水產(chǎn)品特定腐敗菌應(yīng)用價值及分析技術(shù)研究進(jìn)展

左迪 馬長安 李博

摘 要：特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）是影響水產(chǎn)品腐敗的主要因素之一。本文分析SSO在水產(chǎn)品貨架期預(yù)測與延長中的實(shí)際應(yīng)用價值，總結(jié)水產(chǎn)品SSO多種分析技術(shù)，如細(xì)菌基因組重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、變性梯度凝膠電泳、限制性片段長度多態(tài)性和高通量測序等，為水產(chǎn)品SSO分析技術(shù)的研發(fā)提供理論參考，也為水產(chǎn)品SSO的深入研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)品;特定腐敗菌;貨架期預(yù)測;應(yīng)用價值;分析技術(shù)

A Review of Specific Spoilage Organisms in Aquatic Products： Application Value and Analytical Technologies

ZUO Di， MA Changan， LI Bo*

（School of Health and Social Care， Shanghai Urban Construction Vocational College， Shanghai 201415， China）

Abstract： The specific spoilage organism （SSO） is one of the most important causes of aquatic product spoilage. Here， we review the potential value of SSO in predicting and more broadly extending the shelf life of aquatic products and we summarize various technologies for the analysis of SSO in aquatic products such as repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction （Rep-PCR）， denaturing gradient gel electrophoresis technology （DGGE）， restriction fragment length polymorphism technology （RFLP） and high-throughput sequencing. We hope that this review will provide a theoretical basis for the development of new technologies to analyze SSO in aquatic products for further research.

Keywords： aquatic products; specific spoilage organisms; shelf life prediction; application value; analytical technologies

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201005-240

中圖分類號：TS254.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）12-0094-05

引文格式：

左迪， 馬長安， 李博. 水產(chǎn)品特定腐敗菌應(yīng)用價值及分析技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 肉類研究， 2020， 34（12）： 94-98. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201005-240.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZUO Di， MA Changan， LI Bo. A review of specific spoilage organisms in aquatic products： application value and analytical technologies[J]. Meat Research， 2020， 34（12）： 94-98. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201005-240.? ? http：//www.rlyj.net.cn

每年，全世界因微生物污染而造成的食物腐敗率高達(dá)25%，腐敗微生物的研究受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注[1]。水產(chǎn)品味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是重要的優(yōu)質(zhì)動物蛋白源，深受消費(fèi)者青睞。水產(chǎn)品因肌肉等組織中水分、不飽和脂肪酸和可溶性蛋白的含量很高，在捕撈至加工銷售過程中易發(fā)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象[2]，微生物是引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因，因此，控制和分析導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的微生物種類，延長水產(chǎn)品的貨架期具有重要的實(shí)際意義和經(jīng)濟(jì)價值[3]。本文綜述水產(chǎn)品的腐敗機(jī)理，對引起腐敗的特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）進(jìn)行分析，同時對SSO的分析方法進(jìn)行比較，旨在為抑制SSO新技術(shù)的開發(fā)提供應(yīng)用參考，也為水產(chǎn)品貯藏和貨架期的延長提供指導(dǎo)。

1 水產(chǎn)品SSO

水產(chǎn)品腐敗主要是指某些微生物在生長、代謝過程中會產(chǎn)生胺、硫化物、醛、酮、酯、有機(jī)酸等物質(zhì)，同時伴有不良?xì)怏w和滋味，使得水產(chǎn)品在感官上不被接受。而在水產(chǎn)品腐敗過程中占有優(yōu)勢的這些微生物被稱為SSO。SSO在水產(chǎn)品貯藏早期的數(shù)量和群落占比都非常小，但隨著貯藏時間延長，SSO的數(shù)量快速增長，菌落占比明顯上升。

水產(chǎn)品中的SSO種類眾多，其分布和數(shù)量受到水產(chǎn)品的種類、產(chǎn)地、季節(jié)、加工及貯藏環(huán)境等因素影響。目前，已知的水產(chǎn)品SSO主要有鮮魚中的弧菌科（Vibrionaceac）、假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）;魚、貝和甲殼動物中的希瓦氏菌（Shewanella）、磷發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）、乳酸菌（Lactobacillus）、熱殺索絲菌（Brochothothrix thermosphacta）、芽孢桿菌（Bacillus）和梭狀芽孢桿菌（Clostridium prazmowski）[4-7]等。

2 SSO的應(yīng)用

2.1 SSO生長模型及水產(chǎn)品貨架期預(yù)測

細(xì)菌菌落總數(shù)是評判水產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)，而水產(chǎn)品因貯藏條件的差異而表現(xiàn)出不同的腐敗特性，因此依據(jù)細(xì)菌菌落總數(shù)評判水產(chǎn)品新鮮度并不準(zhǔn)確[8]。在水產(chǎn)品貯藏期間，SSO的生長和繁殖速率明顯高于其他細(xì)菌，且隨著貯藏時間的延長，SSO在菌落總數(shù)中的比例也不斷增加，SSO的代謝產(chǎn)物有明顯的異味及腐臭味，感官刺激強(qiáng)烈，因此SSO的數(shù)量或代謝產(chǎn)物的含量可以作為水產(chǎn)品新鮮度的評定指標(biāo)，同時SSO的數(shù)量和生長模型可預(yù)測水產(chǎn)品剩余貨架期。歐盟“魚類鮮度評定”研究中，確定了產(chǎn)品剩余貨架期與腐敗希瓦氏菌、磷發(fā)光桿菌、熱殺索絲菌、乳酸菌的數(shù)量直接相關(guān)，且遠(yuǎn)大于總活菌數(shù)與魚類剩余貨架期的相關(guān)性[9]。因此，建立腐敗希瓦氏菌、磷發(fā)光桿菌和假單胞菌屬的生長動態(tài)模型，并應(yīng)用于有氧、真空、氣調(diào)包裝冷鏈水產(chǎn)品剩余貨架期的預(yù)測[10-11]。

水產(chǎn)品貨架期與SSO的數(shù)量密切相關(guān)，建立SSO生長預(yù)測模型有助于水產(chǎn)品質(zhì)量的保證和貨架期的預(yù)測。早期的概率模型在水產(chǎn)品加工貯藏中應(yīng)用廣泛，但概率模型屬于典型的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，不能明確顯示微生物的實(shí)際生長情況，因此早期的概率模型被動態(tài)模型取代。根據(jù)模型中變量的不同，可分為初級模型、次級模型和三級模型[12]。

初級模型反映在特定條件下微生物隨時間變化而產(chǎn)生的差異，一般包含修正的Gompertz模型、Baranyi模型、Logistic模型、Richards模型、Stannard模型及Schnute模型等，其中修正的Gompertz、Baranyi、Logistic 3 種模型是初級模型中應(yīng)用較為廣泛的生長預(yù)測模型。修正的Gompertz模型能夠繪制生長延滯期、快速生長期等微生物生長發(fā)育不同時期的S型曲線，預(yù)測效果較好;而Baranyi與Logistic模型最大的區(qū)別在于Baranyi模型中添加了遲滯期參數(shù)[13];魚類氣調(diào)包裝中的SSO磷發(fā)光桿菌動力學(xué)采用Logistic模型，結(jié)果顯示，預(yù)測貨架期與實(shí)測貨架期相比相對誤差較小[14]。

次級模型反映環(huán)境因素，如溫度、pH值、水分活度、氣體組成等對微生物生長的影響，次級模型多涉及響應(yīng)面方程、平方根方程和Arrhennius方程等，其中響應(yīng)面方程可以與修正的Gompertz模型聯(lián)合使用;Arrhennius方程顯示微生物與溫度的相互關(guān)系，但此模型并不適用于冷藏食品[15]。建立不同溫度條件下假單胞菌生長的平方根模型與Arrhenius模型，結(jié)果顯示，平方根模型對于微生物最大比生長速率與生長延滯期的預(yù)測偏差小于Arrhenius模型[16]。

三級模型也稱之為專家模型，是在初級模型和次級模型基礎(chǔ)上建立的共享軟件，也是能夠計算不同環(huán)境下微生物行為的專門系統(tǒng)，Combase數(shù)據(jù)庫是全球范圍內(nèi)涉及食品微生物模型的最大數(shù)據(jù)庫，模擬微生物具體生長環(huán)境存在一些局限性，所以專家模型還有待于進(jìn)一步的研發(fā)與完善[17]。

2.2 SSO的抑制及水產(chǎn)品貨架期的延長

SSO是引起水產(chǎn)品腐敗的主要因素，根據(jù)SSO的生物學(xué)特性抑制SSO的生長，能夠延長水產(chǎn)品的貨架期。常采用低溫貯藏、不同包裝（如空氣包裝、真空包裝、氣調(diào)包裝等）、保鮮處理3 種方法抑制SSO生長。

貯藏溫度影響微生物的生長，進(jìn)而影響水產(chǎn)品的腐敗，因此水產(chǎn)品主要以低溫貯藏為主，低溫貯藏能在一定程度上抑制SSO的生長，延長水產(chǎn)品的貨架期;鱸魚（Lateolabrax japonicus）和草魚（Ctenopharyngodon idellus）在微凍（-2 ℃）狀態(tài)下，SSO的生長抑制率明顯高于冷藏（4 ℃）狀態(tài)，微凍貯藏還能緩解鱸魚品質(zhì)的劣變[18];冷藏條件下的氣調(diào)包裝羅非魚片，貨架期可延長至18 d[19]。

水產(chǎn)品主要通過袋裝、真空包裝、氣調(diào)包裝等形式進(jìn)行包裝，SSO的種類隨著水產(chǎn)品包裝方式的不同而產(chǎn)生明顯差異，因此可以選用不同的包裝方式抑制SSO的生長。在扇貝的貯藏中，產(chǎn)品處理后采用真空包裝方式，其殘存的SSO（梭狀芽孢桿菌）受到抑制，且產(chǎn)品的水分含量仍保持在較高的水平，在保證水產(chǎn)品安全的基礎(chǔ)上又保證其食用品質(zhì)[20];地中海旗魚（Tetrapturus）采用有氧托盤包裝，其SSO為假單胞菌和腐敗希瓦氏菌，更換為真空包裝，SSO變?yōu)槿樗峋?，而變更為氣調(diào)包裝后，SSO則為磷發(fā)光桿菌，不同包裝方式旗魚的SSO種類明顯不同，其中氣調(diào)包裝旗魚貨架期最長，而托盤包裝狀態(tài)下，旗魚的腐敗率最高[21]。

水產(chǎn)品中常采用物理保鮮、化學(xué)保鮮和生物保鮮等方法控制SSO，延長貨架期。采用殼聚糖溶液（2 g殼聚糖加入98 mL體積分?jǐn)?shù)1%醋酸溶液混合后配制成）和石榴皮提取物（體積比1∶2）處理虹鱒（Oncorhynchus mykiss）后，-18 ℃條件下虹鱒的保藏期長達(dá)6 個月[22];混合保鮮劑聚己二酸丁二酯和牛至精油組成的生物薄膜用于魚片貯藏后，可有效減少魚片中嗜冷菌數(shù)量[23];生物保鮮劑處理青占魚后，其貨架期延長4～5 d[24];貯藏帶魚（Trichiurus haumela）中添加茶多酚（生物抗氧化劑）和Nisin（生物抗菌劑）后，帶魚貨架期有效延長6 d[25-26]。

3 SSO分析技術(shù)的研究現(xiàn)狀

水產(chǎn)品中的SSO與產(chǎn)品種類有關(guān)，且存在很大差異。傳統(tǒng)的SSO分析方法包括鏡檢、平板培養(yǎng)、生化反應(yīng)、產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)等，但這些方法周期較長，靈敏度和準(zhǔn)確度較低[27]，且并非所有的食品微生物都可進(jìn)行培養(yǎng)，因此，傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定分析水產(chǎn)品SSO的方法存在一定局限性和制約性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子診斷技術(shù)多用于SSO分析，其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）廣泛應(yīng)用于食品微生物領(lǐng)域[28]。水產(chǎn)品中SSO的分析技術(shù)包括細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR（repetitive extra-genic palindromic PCR，Rep-PCR）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和高通量測序技術(shù)等。

3.1 Rep-PCR技術(shù)

Rep-PCR技術(shù)以細(xì)菌DNA中重復(fù)的回文序列為引物，對細(xì)菌基因組進(jìn)行擴(kuò)增后得到指紋圖譜，揭示基因組間的差別，在細(xì)菌分析和檢測方面具有很好的簡捷性和實(shí)用性[29]。DiversiLab（DVL）系統(tǒng)是以Rep-PCR技術(shù)為原理的自動化分子分型系統(tǒng)。采用DVL系統(tǒng)對食品中的21 株副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）進(jìn)行分子分型，分析各菌株之間的相關(guān)性，并將分型結(jié)果與脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）技術(shù)結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)DVL系統(tǒng)中副溶血性弧菌分群能力和分辨率與PFGE分型結(jié)果相似[30]，但其簡便性和實(shí)用性遠(yuǎn)高于PFGE技術(shù)，同時Rep-PCR法也明顯優(yōu)于核糖體分型方法[31-32];采用DVL系統(tǒng)和PFGE 2 種方法分別對2 株阪崎腸桿菌屬（Cronocacter）菌株丙二酸鹽克羅諾桿菌（Cronocacter malonatius）和都柏林克羅諾桿菌（Cronocacter dublinensis）進(jìn)行分型比較，結(jié)果表明，Rep-PCR對菌株分類和種群分類的分析效果明顯優(yōu)于PFGE[33];采用Rep-PCR技術(shù)分析150 份水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌分離株，發(fā)現(xiàn)Rep-PCR分析技術(shù)不僅可以區(qū)分不同分離株，還可以區(qū)分不同病毒型的分離株[34]。

3.2 DGGE技術(shù)

DGGE技術(shù)是利用DNA結(jié)構(gòu)的特異性和穩(wěn)定性，結(jié)合凝膠電泳測定細(xì)菌16S rDNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物，分析不同條件下不同樣品中微生物的群落組成變化和數(shù)量變化，判斷樣品中的優(yōu)勢菌[35]。與其他分析技術(shù)相比，DGGE技術(shù)在微生物群落多樣性和種群差異性檢測方面具有顯著優(yōu)勢，近年來DGGE技術(shù)也越來越多地應(yīng)用于水產(chǎn)品SSO的研究[36-37]。大西洋庸鰈（Hippoglossus hippoglossus）比其他大多數(shù)白魚物種具有更長的保質(zhì)期，對其SSO的研究具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值，研究結(jié)果也能為其他魚類保質(zhì)期的延長提供參考[38]。采用DGGE技術(shù)分析海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖青石斑魚（Epinephelus awoara）體表和鰓組織中的黏附菌群，結(jié)果表明，青石斑魚體表黏附菌群組成結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，無明顯的優(yōu)勢菌群，而鰓組織中的黏附菌群組成結(jié)構(gòu)較為簡單，存在明顯的優(yōu)勢菌群，且體表與鰓組織中的黏附菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異，而個體間體表黏附菌群結(jié)構(gòu)相似度較高，DGGE技術(shù)能夠直觀分析養(yǎng)殖水體中的微生物多樣性，獲得環(huán)境微生物群落中的優(yōu)勢菌群[39]。

3.3 RFLP技術(shù)

RFLP技術(shù)的原理是檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，PCR技術(shù)與RFLP分析技術(shù)結(jié)合在一起可以得到簡單有效的分子圖譜。核糖體RNA是特定的目的基因，其中以16S rDNA PCR與RFLP技術(shù)最為成熟。利用RFLP技術(shù)分析冷藏條件下羅非魚下腳料酶解液中的SSO類型，RELP分析顯示，冷藏條件下存在3 種腐敗菌，其中分型Ⅰ有11 種，分型Ⅱ有4 種，分型Ⅲ有3 種，通過序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，分型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別與假單胞菌、氣單胞菌、芽孢桿菌16S rDNA相似性極高，表明冷藏條件下羅非魚下腳料酶解液中SSO為假單胞菌[40]。

以鱸魚為研究對象，采用末端限制性片段長度多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）

技術(shù)分析冷藏條件下鱸魚菌群的變化，推斷假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬（Pseudomonas sp.）是造成鱸魚貨架期縮短的優(yōu)勢腐敗菌[41]。RFLP技術(shù)能夠簡單、快速確定水產(chǎn)品中的SSO，具有較好的應(yīng)用前景。

3.4 高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)是DNA測序發(fā)展里程碑，主要包括以454（GS-FLX）、Solexa Genome Analyzer和SOLiD為代表的第2代高通量測序技術(shù)，以HeliScope TIRM和Pacific Biosciences SMRT為代表的單分子測序技術(shù)，以及Life Science公司推出的Ion Personal Genome Machine（PGM）測序技術(shù)等[42]。高通量測序技術(shù)具有測序精準(zhǔn)、產(chǎn)出量高、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品SSO的研究中[43-44]。

利用高通量測序技術(shù)分析不同冷藏時間（0、4、8 d）牡蠣中SSO的變化，結(jié)果表明，冷藏初期牡蠣中SSO為弧菌屬、希瓦氏菌屬和交替假單胞菌屬，隨著冷藏時間的延長，牡蠣SSO中弧菌屬所占比例迅速下降，SSO為希瓦氏菌屬和交替假單胞菌屬[45]。應(yīng)用高通量測序方法研究克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）在4 ℃冷藏期間微生物多樣性及SSO種類，結(jié)果顯示，希瓦氏菌、肉食桿菌屬（Carnobacterium sp.）、環(huán)絲菌屬、嗜冷菌屬（Psychrobacter sp.）、漫游球菌屬（Vagococcus sp.）、

不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）等在腐敗末期時的物種相對豐度為90.57%，確定克氏原螯蝦的優(yōu)勢腐敗菌為希瓦氏菌、肉食桿菌等[46]。采用高通量測序技術(shù)分析蝦夷扇貝柱在不同貯藏溫度（4、15、25 ℃）下SSO的變化，結(jié)果顯示，4 ℃貯藏條件下蝦夷扇貝柱中SSO為發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、別弧菌屬（Aliivibrio）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas），15 ℃貯藏條件下蝦夷扇貝柱中SSO為發(fā)光桿菌屬和別弧菌屬，而25 ℃貯藏條件下蝦夷扇貝柱中SSO為發(fā)光桿菌屬、別弧菌屬、梭桿菌屬（Fusobacterium）和乳酸菌屬（Lactobacillus），隨著貯藏溫度的變化，SSO種類和所占比例均有明顯改變[47]，這也為水產(chǎn)品的保鮮和貨架期的延長提供了參考。為揭示超高壓處理對牡蠣腐敗菌群的影響，采用高通量測序技術(shù)分析生鮮和腐敗牡蠣的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，新鮮牡蠣中SSO以弧菌屬、希瓦氏菌屬和交替假單胞菌屬為主，而腐敗后牡蠣中的SSO以交替假單胞菌屬和希瓦氏菌屬為主，超高壓處理改變了牡蠣冷藏過程中SSO的構(gòu)成，腐敗希瓦氏菌經(jīng)400 MPa及以上壓力處理后未檢出活菌[48]。

利用高通量測序技術(shù)揭示凡納濱對蝦（4±1） ℃貯藏過程中菌群結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，貯藏凡納濱對蝦初始菌群以鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）為主;隨著冷藏時間的延長，鞘脂桿菌屬、金黃桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬的比例迅速降低，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，交替假單胞菌屬、希瓦氏菌屬和別弧菌屬成為優(yōu)勢菌，高通量測序能夠更加全面和準(zhǔn)確地顯示凡納濱對蝦中菌群的組成、豐度信息及冷藏條件下的SSO[49];高通量測序能夠?qū)λa(chǎn)品在不同貯藏環(huán)境及不同貯藏時間的優(yōu)勢菌群進(jìn)行準(zhǔn)確分析，同時可以結(jié)合微生物動力學(xué)等知識，用于貨架期預(yù)測模型的構(gòu)建、延長貨架期等。

4 結(jié) 語

SSO的生長是水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因，確定SSO在不同貯藏條件下的生長特性，建立SSO生長預(yù)測模型，對于了解不同條件下水產(chǎn)品的腐敗特性、延長水產(chǎn)品的貨架期、保證水產(chǎn)品的質(zhì)量具有重要意義。水產(chǎn)品SSO及貨架期預(yù)測模型的開發(fā)和優(yōu)化仍是研究的重點(diǎn)，同時應(yīng)結(jié)合多種分析技術(shù)確定SSO，深入探究SSO的腐敗機(jī)制，研發(fā)出更有效的SSO控制新技術(shù)。

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