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    麗江烏頭中二萜生物堿成分

    2020-05-16 04:14:06尚語杉任佳俐周先禮
    關鍵詞:二萜分子式柱層析

    尚語杉,劉 為,任佳俐,黃 帥,周先禮,高 峰

    西南交通大學 生命科學與工程學院,成都 610031

    烏頭屬植物多為傳統(tǒng)中藥,其主要成分是二萜生物堿。現(xiàn)代藥理研究表明,二萜生物堿具有抗炎鎮(zhèn)痛,抗心律失常,強心和殺蟲等多種生物活性[1]。麗江烏頭(AconitumforrestiiStapf)為毛茛科(Rannculaceae)烏頭屬植物,產(chǎn)于云南西部、四川西南部地區(qū),塊根有祛風除濕,溫經(jīng)止痛的功效,全草用于殺蟲[2]。目前,從該植物中分離鑒定出的二萜生物堿共20余種,主要為烏頭堿型C19-二萜生物堿[3-6]。迄今為止,未見麗江烏頭活性成分研究的相關報道。但研究發(fā)現(xiàn),烏頭堿型生物堿的水平低于中毒劑量,則具有強心、抗心律失常作用,適當劑量的生物堿對心肌細胞損傷表現(xiàn)出保護作用,如烏頭堿[7]和次烏頭堿[8]能有效抑制H2O2誘導的大鼠心肌細胞氧化應激損傷和凋亡;川芎生物堿[9]和沙棘籽粕生物堿[10]對心肌缺血造成的心肌細胞損傷表現(xiàn)出保護作用。因此本文對麗江烏頭進行了系統(tǒng)的植物化學研究,并同時考察了部分化合物對阿霉素誘導的H9c2心肌細胞損傷的保護活性,以期從該植物中發(fā)現(xiàn)具心肌細胞保護活性的生物堿。

    1 材料、儀器與試劑

    1.1 材料

    麗江烏頭于2018年8月采自云南省麗江市,由云南中醫(yī)藥大學李國棟副教授鑒定,標本(NO.2018HS0801)保存于西南交通大學生命科學與工程學院。

    1.2 儀器與試劑

    核磁共振波譜儀(Bruker AV 400,TMS為內(nèi)標,CDCl3為溶劑),超高效液相色譜(ACQUITY UPLCI-Class)與四級桿飛行時間質(zhì)譜(Xevo G2-S QTof)聯(lián)用儀(Waters公司),Hei-vap digital G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph公司)。薄層層析硅膠GF254(青島海洋化工廠),柱層析硅膠G和H(200~400 目,青島海洋化工廠),堿性氧化鋁(100~200目,天津致遠化學試劑公司)。顯色劑為碘蒸氣和改良碘化鉍鉀溶液,所用試劑均為分析純。

    2 實驗方法

    2.1 提取與分離

    麗江烏頭塊根(11.8 kg)陰干后粉碎,用95%乙醇在室溫下冷浸5次,每次3天。合并濾液,減壓濃縮得乙醇浸膏。浸膏用水溶解,稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2~3,用石油醚萃取,每次4 L,共4次,合并萃取液,濃縮得石油醚萃取物。用氨水溶液將水層的pH調(diào)整至9~10后,用二氯甲烷萃取并濃縮得到總生物堿(140 g)。

    總生物堿經(jīng)硅膠柱層析,以二氯甲烷∶甲醇(100∶1→0∶1)梯度洗脫,得到A~G七個部分,A部分經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺50∶1∶0.05→0∶1∶0.05)梯度洗脫得到A1~A5五個部分。A1部分經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶二乙胺100∶0.5→100∶2),得化合物1(200 mg)和6(274 mg)。A2部分經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇10∶0.2→1∶1),得化合物5(680 mg)和12(11 mg)。A3和A4部分經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶二乙胺100∶0.6→1∶1),得到化合物2(339 mg)、3(840 mg)和11(15 mg)。A5部分經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺10∶0.2∶0.1→1∶1∶0.5),得到化合物9(312 mg)和13(12 mg)。E和F部分經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇10∶0.2→1∶1),得到化合物7(63 mg)和8(230 mg)。G部分經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶二乙胺10∶0.2→1∶1)得到化合物14(63 mg);經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇10∶0.2→1∶1)洗脫得到化合物4(33 mg)。

    圖1 化合物1~14的結構Fig.1 Structures of compounds 1-14

    2.2 對阿霉素誘導的H9c2心肌細胞損傷的保護作用

    采用MTT法測定H9c2心肌細胞存活率。取對數(shù)生長期的H9c2心肌細胞,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后,接種于96孔板內(nèi),每孔100 μL,6×104個細胞,孵育24 h后分組,各組均設6個復孔。空白組加入無細胞的培養(yǎng)液;正常組加入正常的心肌細胞;模型組加入8 μM的阿霉素處理細胞24 h;實驗組加入濃度為40 μM的待測化合物,同時加入8 μM的阿霉素,培養(yǎng)24 h后,每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL,4 h后吸除培養(yǎng)基,加入二甲基亞砜150 μL,置于搖床上振搖10 min,在492 nm波長處測定吸光值(A),按照公式:細胞存活率=(實驗組A值-空白組A值)/(正常對照組A值-空白組A值)×100%計算細胞存活率。

    3 實驗結果

    3.1 結構鑒定

    化合物1白色粉末;HR-EI-MS:m/z392.277 8 [M+H]+,calcd for 392.279 5;分子式C23H37NO4。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:0.75(3H,s,H-18),1.03(3H,t,J=7.2 Hz,H-22),3.24,3.32(各3H,s,2×OMe);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:86.7(d,C-1),26.4(t,C-2),37.8(t,C-3),34.7(s,C-4),51.0(d,C-5),25.3(t,C-6),46.0(d,C-7),73.1(s,C-8),47.2(d,C-9),38.7(d,C-10),49.1(s,C-11),27.9(t,C-12),46.0(d,C-13),75.8(d,C-14),38.1(t,C-15),82.4(d,C-16),62.6(d,C-17),26.5(q,C-18),57.0(t,C-19),49.5(t,C-21),13.8(q,C-22),56.6(q,1-OMe),56.4(q,16-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]一致,故化合物1鑒定為sachaconitine。

    化合物2白色粉末;HR-EI-MS:m/z406.294 1 [M+H]+,calcd for 406.295 2;分子式C24H39NO4。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:0.76(3H,s,H-18),1.05(3H,t,J=7.2 Hz,H-22),3.12,3.24,3.34(各3H,s,3×OMe);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:86.0(d,C-1),26.6(t,C-2),37.8(t,C-3),34.6(s,C-4),49.2(d,C-5),24.3(t,C-6),40.1(d,C-7),78.2(s,C-8),45.7(d,C-9),46.1(d,C-10),51.0(s,C-11),28.7(t,C-12),38.4(d,C-13),75.2(d,C-14),33.7(t,C-15),82.5(d,C-16),62.3(d,C-17),26.5(q,C-18),57.0(t,C-19),49.4(t,C-21),13.6(q,C-22),56.3(q,1-OMe),48.4(q,8-OMe),56.5(q,16-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]一致,故化合物2鑒定為8-O-methylsachaconitine。

    化合物3白色粉末;HR-EI-MS:m/z434.291 5 [M+H]+,calcd for 434.290 1;分子式 C25H39NO5。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:0.77(3H,s,H-18),1.08(3H,t,J=7.2 Hz,H-22),2.03(3H,s,14-OAc),3.21,3.23(各3H,s,2×OMe);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:86.1(d,C-1),25.6(t,C-2),37.9(t,C-3),34.6(s,C-4),45.6(d,C-5),26.8(t,C-6),46.4(d,C-7),74.0(s,C-8),50.9(d,C-9),35.8(d,C-10),49.2(s,C-11),28.7(t,C-12),45.1(d,C-13),77.1(d,C-14),41.2(t,C-15),81.9(d,C-16),61.9(d,C-17),26.5(q,C-18),57.1(t,C-19),49.4(t,C-21),13.7(q,C-22),56.3(q,1-OMe),56.3(q,16-OMe),170.9(s,14-MeCO),21.5(q,14-MeCO)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]一致,故化合物3鑒定為14-O-acetylsachaconitine。

    化合物4白色粉末;HR-EI-MS:m/z438.290 7 [M+H]+,calcd for 438.285 0;分子式C24H39NO6。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.07(3H,t,J=7.2 Hz,H-22),3.22,3.29,3.32(各3H,s,3×OMe);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:86.2(d,C-1),26.1(t,C-2),35.7(t,C-3),39.3(s,C-4),51.1(d,C-5),72.2(d,C-6),56.5(d,C-7),73.9(s,C-8),49.1(d,C-9),45.7(d,C-10),50.8(s,C-11),28.7(t,C-12),38.3(d,C-13),75.6(d,C-14),39.3(t,C-15),82.2(d,C-16),62.8(d,C-17),81.1(t,C-18),54.3(t,C-19),49.4(t,C-21),13.8(q,C-22),56.3(q,1-OMe),56.6(q,16-OMe),59.4(q,18-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]一致,故化合物4鑒定為6-epiforsticine。

    化合物5白色粉末;HR-EI-MS:m/z436.307 5 [M+H]+,calcd for 436.305 7;分子式 C25H41NO5。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.04(3H,t,J=7.2 Hz,H-22),3.11,3.24,3.27,3.33(各3H,s,4×OMe);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:86.1(d,C-1),26.2(t,C-2),32.8(t,C-3),38.7(s,C-4),46.4(d,C-5),23.8(t,C-6),40.2(d,C-7),78.0(s,C-8),45.7(d,C-9),46.0(d,C-10),49.0(s,C-11),28.6(t,C-12),38.2(d,C-13),75.2(d,C-14),33.4(t,C-15),82.4(d,C-16),62.8(d,C-17),79.8(t,C-18),53.2(t,C-19),49.5(t,C-21),13.7(q,C-22),56.3(q,1-OMe),48.3(q,8-OMe),56.4(q,16-OMe),59.6(q,18-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]一致,故化合物5鑒定為8-O-methyltalatisamine。

    化合物6白色粉末;HR-EI-MS:m/z478.314 6 [M+H]+,calcd for 478.316 3;分子式 C27H43NO6。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.05(3H,t,J=7.2 Hz,H-22),2.01(3H,s,14-OAc),3.11,3.26,3.28,3.32(各3H,s,4×OMe);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:85.8(d,C-1),26.7(t,C-2),32.8(t,C-3),38.6(s,C-4),46.2(d,C-5),24.2(t,C-6),46.2(d,C-7),77.9(s,C-8),45.4(d,C-9),43.3(d,C-10),49.2(s,C-11),29.1(t,C-12),35.6(d,C-13),76.0(d,C-14),40.2(t,C-15),83.5(d,C-16),62.0(d,C-17),80.0(t,C-18),53.3(t,C-19),49.4(t,C-21),13.7(q,C-22),56.4(q,1-OMe),48.3(q,8-OMe),56.4(q,16-OMe),59.6(q,18-OMe),171.7(s,8-MeCO),21.5(q,8-MeCO)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]一致,故化合物6鑒定為14-methyltalatisamine。

    化合物7白色粉末;HR-EI-MS:m/z602.3383[M+H]+,calcd for 602.332 4;分子式 C33H47NO9。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.08(3H,t,J=7.2 Hz,H-22),3.20,3.25,3.30,3.32,3.84(各3H,s,5×OMe),6.91(2H,d,J=8.8 Hz,H-3′/5′),7.95(2H,d,J=8.8 Hz,H-2′/6′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:82.8(d,C-1),33.7(t,C-2),72.2(d,C-3),43.4(s,C-4),46.8(d,C-5),81.9(d,C-6),47.8(d,C-7),74.2(s,C-8),53.5(d,C-9),45.2(d,C-10),50.6(s,C-11),28.9(t,C-12),37.3(d,C-13),76.7(d,C-14),41.7(t,C-15),82.9(d,C-16),61.7(d,C-17),77.8(t,C-18),48.9(t,C-19),47.8(t,C-21),13.6(q,C-22),55.9(q,1-OMe),57.8(q,6-OMe),56.2(q,16-OMe),59.3(q,18-OMe),55.5(q,4′-OMe),166.2(s,14-OCOAr),122.8(s,C-1′),131.7(d,C-2′/6′),113.9(d,C-3′/5′),163.5(s,C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]一致,故化合物7鑒定為austroconitine B。

    化合物8白色粉末;HR-EI-MS:m/z616.351 7 [M+H]+,calcd for 616.348 0;分子式 C34H49NO9。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.07(3H,t,J=7.2 Hz,H-22),3.13,3.23,3.29,3.30,3.31,3.83(各3H,s,6×OMe),6.89(2H,d,J=8.6 Hz,H-3′/5′),7.99(2H,d,J=8.6 Hz,H-2′/6′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:82.8(d,C-1),23.3(t,C-2),72.1(d,C-3),43.1(s,C-4),46.0(d,C-5),83.5(d,C-6),48.1(d,C-7),78.7(s,C-8),45.2(d,C-9),45.3(d,C-10),51.0(s,C-11),28.9(t,C-12),38.3(d,C-13),75.9(d,C-14),35.7(t,C-15),83.2(d,C-16),61.0(d,C-17),77.4(t,C-18),47.9(t,C-19),48.6(t,C-21),13.4(q,C-22),55.8(q,1-OMe),58.6(q,6-OMe),48.6(q,8-OMe),56.4(q,16-OMe),59.2(q,18-OMe),55.5(q,4′-OMe),166.3(s,14-OCOAr),123.4(s,C-1′),131.8(d,C-2′/6′),113.6(d,C-3′/5′),163.2(s,C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]一致,故化合物8鑒定為hemsleyadine。

    化合物9白色粒狀結晶(丙酮);HR-EI-MS:m/z644.346 1 [M+H]+,calcd for 644.3429 ;分子式 C35H49NO10。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.06(3H,t,J=7.2 Hz,H-22),1.39(3H,s,8-OAc),3.16,3.23,3.27,3.36,3.82(各3H,s,5×OMe),6.89(2H,d,J=8.6 Hz,H-3′/5′),7.98(2H,d,J=8.6 Hz,H-2′/6′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:83.6(d,C-1),33.4(t,C-2),71.8(d,C-3),43.2(s,C-4),47.0(d,C-5),82.4(d,C-6),44.9(d,C-7),85.9(s,C-8),48.8(d,C-9),43.7(d,C-10),50.6(s,C-11),28.5(t,C-12),38.2(d,C-13),77.2(d,C-14),39.3(t,C-15),82.8(d,C-16),61.5(d,C-17),75.4(t,C-18),48.8(t,C-19),47.7(t,C-21),13.3(q,C-22),55.5(q,1-OMe),57.9(q,6-OMe),55.7(q,16-OMe),59.2(q,18-OMe),56.7(q,4′-OMe),169.8(s,8-MeCO),21.8(q,8-MeCO),166.1(s,14-OCOAr),122.9(s,C-1′),131.8(d,C-2′/6′),113.8(d,C-3′/5′),163.5(s,C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]一致,故化合物9鑒定為vilmorrianine A。

    化合物10白色粒狀結晶(丙酮);HR-EI-MS:m/z660.340 5 [M+H]+,calcd for 660.337 8;分子式 C35H49NO11。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.06(3H,t,J=7.2 Hz,H-22),1.37(3H,s,8-OAc),3.16,3.23,3.27,3.36,3.82(各3H,s,5×OMe),6.92(2H,d,J=8.8 Hz,H-3′/5′),8.00(2H,d,J=9.2 Hz,H-2′/6′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:83.3(d,C-1),33.7(t,C-2),71.8(d,C-3),43.4(s,C-4),47.6(d,C-5),82.4(d,C-6),44.9(d,C-7),85.7(s,C-8),48.8(d,C-9),41.0(d,C-10),50.4(s,C-11),35.4(t,C-12),74.9(s,C-13),78.7(d,C-14),39.8(t,C-15),83.8(d,C-16),61.8(d,C-17),76.1(t,C-18),48.7(t,C-19),47.6(t,C-21),13.5(q,C-22),56.6(q,1-OMe),58.9(q,6-OMe),57.9(q,16-OMe),59.3(q,18-OMe),55.6(q,4′-OMe),170.0(s,8-MeCO),21.8(q,8-MeCO),166.2(s,14-OCOAr),122.8(s,C-1′),131.8(d,C-2′/6′),113.9(d,C-3′/5′),163.6(s,C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]一致,故化合物10鑒定為yunaconitine。

    化合物11白色粉末;HR-EI-MS:m/z362.235 4 [M+H]+,calcd for 362.232 6;分子式 C21H32NO4。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.09(3H,s,H-18),3.21,3.35(各3H,s,2×OMe),7.21(1H,s,H-19);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:85.1(d,C-1),26.4(t,C-2),33.0(t,C-3),46.4(s,C-4),47.0(d,C-5),26.5(t,C-6),52.7(d,C-7),72.4(s,C-8),46.5(d,C-9),46.6(d,C-10),47.8(s,C-11),27.3(t,C-12),37.5(d,C-13),75.6(d,C-14),37.6(t,C-15),82.2(d,C-16),62.0(d,C-17),22.6(q,C-18),169.5(d,C-19),56.2(q,1-OMe),56.7(q,16-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]一致,故化合物11鑒定為N-deethyl-N-19-didehydrosachaconitine。

    化合物12白色粉末;HR-EI-MS:m/z420.274 9 [M+H]+,calcd for 420.274 4;分子式 C24H37NO5。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.00(3H,t,J=7.2 Hz,H-22),3.29,3.31,3.33(各3H,s,3×OMe);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:86.9(d,C-1),24.5(t,C-2),33.0(t,C-3),37.5(s,C-4),48.3(d,C-5),75.1(d,C-6),128.6(d,C-7),137.6(s,C-8),44.6(d,C-9),49.4(d,C-10),50.6(s,C-11),29.6(t,C-12),40.7(d,C-13),77.8(d,C-14),38.9(t,C-15),85.1(d,C-16),92.6(d,C-17),79.4(t,C-18),52.3(t,C-19),49.3(t,C-21),13.2(q,C-22),57.3(q,1-OMe),56.4(q,16-OMe),59.7(q,18-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]一致,故化合物12鑒定為14-debenzoylfranchetine。

    化合物13白色粉末;HR-EI-MS:m/z342.202 0 [M+H]+,calcd for 342.206 4;分子式 C21H27NO3。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.10(3H,s,H-18),2.47(3H,s,H-21),2.60(1H,br t,H-14),2.92(1H,br d,H-12),3.23(1H,s,H-20),3.94(1H,br s,H-2),4.76(1H,br s,H-17a),4.94(1H,br s,H-17b);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:40.7(t,C-1),64.6(d,C-2),48.3(t,C-3),37.2(s,C-4),60.1(d,C-5),208.7(s,C-6),52.0(t,C-7),41.2(s,C-8),46.8(d,C-9),45.3(s,C-10),23.5(t,C-11),53.7(d,C-12),210.5(s,C-13),56.8(d,C-14),36.3(t,C-15),142.8(s,C-16),110.1(t,C-17),27.5(q,C-18),58.2(t,C-19),67.5(d,C-20),41.9(q,C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]一致,故化合物13鑒定為deacetylheterophylloidine。

    化合物14白色粉末;HR-EI-MS:m/z400.208 7 [M+H]+,calcd for 400.211 8;分子式 C23H29NO5。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:1.45(3H,s,H-18),2.03(3H,s,2-OAc),2.37(3H,s,H-21);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:35.5(t,C-1),68.5(d,C-2),43.4(t,C-3),37.0(s,C-4),59.3(d,C-5),196.3(s,C-6),46.6(t,C-7),44.5(s,C-8),48.8(d,C-9),47.0(s,C-10),21.8(t,C-11),57.7(d,C-12),210.8(s,C-13),52.3(d,C-14),71.2(d,C-15),147.3(s,C-16),113.7(t,C-17),31.2(q,C-18),61.2(t,C-19),70.9(d,C-20),42.8(q,C-21),170.0(s,2-MeCO),21.7(q,2-MeCO)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23]一致,故化合物14鑒定為sczukinine。

    3.2 心肌細胞保護活性

    運用MTT法,考察了sachaconitine(1)、8-O-methylsachaconitine(2)、14-O-acetylsachaconitine(3)、6-epiforsticine(4)、8-O-methyltalatisamine(5)、14-methyltalatisamine(6)、austroconitine B(7)、hemsleyadine(8)、vilmorrianine A(9)、yunaconitine(10)、14-debenzoylfranchetine(12)和sczukinine(14)對阿霉素誘導的H9c2心肌細胞損傷的保護作用,結果表明,當濃度為40 μM時,化合物5的細胞存活率為65.25%(阿霉素的細胞存活率為60.24%),表現(xiàn)出一定的保護活性,其他化合物均無活性。

    4 結論

    本文對麗江烏頭干燥塊根進行了二萜生物堿成分的研究,共分離得到14個二萜生物堿,分別為11個烏頭堿型C19-二萜生物堿,1個7,17斷裂型C19-二萜生物堿,2個海替定型C20-二萜生物堿。除化合物10外,均為首次從該植物中分離得到,其中化合物12、13和14分別為首次從該植物中分離得到的7,17斷裂型C19-二萜生物堿和C20-二萜生物堿。同時采用MTT法考察了部分化合物對阿霉素誘導的H9c2心肌細胞損傷的保護活性,發(fā)現(xiàn)濃度為40 μM時,化合物5表現(xiàn)出一定的保護活性。目前,國內(nèi)外對麗江烏頭的研究較少,本研究豐富了麗江烏頭化學成分的多樣性,為后續(xù)尋找活性生物堿成分提供了物質(zhì)基礎。

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