大葉鑼的酚性成分及其體外抗氧化活性研究

龔 宇，羅 偉，周蕙禎，李麗梅，陳胡蘭*

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611137；2西南民族大學(xué)藥學(xué)院，成都 610041

大葉鑼(DidissandrasesquifoliaC.B.Clarke.)為苦苣苔科(Gesneriaceae)漏斗苣苔屬(Didissandra)多年生草本，別名大一面鑼、白毛草，主要分布于我國(guó)的四川、貴州等西南地區(qū)，常生長(zhǎng)在海拔900～1 600 m的山坡、路旁及峭壁等地。它是我國(guó)民間使用的藥用植物，目前多為野生，被收錄于《四川中藥志》，具有益氣補(bǔ)血、補(bǔ)腎固精的作用，主要用于治療心悸怔腫、神經(jīng)衰弱、崩漏帶下、小便淋瀝等疾病[1]?？嘬奶浦参锓N類(lèi)十分豐富，從該科植物如降龍草(HemiboeasubcapitataClarke)、吊石苣苔(LysionotuspauciflorusMaxim)等中發(fā)現(xiàn)了黃酮類(lèi)、苯乙醇苷類(lèi)、醌類(lèi)、萜類(lèi)、酚類(lèi)糖苷等多種化學(xué)成分[2]。現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等良好生物活性，且有文獻(xiàn)表明苯乙醇苷類(lèi)化學(xué)成分具有神經(jīng)保護(hù)、降低血糖等重要作用[3，4]，從一定程度上說(shuō)明該科植物是具有潛在生物學(xué)活性化合物的重要來(lái)源。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)漏斗苣苔屬植物的化學(xué)成分以及生物活性等方面的相關(guān)報(bào)道，為了明確漏斗苣苔屬植物的化學(xué)成分以及生物活性，本研究運(yùn)用多種色譜技術(shù)首次對(duì)大葉鑼的甲醇及甲醇/水提取物的化學(xué)成分進(jìn)行研究。

圖1 化合物1～15的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-15

1 儀器與材料

1.1 儀器

AVANCE III-400型核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；MicrOTOF QII高分辨質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)；Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(美國(guó)Thermo公司)；半制備色譜柱 (250 mm × 21.2 mm，10 μm，蘇州納微生物科技有限公司，250 mm × 10 mm，5 μm，日本YMC公司)；半制備液相色譜儀(伍豐LC-100)。

1.2 藥品與試劑

甲醇、乙腈、二氯乙烷、乙酸乙酯、石油醚等有機(jī)溶劑(成都科隆化學(xué)品有限公司，AR)；MeOD，DMSO-d6以及CDCl3等氘代試劑(美國(guó)Sigma-Aldrich，99.8% D)；柱色譜硅膠(100～200目和200～300目)、薄層板硅膠(254 nm)(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)；反相硅膠(蘇州納微生物科技有限公司)；DPPH(四川維克奇生物科技有限公司，≥ 97%)；ABTS(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司，98%)；FRAP(北京百靈威科技有限公司，98.5%)。

1.3 藥材

大葉鑼植物的全草于2018年7月采自四川省都江堰市青城山，植物標(biāo)本經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王光志教授鑒定為苦苣苔科漏斗苣苔屬植物大葉鑼(DidissandrasesquifoliaC.B.Clarke.)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取和分離

取干燥大葉鑼(全草)粗粉242.0 g，依次用甲醇(1.5 L)和70%甲醇-水(1.3 L)，在60 °C下提取3次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮，得總浸膏40.2 g(16.6%)?？偨嘤盟稚⒑?，進(jìn)行MCI凝膠柱層析，分別以純水、20%甲醇-水、40%甲醇-水、60%甲醇-水、80%甲醇-水和純甲醇進(jìn)行梯度洗脫，合并得到6個(gè)組分：純水(A，23.9 g)、20%甲醇-水(B，3.9 g)、40%甲醇-水(C，2.7 g)、60%甲醇-水(D，3.1 g)、80%甲醇-水(E，3.9 g)和純甲醇(F，3.4 g)。

隨后，依次將A、B、C和D四個(gè)組分進(jìn)行Sephadex LH-20柱層析(VMeOH∶Vwater= 1∶1)，經(jīng)TLC檢測(cè)將點(diǎn)型相似的組分合并，分別從A中合并得到了6段流分(A1～6)，B中得到了5段(B1～5)，C中得到了3段(C1～3)，D中得到3段(D1～3)。其中，A1段經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20(VMeOH∶Vwater= 1∶1)進(jìn)一步純化，得到5個(gè)流分A1-1～A1-5，A1-3經(jīng)半制備液相(20%乙腈-水)，分離得到化合物3(130.0 mg，24 min)。A2經(jīng)半制備液相色譜，以25%乙腈-水溶劑洗脫，得化合物2(5.1 mg，26 min)。A4經(jīng)半制備液相(20%乙腈-水)制備，分離得到化合物1(15.7 mg，17 min)。B4經(jīng)半制備型HPLC-YMC色譜，40%甲醇-水為洗脫劑，分離得到化合物6(243.8 mg，24 min)和化合物7(251.6 mg，27 min)。B5段經(jīng)過(guò)反相柱層析(10%甲醇水→60%甲醇水)得到B5-1～B5-4四個(gè)流分，其中B5-3使用半制備型HPLC-YMC(18%乙腈-水)分離，依次得到化合物8(150.9 mg，23 min)、9(206.0 mg，26 min)、10(60.2 mg，19 min)和11(100.6 mg，34 min)。C2段經(jīng)Sephadex LH-20(VMeOH∶Vwater= 1∶1)純化得C2-1～C2-4，C2-3通過(guò)半制備高效色譜(28%乙腈-水)制備，得化合物4(3.2 mg，28 min)。C3經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20(VMeOH∶Vwater= 2∶1)柱色譜純化，結(jié)合半制備高效色譜(39%乙腈-水)，分離得到化合物5(2.5 mg，17 min)。D2利用半制備型HPLC-YMC(25%乙腈-水)制備，得到化合物12(6.0 mg，27 min)。D3經(jīng)Sephadex LH-20(VMeOH∶Vwater= 2∶1)純化得化合物13(5.0 mg)。E段組分經(jīng)硅膠柱層析，使用石油醚-乙酸乙酯(100∶1→1∶1)梯度洗脫，合并濃縮后得E1～E6，E1經(jīng)Sephadex LH-20柱(VMeOH∶VEDC=1∶1)進(jìn)一步純化，得化合物14(15.4 mg)。F段經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯100∶1→1∶1)梯度洗脫，得到流分F1～F6，F(xiàn)2經(jīng)反復(fù)結(jié)晶得化合物15(10.3 mg)。

2.2 體外抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 DPPH自由基清除測(cè)定

參考Xiang[5]的方法對(duì)大葉鑼浸膏的六個(gè)不同極性組分(A～F)和6個(gè)含量較高的化學(xué)成分(化合物6～11)進(jìn)行DPPH自由基清除能力的測(cè)定。將待測(cè)樣品用DMSO溶解并稀釋至一系列適當(dāng)?shù)臐舛龋?0.0 μL待測(cè)液與新鮮制備的DPPH溶液(160.0 μL，2.0 × 10-4mol/L)混合，搖勻后避光放置30 min。反應(yīng)完畢后迅速在全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀下于515 nm處讀數(shù)，使用抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照，并以不同質(zhì)量濃度(5.0、20.0、50.0、100.0、150.0 μg/mL)抗壞血酸的吸光度為縱軸，濃度為橫軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表示為每克干燥樣品的抗壞血酸當(dāng)量(mmol VCE/g)，所有試驗(yàn)均重復(fù)三次。

2.2.2 ABTS+自由基清除測(cè)定

ABTS+自由基清除能力的測(cè)定參照Apea-Bah[6]所述的方法進(jìn)行：將ABTS+溶液用無(wú)水乙醇適當(dāng)稀釋，使得ABTS+儲(chǔ)備液在734 nm處的吸光度為0.7左右，然后將待測(cè)樣品(20.0 μL)加到70.0 μL的ABTS+自由基儲(chǔ)備溶液中，室溫下反應(yīng)10 min后在734 nm處讀取吸光度。同DPPH測(cè)定法一樣，以Vc作陽(yáng)性對(duì)照，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。自由基清除活性顯示為每克干樣品的抗壞血酸當(dāng)量(mmol VCE/g)，所有試驗(yàn)均重復(fù)三次。

2.2.3 總還原能力測(cè)定(FRAP)

根據(jù)文獻(xiàn)[7]的方法，我們對(duì)各個(gè)樣品的總還原能力進(jìn)行了測(cè)定。以FeSO4作為陽(yáng)性對(duì)照，取10.0 μL待測(cè)液與180.0 μL反應(yīng)液(TBTZ)混合，37 ℃水浴保持30 min后于593 nm處讀數(shù)。結(jié)果以不同濃度的FeSO4(50.0、100.0、200.0、300.0、400.0、500.0 μg/mL)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每克樣品中的FeSO4當(dāng)量(mmol FeSO4/g)，所有試驗(yàn)均重復(fù)三次。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末(MeOH);5%硫酸-乙醇顯色劑呈紅色。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：6.96(2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6)，6.64(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3，5)，3.51(2H，t，J= 7.2 Hz，H-2′)，2.59(2H，t，J= 7.2 Hz，H-1′)。經(jīng)與文獻(xiàn)[8]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為對(duì)羥基苯乙醇。

化合物2白色粉末(MeOH);1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：7.44(1H，d，J= 8.6 Hz，H-6)，7.42(1H，s，H-2)，6.85(1H，d，J= 8.6 Hz，H-5)，3.80(3H，s，OCH3)。經(jīng)與文獻(xiàn)[9]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為香草酸。

化合物3黃色固體(MeOH);5%硫酸-乙醇顯色劑呈黃色。ESI-MS：m/z478.92 [M-H]-；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：7.42(1H，d，J= 4.7 Hz，H-2′)，7.35(1H，dd，J= 9.1，4.7 Hz，H-6′)，6.93(1H，s，H-8)，6.88(1H，d，J= 9.1 Hz，H-5′)，6.70(1H，s，H-3)，5.10(1H，d，J= 6.0 Hz，H-1″)，3.26～3.88(m，Glu-H)。經(jīng)與文獻(xiàn)[10]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為6-hydroxyluteolin-7-O-glucuronide。

化合物4黃色固體(MeOH);5%硫酸-乙醇顯色劑呈黃色。ESI-MS：m/z463.08 [M+H]+，301.02 [M - Glc+H]+；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：8.05(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2′，6′)，7.19(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，5′)，6.96(1H，s，H-8)，6.83(1H，s，H-3)，5.03(1H，d，J= 7.2 Hz，Glc-H-1)，3.92(3H，s，OCH3)，3.72～3.17(m，Glc-H)。經(jīng)與文獻(xiàn)[11]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為stachannin A。

化合物5黃色固體(MeOH);5%硫酸-乙醇顯色劑呈黃色。1H NMR(400 MHz,MeOD)δ：7.89(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2′，6′ )，6.92(2H，d，J= 8.6 Hz，H-3′，5′)，6.83(1H，s，H-8)，6.63(1H，s，H-3)。與文獻(xiàn)[12]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為野黃芩素。

化合物6棕黃色固體(MeOH-Water);5%硫酸-乙醇顯色劑呈紅色→淡黃綠色。1H NMR(400 MHz,MeOD)δ：7.63(1H，d，J= 14.9 Hz，H-7″)，7.06(1H，d，J= 1.4 Hz，H-2″)，6.97(1H，dd，J= 8.1，1.4 Hz，H-6″)，6.80(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5″)，6.70(1H，d，J= 2.3 Hz，H-2)，6.67(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5)，6.58(1H，dd，J= 8.2，2.3 Hz，H-6)，6.26(1H，d，J= 14.9 Hz，H-8″)，5.35(1H，d，J= 1.5 Hz，Api-H-1)，4.40(1H，d，J= 7.9 Hz，Glc-H-1)，4.04(1H，m，H-8)，3.90(1H，d，J= 1.4 Hz，Api-H-2)，3.42～3.77(m，Api/Glc-H)，2.80(2H，m，H-7)；13C NMR(100 MHz,MeOD)δ：131.4(C-1)，114.9 (C-2)，146.1(C-3)，144.7(C-4)，116.5(C-5)，121.2(C-6)，36.5(C-7)，72.2(C-8)，127.6(C-1″)，115.1(C-2″)，146.8(C-3″)，149.7(C-4″)，117.1(C-5″)，123.1(C-6″)，147.7(C-7″)，116.3(C-8″)，168.3(C=O)，104.1(C-1′)，75.8(C-2′)，81.4(C-3′)，70.6(C-4′)，75.9(C-5′)，62.3(C-6′)，111.5(C-1′″)，78.2(C-2′″)，80.6(C-3′″)，75.12(C-4′)，65.6(C-5′)。經(jīng)與文獻(xiàn)[13]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為calceolarioside E。

化合物7棕黃色固體(MeOH-Water);5%硫酸-乙醇顯色劑呈紅色。1H NMR(400 MHz,MeOD)δ：7.48(1H，d，J= 15.9 Hz，H-7″)，6.93(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2″)，6.83(1H,dd，J= 8.2，1.9 Hz，H-6″)，6.66(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5″)，6.57(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2)，6.54(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5)，6.42(1H，dd，J= 8.2，1.9 Hz，H-6)，6.13(1H，d，J= 15.9 Hz，H-8″)，5.05(1H，s，Rha-H-1)，4.70(1H，t，J= 9.7 Hz，Glc-H-4)，4.25(1H，d，J= 7.9 Hz，Glc-H-1)，3.80～3.17(m，H-8 or Rha/Glc-H)，2.65(2H，m，H-7)，0.95(3H，d，J= 6.2 Hz，Rha-CH3)；13C NMR(100 MHz,MeOD)δ：131.4(C-1)，117.1(C-2)，144.6(C-3)，146.0(C-4)，116.5(C-5)，121.3(C-6)，36.5(C-7)，72.3(C-8)，127.6(C-1″)，115.2(C-2″)，149.7(C-3″)，146.8(C-4″)，116.3(C-5″)，123.2(C-6″)，148.0(C-7″)，114.6(C-8″)，168.3(C=O)，104.1(C-1′)，76.1(C-2′)，81.7(C-3′)，70.5(C-4′)，75.9(C-5′)，62.3(C-6′)，103.0(C-1′)，72.2(C-2′)，72.0(C-3′)，73.8(C-4′)，70.4(C-5′)，18.4(C-6′)。經(jīng)與文獻(xiàn)[14]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為verbasoside。

化合物8深棕綠色固體(MeOH);5%硫酸-乙醇顯色劑呈紅色。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：7.49(1H，d，J= 15.9 Hz，H-7″)，7.05(1H，s，H-2″)，6.99(1H，d，J= 7.7 Hz，H-6″)，6.75(1H，d，J= 7.7 Hz，H-5″)，6.64(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5)，6.62(1H，s，H-2)，6.48(1H，d，J= 8.1 Hz，H-6)，6.23(1H，d，J= 15.9 Hz，H-8″)，4.63(1H，t，J= 9.4 Hz，Glc-H-4)，4.27(1H，d，J= 7.7 Hz，Glc-H-1)，3.06～3.89(m，H-8/Glc-H)，2.68(2H，m，H-7)；13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ：129.2(C-1)，116.3(C-2)，145.5(C-3)，145.0(C-4)，114.9(C-5)，119.6(C-6)，35.1(C-7)，70.3(C-8)，125.5(C-1″)，115.5(C-2″)，145.7(C-3″)，148.6(C-4″)，115.8(C-5″)，121.4(C-6″)，143.6(C-7″)，113.9(C-8″)，166.0(C=O)，102.8(C-1′)，74.1(C-2′)，74.7(C-3′)，71.3(C-4′)，73.6(C-5′)，60.9(C-6′)。經(jīng)與文獻(xiàn)[15]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為calceolarioside A。

化合物9棕綠色固體(MeOH);5%硫酸-乙醇顯色劑呈紅色。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：7.44(1H，d，J= 15.9 Hz，H-7″)，7.05(1H，s，H-2″)，6.96(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6″)，6.74(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5″)，6.60(1H，s，H-2)，6.57(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5)，6.44(1H，d，J= 8.1 Hz，H-6)，6.27(1H，d，J= 15.9 Hz，H-8″)，4.37(1H，d，J= 11.7 Hz，Glc-6′a)，4.22(1H，d，J= 7.6 Hz，Glc-H-1)，4.14(1H，dd，J= 11.7，6.0 Hz，Glc-6′b)，2.97～3.77(m，H-8/Glc-H)，2.65(2H，m，H-7)；13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ：129.4(C-1)，116.1(C-2)，145.3(C-3)，143.8(C-4)，116.6(C-5)，119.7(C-6)，35.4(C-7)，70.5(C-8)，125.6(C-1″)，114.0(C-2″)，145.9(C-3″)，148.9(C-4″)，115.7(C-5″)，121.7(C-6″)，145.3(C-7″)，115.1(C-8″)，166.8(C=O)，103.2(C-1′)，73.6(C-2′)，76.7(C-3′)，70.3(C-4′)，74.0(C-5′)，63.8(C-6′)。經(jīng)與文獻(xiàn)[16]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為calceolarioside B。

化合物10深墨綠色固體(MeOH);5%硫酸-乙醇顯色劑呈紅色。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：7.43(1H，d，J= 15.9 Hz，H-7″)，7.05(1H，s，H-2″)，6.98(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6″)，6.75(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5″)，6.63(1H，s，H-2)，6.62(1H，d，J= 8.3 Hz,H-5)，6.47(1H，d，J= 8.3 Hz，H-6)，6.24(1H，d，J= 15.9 Hz，H-8″)，4.88(1H，t，J= 9.3 Hz，Glc-H-3)，4.32(1H，d，J= 7.7 Hz，Glc-H-1)，3.86～3.77(m，H-8/Glc-H)，2.65(2H，m，H-7)；13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ：129.2(C-1)，116.4(C-2)，145.2(C-3)，143.6(C-4)，115.9(C-5)，119.6(C-6)，34.7(C-7)，70.2(C-8)，125.7(C-1″)，115.5(C-2″)，145.7(C-3″)，148.4(C-4″)，115.5(C-5″)，121.3(C-6″)，144.8(C-7″)，114.8(C-8″)，166.2(C=O)，102.6(C-1′)，71.5(C-2′)，77.8(C-3′)，68.0(C-4′)，76.7(C-5′)，60.7(C-6′)。經(jīng)與文獻(xiàn)[17]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為plantainoside A。

化合物11棕黃色固體(MeOH);5%硫酸-乙醇顯色劑呈紅色→淡黃綠色。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ：7.44(1H，d，J= 15.6 Hz，H-7″)，7.05(1H，s，H-2″)，6.95(1H，d，J= 8.1 Hz，H-6″)，6.74(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5″)，6.60(1H，s，H-2)，6.57(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，6.44(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6)，6.27(1H，d，J= 15.6 Hz，H-8″)，5.22(1H，d，J= 1.5 Hz，Api-H-1)，4.35(1H，d，J= 11.3 Hz，Glc-H-1)，4.19(1H，m，H-8)，3.99(1H，d，J= 1.4 Hz，Api-H-2)，3.15～3.88(m，Api/Glc-H)，2.67(2H，m，H-7)；13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ：129.1(C-1)，116.3(C-2)，145.6(C-3)，143.6(C-4)，115.5(C-5)，119.5(C-6)，34.9(C-7)，70.4(C-8)，125.4(C-1″)，114.9(C-2″)，145.4(C-3″)，148.6(C-4″)，115.8(C-5″)，121.5(C-6″)，145.0(C-7″)，113.8(C-8″)，166.6(C=O)，102.8(C-1′)，73.5(C-2′)，81.7(C-3′)，68.5(C-4′)，73.6(C-5′)，63.7(C-6′)，109.2(C-1′″)，76.0(C-2′″)，79.1(C-3′″)，73.3(C-4′″)，63.0(C-5′″)。經(jīng)與文獻(xiàn)[18]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為isonuomioside A。

化合物12黃色固體(MeOH);5%硫酸-乙醇顯色劑呈黃色。ESI-MS:m/z485.09 [M+Na]+，323.15 [M - Glc+Na]+，301.16 [M - Glc+Na]+；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：7.97(H，d，J= 8.7 Hz，H-2′，6′)，6.93(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3′，5′)，6.93(1H，s，H-8)，6.84(1H，s，H-3)，5.03(1H，m，Glc-H-1)，3.90(3H，s，OCH3)。與文獻(xiàn)[19]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為7-O-甲基黃芩素-6-O-葡萄糖苷。

化合物13黃色固體(MeOH);5%硫酸-乙醇顯色劑呈黃色。ESI-MS：m/z485.12 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：7.86(2H，d，J= 8.3 Hz，H-2′，6′)，6.86(2H，d，J= 8.3 Hz，H-3′，5′)，6.60(1H，s，H-8)，6.38(1H，s，H-6)，5.41(1H，br s，Glc-H-1)，3.83(3H，s，OCH3)。與文獻(xiàn)[20]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為鼠李檸檬素-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物14橙紅色晶體(CHCl3);5%硫酸-乙醇顯色劑呈橙紅色。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：13.33(1H，s，1-OH)，12.94(1H，s，4-OH)，8.35(2H，m，H-6，7)，7.86(2H，m，H-5，8)，7.44(1H，s，H-3)，4.86(2H，s，2-CH2)。與文獻(xiàn)[21]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為1，4-二羥基-2-羥甲基蒽醌。

化合物15橙紅色晶體(CHCl3);254 nm處有紫外吸收，5%硫酸-乙醇顯色劑呈橙紅色。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：13.37(1H，s，1-OH)，12.99(1H，s，4-OH)，8.37～8.34(2H，m，H-6，7)，7.84～7.82(2H，m，H-5，8)，7.18(1H，q，H-3)，2.38(3H，d，J= 0.7 Hz，CH3)。與文獻(xiàn)[22]比對(duì)基本一致，鑒定該化合物為1，4-二羥基-2-甲基蒽醌。

3.2 體外抗氧化活性的測(cè)定

植物能夠產(chǎn)生高度多樣化的天然抗氧化劑，這些物質(zhì)在防止或延緩活性氧和非自由基對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷中起著重要作用，因此對(duì)植物中化合物進(jìn)行抗氧化活性的測(cè)定是非常必要的。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了大葉鑼總浸膏A～F六個(gè)組分以及化合物6～11的體外抗氧化活性，結(jié)果如圖2所示。每個(gè)化合物均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，DPPH測(cè)定的變化范圍為0.02～0.35 mmol VCE/g，ABTS為0.25～4.28 mmol VCE/g，F(xiàn)RAP為0.29～18.16 mmol FeSO4/g。

DPPH自由基抗氧化能力測(cè)試結(jié)果表明，化合物10(5.35±0.04 mmol VCE/g)的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，各個(gè)化合物DPPH自由基清除活性順序如下：10>9>11>6>7>8。其中化合物9(5.14±0.36 mmol VCE/g)和10的DPPH自由基清除活性略小于陽(yáng)性對(duì)照組(5.68±0.10 mmol VCE/g)，并且表現(xiàn)出比酪醇(EC50= 11.74 mg/mL)更強(qiáng)的抗氧化活性[23]?；衔?和10在ABTS自由基清除測(cè)定和FRAP測(cè)定中同樣也顯示出更高的抗氧化活性，且化合物6～11的總還原能力均大于FeSO4(6.58 mmol/g)，顯示出了良好的抗氧化活性。有文獻(xiàn)報(bào)道多個(gè)酚羥基的出現(xiàn)，尤其是存在鄰二羥基構(gòu)象的排列是具有良好自由基清除活性的重要結(jié)構(gòu)特征[24]。從大葉鑼中分離得到的化合物6～11皆具“鄰二羥基構(gòu)象”的咖啡酸和羥基酪醇片段，進(jìn)一步證明了該類(lèi)化合物具有較高體外抗氧化活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

同時(shí)，各組分的體外抗氧化活性測(cè)定的結(jié)果表明，B(3.58±0.00 mmol VCE/g)、C(2.75±0.07 mmol VCE/g)和D(3.41±0.01 mmol VCE/g)組分的DPPH、ABTS自由基的清除能力優(yōu)于其他組分，按以下順序排列：B > C > D > A > E > F。結(jié)合該植物各極性段所含化合物類(lèi)型情況，具有強(qiáng)抗氧化性的苯乙醇苷類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物主要來(lái)源于B、C和D這三段，由此可以說(shuō)明這類(lèi)化合物的存在是其高抗氧化性的主要貢獻(xiàn)者。

圖2 大葉鑼化學(xué)成分及浸膏的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果Fig.2 Antioxidant activity of chemical constituents and different extracts from D.sesquifolia.

4 結(jié)論

本研究從大葉鑼植物全草的甲醇以及甲醇-水提取物中共分離鑒定了15個(gè)化合物，所有化合物均首次從漏斗苣苔屬植物中分離得到。結(jié)果顯示大葉鑼的酚性成分主要為苯乙醇苷類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物，首次揭示了漏斗苣苔屬植物成分多樣性。此外，體外抗氧化活性研究結(jié)果表明，各組分以及主要化合物均具有抗氧化活性。其中苯乙醇苷類(lèi)化合物9和10的抗氧化活性最為優(yōu)異，為大葉鑼提取物的抗氧化活性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。截至目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大葉鑼的研究甚少，本次研究補(bǔ)充了該植物在化學(xué)成分以及抗氧化活性方面的知識(shí)，為其在天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)以及藥物先導(dǎo)化合物的篩選上奠定基礎(chǔ)。此外，該研究分析的植物總浸膏量較少，分離鑒定的大多為主要化學(xué)成分，對(duì)其微量成分的研究有所欠缺，而且生物活性的研究比較單一，僅涉及到體外抗氧化活性。后續(xù)研究將會(huì)圍繞微量成分的分析以及文獻(xiàn)提及的神經(jīng)保護(hù)等生物活性開(kāi)展，試圖尋找結(jié)構(gòu)新穎皆具良好生物活性的化合物。