糙葉五加果實乙酸乙酯萃取部位化學(xué)成分及抗炎活性研究

李小軍，金官佑，張曉丹，吳賢哲，金倫喆*，劉向前

1贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心客家中醫(yī)藥資源研究分中心，贛州 341000；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208；3圓光大學(xué)藥學(xué)院，益山 54538；4浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，杭州 310000

糙葉五加Acanthopanaxhenryi(Oliv.) Harms為中國特有的五加科五加屬植物，廣泛分布于湖南、甘肅、四川等地。湖南省中藥材地方標(biāo)準(zhǔn)收載的“五加皮”就是以該植物的根皮入藥，具有祛風(fēng)濕、活血化瘀、壯筋骨等功效，主要用于治療風(fēng)濕痹痛、拘攣麻木、筋骨痞軟、水腫、跌打損傷、疝氣腹痛等[1]。然而，從資源可持續(xù)、合理利用的角度考慮，根皮入藥為不可再生；而其地上部位包括葉、莖、花、果實為可持續(xù)再生資源。為了探究糙葉五加的地上各部位是否可以替代其根皮入藥，我們課題組前期對其葉、莖、花進(jìn)行了系統(tǒng)研究并作了相應(yīng)報道[2-7]。目前為止，對其果實的研究鮮有報道[8]?；诖?，我們首次對糙葉五加果實進(jìn)行了物質(zhì)基礎(chǔ)研究，對糙葉五加果實甲醇提取物依次進(jìn)行了石油醚(60～90)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，基于LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞BV2模型對各萃取部分進(jìn)行抗神經(jīng)炎活性篩選，對活性較好的乙酸乙酯萃取部分進(jìn)行分離純化。

1 儀器與材料

NMR波譜(1D和2D)測試采用JEOL JNM ECP-400核磁共振儀(日本，東京)；HMQC和HMBC實驗參數(shù)設(shè)置分別為1JCH=140 Hz和nJCH=8 Hz；ESI-MS測試采用Q-TOF micro LC-MS/MS質(zhì)譜儀(美國，Waters)；旋光度測試采用Jasco p-2000全自動數(shù)字旋光儀(日本，東京)；高相液相色譜儀為YL9100 HPLC系統(tǒng)(韓國，英麟)；正相和反相TLC采用Kieselgel 60 F254和RP-18 F254s(德國，默克)；常規(guī)柱色譜硅膠(Kieselgel 60，70～230目和230～400目，默克)；反相柱色譜材料YMC-C18(德國，默克)；Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco BRL Co.(Grand Island，NY，USA)；脂多糖(LPS)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Griess試劑購自美國Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)；陽性對照紫鉚因(butein)為韓國圓光大學(xué)藥學(xué)院生藥及天然產(chǎn)物研究室自制(HPLC純度≥98.5%)；小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2來源于韓國圓光大學(xué)Park Hyun教授實驗室。

本實驗樣品于2015年10月份采自湖南省新化，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉向前教授和韓國圓光大學(xué)藥學(xué)院金倫喆教授共同鑒定為五加科五加屬植物糙葉五加Acanthopanaxhenryi(Oliv.) Harms的果實，標(biāo)本保存于湖南省重點(diǎn)實驗室中藥新藥研究與開發(fā)實驗室，標(biāo)本號為AHF20151025。

2 提取與分離

干燥的糙葉五加果實5 kg，粉碎至粗粉，以甲醇回流提取3次，合并提取液,濃縮后得總浸膏。總浸膏加入適量蒸餾水分散后依次用石油醚(60～90)、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取。回收溶劑，得石油醚萃取物(40 g)、乙酸乙酯萃取物(20 g)、正丁醇萃取物(100 g)。

分別以LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7和小膠質(zhì)細(xì)胞BV2作為抗炎活性篩選模型，對上述三個萃取部分進(jìn)行活性篩選。取抗炎活性較好的部位乙酸乙酯浸膏(20 g)經(jīng)反相C18柱色譜，以甲醇-水(1 ∶4→1 ∶0，V/V)梯度洗脫，得13個組分Fr.E1～E13。Fr.E2(309 mg)經(jīng)正相硅膠柱色譜反復(fù)純化得化合物1(5.8 mg)。組分Fr.E3(500 mg)經(jīng)正相硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(20 ∶1→1 ∶1，V/V)梯度洗脫，得化合物2(6.0 mg)和3(61.0 mg)。Fr.E5(796 mg)經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，以正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，再經(jīng)甲醇反復(fù)重結(jié)晶純化，得無色針晶4(5.0 mg)。組分Fr.E8(1.3 g)先經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇(7 ∶1→1 ∶1，V/V)梯度洗脫，得9個亞組分Fr.E8.1～E8.9。Fr.E8.4(125 mg)經(jīng)硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇(10 ∶1，V/V)洗脫，得化合物5(41 mg)。Fr.E8.5(57 mg)經(jīng)硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇(5 ∶1，V/V)洗脫，得化合物6(24 mg)。Fr.E8.2(126 mg)經(jīng)反相C18柱色譜分離，以乙腈-水(1 ∶4，V/V)洗脫，再經(jīng)甲醇重結(jié)晶，得無色針晶8(14 mg)。組分Fr.E6(2.0 g)先經(jīng)反相C18柱色譜分離，以甲醇-水(1 ∶4→2 ∶3，V/V)梯度洗脫，得6個亞組分Fr.E6.1～E6.6；亞組分Fr.E6.4(1.4 g)再經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇-水(3 ∶1 ∶0.1，V/V/V)洗脫，得7個亞組分Fr.E6.4.1～E6.4.7。Fr.E6.4.1(244 mg)經(jīng)反復(fù)正相硅膠柱色譜分離純化，以正己烷-乙酸乙酯(3 ∶1～1 ∶3，V/V)為流動相，再經(jīng)正相制備薄層純化(正己烷-丙酮=2 ∶3，V/V)，得化合物11(1.8 mg)、12(5.0 mg)、13(8.8 mg)。亞組分Fr.E6.4.1.4(26 mg)經(jīng)C18-HPLC分離純化，以甲醇-水為流動相，得化合物14(2.0 mg)和15(7.5 mg)。Fr.E6.4.2(99 mg)先經(jīng)正相硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇(15 ∶1→10 ∶1，V/V)梯度洗脫，再經(jīng)C18-HPLC分離純化，以乙腈-水為流動相，得化合物7(2.1 mg)、10(2.5 mg)、17(2.5 mg)、18(2.3 mg)。Fr.E9(3.1 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，以正己烷-乙酸乙酯(3 ∶1→2 ∶1，V/V)為流動相，得化合物9(24 mg)。組分Fr.E10(1.9 g)先經(jīng)硅膠柱色譜反復(fù)分離純化，再經(jīng)甲醇重結(jié)晶脫色素處理得化合物16(34 mg)。

圖1 化合物1～18的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-18

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色針晶(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：9.53(1H，s，-CHO)，7.38(1H，d，J=3.6 Hz，H-3)，6.58(1H，d，J=3.6 Hz，H-4)，4.60(2H，s，-CH2OH)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：152.6(C-2)，123.4(C-3)，109.6(C-4)，161.9(C-5)，56.3(C-6，-CH2OH)，178.1(C-7，-CHO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道一致，故鑒定化合物1為5-羥甲基-2-糠醛。

化合物2白色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.84(1H，s，H-6)，2.31(3H，s，2-CH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：150.5(C-2)，141.6(C-3)，168.9(C-4，C=O)，144.5(C-5)，139.1(C-6)，13.2(C-7，-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道一致，故鑒定化合物2為5-羥基麥芽酚。

化合物3無色針晶(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.45(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.42(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6)，6.79(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：121.8(C-1)，116.5(C-2)，150.2(C-3)，144.7(C-4)，122.7(C-5)，114.5(C-6)，169.1(C-7，-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道一致，故鑒定化合物3為原兒茶酸。

化合物4無色針晶(甲醇)；UV254和365 nm均顯亮藍(lán)色熒光；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.85(1H，d，J=9.6 Hz，H-4)，7.09(1H，s，H-5)，6.76(1H，s，H-8)，6.20(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)，3.90(3H，s，-OCH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：162.7(C-2)，151.7(C-7)，150.1(C-9)，145.8(C-6)，144.8(C-4)，111.3(C-3)，111.2(C-10)，108.7(C-5)，102.7(C-8)，55.5(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道一致，故鑒定化合物4為6-甲氧基-7-羥基香豆素。

化合物5黃色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：8.05(2H，d，J=9.2 Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J=9.2 Hz，H-3′，5′)，6.38(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.24(1H，d，J=7.6 Hz，glc-H-1′′)，3.70～3.40(6H，m，H-2′′～6′′)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：157.2(C-2)，134.2(C-3)，178.2(C-4)，161.7(C-5)，98.6(C-6)，164.6(C-7)，93.5(C-8)，157.7(C-9)，104.4(C-10)，121.5(C-1′)，131.0(C-2′，6′)，114.8(C-3′，5′)，160.2(C-4′)，102.9(glc-C-1′′)，74.4(C-2′′)，76.7(C-3′′)，70.0(C-4′′)，77.1(C-5′′)，61.3(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道一致，故鑒定化合物5為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物6黃色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：8.06(2H，d，J=9.2 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J=9.2 Hz，H-3′，5′)，6.41(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.10(1H，d，J=7.6 Hz，glc-H-1′′)，4.50(1H，d，J=1.2 Hz，rha-H-1′′′)，3.81(1H，dd，J=11.0，1.2 Hz，H-6′′a)，3.63(1H，m，H-6′′b)，3.70～3.20(8H，m，glc-H-2′′～5′′，rha-H-2′′′～5′′′)，1.12(3H，d，J=6.0 Hz，H-6′′′，rha-CH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：157.2(C-2)，134.2(C-3)，178.0(C-4)，161.6(C-5)，98.7(C-6)，164.7(C-7)，93.7(C-8)，158.2(C-9)，104.4(C-10)，121.4(C-1′)，131.1(C-2′，6′)，114.9(C-3′，5′)，160.2(C-4′)，103.4(glc-C-1′′)，74.4(C-2′′)，75.9(C-3′′)，70.2(C-4′′)，76.8(C-5′′)，67.3(C-6′′)，101.1(rha-C-1′′′)，70.8(C-2′′′)，71.0(C-3′′′)，72.6(C-4′′′)，68.4(C-5′′′)，16.6(C-6′′′，rha-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道一致，故鑒定化合物6為山柰酚-3-蕓香苷。

化合物10白色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.42(2H，m，H-3′，5′)，7.31(2H，m，H-2′，6′)，7.23(1H，m，H-4′)，6.70(1H，d，J=16.0 Hz，H-3)，6.39(1H，dt，J=16.0，6.4 Hz，H-2)，4.55(1H，ddd，J=12.8，5.7，1.6 Hz，H-1a)，4.37(1H，d，J=7.6，Hz，H-1″)，4.33(1H，ddd，J=12.8，6.5，1.4 Hz，H-1b)，3.89(1H，dd，J=13.2，1.6 Hz，H-6″a)，3.69(1H，m，H-6″b)，3.20～3.37(4H，m，H-2″～5″)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：69.4(C-1)，125.4(C-2)，132.5(C-3)，136.9(C-1′)，126.2(C-2′，6′)，128.2(C-3′，5′)，127.4(C-4′)，102.1(glc-C-1′′)，73.8(C-2′′)，76.7(C-3′′)，70.4(C-4′′)，76.8(C-5′′)，61.5(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道一致，故鑒定化合物10為松香。

化合物11無色膠狀物質(zhì)(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH：7.34(5H，m，H-2～6)，4.91(1H，d，J=11.6 Hz，H-7a)，4.61(1H，d，J=11.6 Hz，H-7b)，4.35(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′)，3.53(1H，m，H-3′)，3.42(3H，m，H-2′，4′，5′)，4.45(1H，d，J=12.4 Hz，H-6′a)，4.30(1H，d，J=12.4 Hz，H-6′b)，2.11(3H，s，H3-1′′，CH3CO-)；13C NMR(100 MHz,CDCl3)δC：136.9(C-1)，128.3(C-2，6)，128.6(C-3，5)，128.2(C-4)，71.3(C-7)，101.6(glc-C-1′)，73.7(C-2′)，76.0(C-3′)，70.0(C-4′)，74.1(C-5′)，63.4(C-6′)，21.0(C-1′′，CH3CO-)，171.9(C-2′′，CH3CO-)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道一致，故鑒定化合物11為苯甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷-6′-O-醋酸酯。

化合物16白色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：5.23(1H，t，J=3.6 Hz，H-12)，4.38(1H，d，J=7.6 Hz，GluA-H′-1)，3.77(1H，d，J=10.0 Hz，GluA-H′-5)，3.50(1H，t，J=9.2 Hz，GluA-H′-4)，3.36(1H，t，J=9.6 Hz，GluA-H′-3)，3.34(1H，s，GluA-H′-2)，3.24(1H，m，H-3)，3.18(1H，dd，J=11.2，4.0 Hz，H-18)，0.80，0.84，0.90，0.93，0.94，1.05，1.16(each 3H，s，7 × -CH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：38.5(C-1)，25.7(C-2)，89.8(C-3)，38.9(C-4)，55.7(C-5)，18.0(C-6)，32.5(C-7)，39.3(C-8)，47.7(C-9)，36.6(C-10)，22.8(C-11)，122.4(C-12)，143.8(C-13)，41.6(C-14)，27.5(C-15)，23.2(C-16)，46.3(C-17)，41.4(C-18)，46.0(C-19)，30.3(C-20)，33.6(C-21)，32.7(C-22)，27.2(C-23)，15.7(C-24)，14.7(C-25)，16.4(C-26)，25.2(C-27)，180.5(C-28)，22.7(C-29)，32.3(C-30)，105.7(glc-C-1′)，74.0(C-2′)，76.4(C-3′)，71.9(C-4′)，75.2(C-5′)，171.4(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報道一致，故鑒定化合物16為齊墩果酸-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

4 活性測定

MTT法細(xì)胞毒性試驗：取對數(shù)生長期BV2細(xì)胞接種于96孔板中(1×105個細(xì)胞/孔)，37℃、5% CO2條件下溫孵培養(yǎng)12 h后，給藥組分別加入不同濃度的待測樣品(終濃度分別為5、10、20、40、80 μM)，同時每種藥物均設(shè)加入或不加入LPS(1 μg/mL)兩組。溶劑對照組均不加入受試藥物及LPS，但加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的DMSO。繼續(xù)溫孵培養(yǎng)12 h后，每孔取出100 μL上清液，加入終質(zhì)量濃度為100 mg/mL的MTT工作液孵育0.5 h。形成的甲臜鹽使用酸化異丙醇溶解，在酶標(biāo)儀(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)540 nm處測定各孔吸光度(A)值，以正常組細(xì)胞(未處理)的A值所對應(yīng)的細(xì)胞存活率為100%，計算細(xì)胞存活率。每組重復(fù)3次獨(dú)立實驗，結(jié)果見表1。

NO抑制試驗：采用Griess法檢測對LPS刺激下的BV2細(xì)胞分泌NO的抑制作用。取對數(shù)生長期BV2細(xì)胞接種于96孔板中(1×105個細(xì)胞/孔)，37 ℃、5% CO2條件下溫孵培養(yǎng)12 h后加入100 μL不同濃度的待測樣品(終濃度分別為5、10、20、40、80 μM)，溫孵培養(yǎng)1 h后加入100 μL的LPS(1 μg/mL)，同時設(shè)模型組(LPS+培養(yǎng)液)、陽性對照組(紫鉚因+LPS+培養(yǎng)液)、空白對照組(培養(yǎng)液)，繼續(xù)溫孵培養(yǎng)12 h。每組重復(fù)3次獨(dú)立實驗。將上清液(100 mL)與等體積的格氏試劑混合，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定混合物在540 nm處的A值，計算NO抑制率，結(jié)果見表1。

表1 化合物1～18對LPS誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的細(xì)胞毒性和一氧化氮產(chǎn)生的抑制效果

注：每組數(shù)據(jù)均以三次獨(dú)立的重復(fù)實驗的平均值±SD表示。a化合物16在測試濃度達(dá)到 40～80 μM時具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，測試抗炎結(jié)果無實際意義；在安全濃度范圍0～20 μM且在5 μM濃度時，其表現(xiàn)出了相對較好的NO抑制效果，抑制率為20.6%。Note:Each group of data is represented by the mean ± SD of three independent repeated experiments.aCompound 16 shows strong cytotoxicity when the tested concentration reaches 40-80 μM,and it has no practical significance for the test of anti-inflammatory activity.In the safe concentration range of 0-20 μM and at 5 μM,it showed a moderate NO inhibition effect with the inhibition rate 20.6%.

5 結(jié)論

本文基于脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞BV2模型，首次對糙葉五加果實進(jìn)行了抗炎活性導(dǎo)向下的化學(xué)成分研究，從抗炎活性較好的乙酸乙酯萃取部位中分離鑒定出了18個單體化合物，包括5個木脂素、4個單萜、2個黃酮苷、1個酚酸、1個香豆素、1個苯丙素苷、1個糠醛、1個麥芽酚類、1個苯甲苷和1個三萜苷，其主要成分類型為木脂素和單萜類；而其葉的化學(xué)成分研究，已報道了31個化合物，包括16個三萜皂苷、5個黃酮、6個咖啡?；鼘幩?、1個蒽醌、1個脂肪酰胺苷、1個有機(jī)酸、1個甾體苷[2-5]，葉的主要成分為三萜皂苷、黃酮和咖啡?；鼘幩?；前期研究中對糙葉五加莖報道了18個化合物，包括8個酚類、5個咖啡?；鼘幩犷?、2個植物甾醇、1個木脂素、1個香豆素、1個長鏈脂肪酸，其主要成分類型為酚類和咖啡酰基奎寧酸類；而對糙葉五加花報道的17個化合物中，包括9個咖啡?；鼘幩犷?、6個黃酮及其苷類、1個木脂素苷類、1個苯丙素苷類，其主要成分為二取代的咖啡酰基奎寧酸類及帶有槲皮素或山奈酚母核的黃酮類。比較果實、葉、莖和花的化學(xué)成分發(fā)現(xiàn)，它們的物質(zhì)基礎(chǔ)均存在明顯的差異，表明各不同部位有著不同的用途。

對所得的化合物進(jìn)行抗炎活性篩選發(fā)現(xiàn)，被測試化合物均表現(xiàn)出了一定的一氧化氮(NO)抑制活性，其中，化合物1、4、7、9、12、13、18表現(xiàn)出了較好的抑制NO生成的活性，對于這些單體化合物的潛在抗炎活性研究有待進(jìn)一步進(jìn)行。本文進(jìn)一步豐富了五加科五加屬植物的研究內(nèi)容，同時為中國特產(chǎn)植物糙葉五加的研究提供一定的參考和借鑒。