提取的大鯢皮膠原蛋白表面光滑，呈片狀結(jié)構(gòu)，交聯(lián)片段較完整。酸法提取、胃蛋白酶法提取的大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白掃描電子顯微鏡結(jié)構(gòu)與大鯢皮中膠原蛋白相差較大。

2.7 大鯢皮和大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白的黏度

由表2可知，大鯢肉肌基質(zhì)蛋白、大鯢皮中酸法提取膠原蛋白的黏度均大于酶法提取，這是由于酶解時(shí)會(huì)破壞蛋白結(jié)構(gòu)，影響蛋白黏度。大鯢皮酸提膠原蛋白黏度與大鯢肌基質(zhì)蛋白酸提膠原蛋白差異顯著（P<0.05）。

3 結(jié) 論

利用乙酸法提取大鯢皮、大鯢肌基質(zhì)蛋白中的膠原蛋白，提取率分別為18.29%、7.08%，胃蛋白酶法提取大鯢皮、大鯢肌基質(zhì)蛋白中的膠原蛋白提取率分別為25.67%、18.65%，大鯢皮中膠原蛋白總提取率比肌基質(zhì)蛋白中高18.23%。大鯢皮酸提膠原蛋白中羥脯氨酸含量比肌基質(zhì)蛋白中酸提膠原蛋白高5.68%，大鯢皮酶提膠原蛋白中羥脯氨酸含量比肌基質(zhì)蛋白中高9.31%。大鯢肌基質(zhì)蛋白中的酸提膠原蛋白、酶提膠原蛋白的紫外光譜特征分別與大鯢皮中2 種膠原蛋白相似，紅外光譜特征基本相似，吸收峰強(qiáng)度存在差異，且紅外光譜均在酰胺A、B帶和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶有紅外特征吸收峰，符合膠原蛋白特征，但大鯢皮的酸提、酶提膠原蛋白波動(dòng)范圍較小。肌基質(zhì)蛋白的酸法和酶法提取膠原蛋白SDS-PAGE中可得到2 條α肽鏈和1 條β肽鏈，基本符合Ⅰ型膠原蛋白特征，酸提的2 種膠原蛋白分子質(zhì)量基本相同，但大鯢皮中蛋白種類比肌基質(zhì)蛋白中種類更多，酶法提取大鯢皮膠原蛋白比肌基質(zhì)蛋白中提取的膠原蛋白條帶亮度更大、更清晰，蛋白含量更高。掃描電鏡結(jié)果說明，酸法提取能較好維持大鯢皮、大鯢肌基質(zhì)蛋白中膠原蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，酶法提取則會(huì)將膠原蛋白酶解成小分子的膠原蛋白肽，但是大鯢皮的酶法提取膠原蛋白結(jié)構(gòu)較肌基質(zhì)蛋白中提取的膠原蛋白結(jié)構(gòu)更為完整。

大鯢肉提取可溶性蛋白后的不溶性肌基質(zhì)蛋白能夠進(jìn)一步提取膠原蛋白，且與大鯢皮中的膠原蛋白性能相近，可開發(fā)出優(yōu)質(zhì)的膠原蛋白，提高大鯢副產(chǎn)物的加工利用程度。

參考文獻(xiàn)：

[1] 辛茜， 陳德經(jīng)， 陳小華， 等. 水酶法與熱熔法提取大鯢油的精制工藝和品質(zhì)比較研究[J]. 中國油脂， 2018， 43（12）： 26-30. DOI：10.13386/j.issn1003-7969.2018.12.007.

[2] 王海文. 我國大鯢Megalobatrachus davidianus （Blanchard）研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景的探討[J]. 現(xiàn)代漁業(yè)信息， 2002（7）： 5-8. DOI：10.13386/j.issn1004-8340.2002.07.002.

[3] 高士賢， 戴定遠(yuǎn)， 范勤德. 常見藥用動(dòng)物[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1984： 140-141.

[4] 曹潔， 余龍江， 崔永明， 等. 純大鯢粉對(duì)小鼠抗疲勞作用及免疫功能的影響[J]. 四川動(dòng)物， 2008（1）： 149-152. DOI：10.3969/j.issn.1000-7083.2008.01.045.

[5] 李莉， 顧賽麒， 王錫昌， 等. 人工養(yǎng)殖大鯢肌肉和鯢皮營養(yǎng)成分分析及評(píng)價(jià)[J]. 食品工業(yè)科技， 2012， 33（24）： 385-388.

[6] 楊慧， 陳德經(jīng)， 陳海濤， 等. 大鯢肌肉分離蛋白特性[J]. 肉類研究， 2020， 34（7）： 28-32. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200515-121.

[7] 蔣挺大. 膠原與膠原蛋白[M]. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2006： 2-5.

[8] WANG Lingzhao， YANG Bao， DU Xiuqiao， et al. Optimization of conditions for extraction of acid-soluble collagen from grass carp （Ctenopharyngodon idella） by response surface methodlogy[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies， 2008， 9（4）： 604-607.

DOI：10.1016/j.ifset.2008.03.001.

[9] ZENG Shaokui， ZHANG Chaohua， LIN Hong， et al. Isolation and characterisation of acid-solubilised collagen from the skin of Nile tilapia （Oreochromis niloticus）[J]. Food Chemistry， 2009， 116：

879-883. DOI：10.1016/j.foodchem.2009.03.038

[10] KOLODZJEJSKA I， SIKORSKI Z E， NIECKOWSKA C. Parameters affecting the isolation of collagen from squid （Illex argentinus） skins[J]. Food Chemistry， 1999， 66（2）： 153-157. DOI：10.1016/S0308-8146（98）00251-9.

[11] 錢曼. 魚鱗膠原蛋白的提取與膠原海綿的制備研究[D]. 武漢： 華中科技大學(xué)， 2008. DOI：10.76666/d.y1394308.

[12] WOO J W， YU S J， CHO S M， et al. Extraction optimization and properties of collagen from yellowfin tuna （Thunnus albacares） dorsal skin[J]. Food Hydrocolloids， 2008， 22（5）： 879-887. DOI：10.1016/j.foodhyd.2007.04.015.

[13] NALINANON S， BENJAKUL S， VISESSANGUAN W， et al. Use of pepsin for collagen extraction from the skin of bigeye snapper （Priacanthus tayenus）[J]. Food Chemistry， 2007， 104（2）： 593-601. DOI：10.1016/j.foodchem.2006.12.035.

[14] 郝林華， 李八方. 多棘海盤車體壁膠原蛋白的研究[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)， 1999（2）： 3-5. DOI：10.3321/j.issn：1005-8737.1999.02.005.

[15] 王錫念， 徐志善， 孫欽軍， 等. 不同方法提取鮟鱇魚皮膠原蛋白的比較和分析[J]. 食品研究與開發(fā)， 2019， 40（10）： 80-87. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2019.10.015.

[16] 韓瑋， 邢瀚文， 施文正， 等. 羅非魚膠原蛋白4 種制備方法比較

研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2020， 54（1）： 102-108. DOI：10.16445/j.cnki.1000-2340.20200215.005.

[17] 趙然， 曹敏杰， 王晶， 等. 水產(chǎn)動(dòng)物源膠原蛋白的提取及應(yīng)用研究

進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)， 2020， 11（22）： 8157-8165.

[18] 肖嵐， 李誠， 付剛， 等. 5 種蛋白酶對(duì)豬皮膠原蛋白水解效果的比較研究[J]. 食品研究與開發(fā)， 2015， 36（17）： 10-14. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.003.

[19] 李莉， 顧賽麒， 王錫昌， 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取大鯢皮膠原蛋白工藝[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)， 2013， 20（4）： 876-883. DOI：10.3724/SP.J.1118.2013.00876.

[20] 李靜， 葉欣， 冉旭. 高溫高壓提高大鯢皮膠原蛋白肽提取率的研究[J].

食品工業(yè)， 2015， 36（10）： 1-5.

[21] 周艷華， 張鵬飛， 李濤， 等. 干制大鯢皮膠原蛋白提取工藝優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)， 2020， 41（1）： 1-4.

[22] 周艷華， 譚璐， 李濤， 等. 酶解大鯢皮膠原蛋白制備抗氧化肽工藝研究[J]. 中國食品添加劑， 2019， 30（2）： 111-117. DOI：10.3969/j.issn.1006-2513.2019.02.010.

[23] 徐陽， 孫強(qiáng)， 李靜， 等. 大鯢膠原蛋白多肽口服液的開發(fā)研究[J].

食品工業(yè)， 2016， 37（3）： 1-5.

[24] 歐陽力劍， 符廣勇. 大鯢皮膚中膠原蛋白的初步提取分析與應(yīng)用研究[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚， 2017（1）： 72-73.

[25] 楊慧， 陳德經(jīng)， 夏冬輝， 等. 大鯢皮膚色素提取工藝及抗氧化研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2019， 31（5）： 887-894. DOI：10.16333/j.1001-6880.2019.5.023.

[26] 林方養(yǎng)， 楊耀東， 萬婕， 等. 幾種不同SDS-PAGE凝膠電泳染色方法的比較[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 42（8）： 2295-2296.

[27] 中國商業(yè)聯(lián)合會(huì)商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中心， 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣州）， 廣州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所. 肉與肉制品 羥脯氨酸含量

測定： GB/T 9695.23—2008[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2009.

[28] 顧賽麒， 李莉， 王錫昌， 等. 人工養(yǎng)殖大鯢皮膠原蛋白的性質(zhì)研究[J].

食品科學(xué)， 2014， 35（19）： 74-79. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201409016.

[29] 宮子慧， 林琳， 孟昌偉， 等. 乳酸提取鮰魚皮膠原蛋白工藝優(yōu)化[J]. 肉類研究， 2011， 25（7）： 18-23. DOI：10.3969/j.issn.1001-8123.2011.07.007.

[30] 張強(qiáng)， 王倩倩， 陸劍鋒， 等. 不同方法提取鰱魚皮膠原蛋白的理化特性比較[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2014， 30（5）： 104-110.

[31] ZHAO Guanli， LIU Yanliu， REN Jiaoyan， et al. Effect of protease pretreatment on the functional properties of protein concentrate from defatted peanut flour[J]. Journal of Food Process Engineering， 2013， 36（1）： 9-17. DOI：10.1111/j.1745-4530.2011.00646.x.