復烤煙葉DNA提取條件優(yōu)化

吳時璽，焦凱旋，侯寧寧，胡騰飛，黃啟蒙，李 萌，馬 林

（1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450000；2.浙江中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，浙江杭州 310004）

0 引言

煙葉經(jīng)不同程度的加工處理后，基因組DNA降解嚴重，提取的DNA產(chǎn)量和質量均不理想，解決此類問題，就需要對煙葉DNA的提取方法進行適當?shù)母倪M，以獲得品質高且適于后續(xù)試驗需要的DNA。目前，提取DNA的方法有10多種，但效果各異[1-8]。聶瓊等人[9]認為，目前應用于煙草總DNA的提取方法，步驟比較繁瑣且所需周期較長。鞏艷紅等人[10]曾指出，由于不同的植物和植物自身的不同部位都各具特點，如細胞壁較厚、含酚類、含糖類物質多，很難用同一種方法去提取不同植物的DNA。何雪嬌等人[11]認為，煙草不同內(nèi)在成分的差異，能夠直接影響DNA的提取質量，采用常規(guī)的方法很難達到理想的效果。易慶平等人[12]認為DNA提取步驟較為復雜且耗時較長，采用不同的采樣時期、貯藏方法、DNA提取純化方法等都會對DNA提取質量造成較大的影響。針對不同的研究目的，對DNA純度和產(chǎn)量的要求也不同。所以，應根據(jù)不同的植物特征采用不同的方法對其DNA進行提取。影響煙葉DNA提取的因素除了煙草本身的影響外，還有許多其他方面的影響，如不同的提取方法、不同的試驗步驟等。任如意等人[13]認為，基因組DNA的濃度（DNA產(chǎn)量）在很大程度上取決于煙葉細胞的破碎程度，通過采取不同的試驗轉速及不同的樣品研磨次數(shù)，進而使新鮮煙葉和復烤煙葉都能進行充分的研磨，進而提高DNA產(chǎn)量。王桂蛾等人[14]認為，采用不同純化及沉淀方法能影響DNA產(chǎn)率和品質，不同的沉淀溶劑的使用目的是為了使DNA與其他化合物分離開，從而提高DNA的純凈度。試驗中影響DNA的產(chǎn)量和質量的影響因素還有很多，需不斷地對試驗條件進行優(yōu)化，選取最優(yōu)的條件提取煙草DNA，達到提高DNA的產(chǎn)量和質量。Gadani F等人[15]建立的改良CTAB法提取烤后煙葉基因組DNA。但檢測結果波動較大，特別是對于保存時間較長的烤后煙葉，上述方法很難提取到主條帶單一的基因組DNA。

對CTAB法進一步進行改良，通過對提取條件中的樣品研磨方式、裂解時間、離心轉速、洗滌劑選擇4個主要影響因素進行單因素優(yōu)化，并通過PCR技術檢測基因組DNA的可用性，力求找到提高DNA質量和含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

常用復烤煙草品種紅花大金元、云煙85、云煙87、K326等，云南中煙工業(yè)公司提供；新鮮煙葉種子，各大中煙提供。

1.1.2 試劑

EDTA、EDTA2Na、NaCl、CTAB、PVP、β - 巰基乙醇、三氯甲烷、異戊醇、無水乙醇、溴化乙錠、瓊脂糖等試劑，均為分析純，天津大茂化學試劑廠提供；RNA消化酶（RNase），南京諾唯贊生物科技有限公司提供。

1.1.3 儀器

JXSF TPRP-24型組織研磨儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Thermo Scientific Heraeus MicroCL 17型微量離心機、NanoDrop ND-2000C型超微量分光光度計，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；Vetiti型梯度PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；Mini Bis Pro型凝膠成像分析系統(tǒng)，以色列DNR凝膠成像系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 新鮮煙葉DNA提取

取0.1 g新鮮煙葉置于1.5 mL離心管中，使用組織研磨儀磨成粉末，再用CTAB法提取煙草基因組DNA，提取的DNA于-20°下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 復烤煙葉DNA提取

取0.1 g復烤煙葉置于1.5 mL離心管中，使用組織研磨儀磨成粉末，再用CTAB法提取煙草基因組DNA，提取的DNA于-20°下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 復烤煙葉DNA提取優(yōu)化

對復烤煙葉（以紅花大金元為主）DNA提取過程中的樣品研磨方式、水浴時間、離心轉速、洗滌劑選擇這4個主要影響因素進行單因素條件優(yōu)化，找出最優(yōu)提取條件，縮小與新鮮煙葉DNA的差異，滿足后續(xù)試驗要求。

1.2.4 煙草基因組DNA質量檢測

所提取的新鮮煙葉基因組DNA和復烤煙葉基因組DNA的質量濃度分別進行1.5%的瓊脂糖凝膠檢測和超微量分光光度檢測。根據(jù)OD260/OD280的比值即可判斷所提DNA的純度。OD260/OD280的比值為1.8～2.0說明所提的DNA無降解現(xiàn)象，代表著蛋白質及多糖等物質去除較為徹底；若OD260/OD280＞2.0，則說明有RNA的污染；若OD260/OD280＜1.8，則說明有蛋白質的污染。

1.2.5 PCR檢測

PCR反應體系：20 μL體系，50 ng/μL模板DNA 1 μL，2×Taq plus Master mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ddH2O補充至20 μL。PCR反應程序：預變性94℃，6 min；變性94℃，50 s；退火38℃，30 s，延伸72℃，90 s，40個循環(huán)；終延伸：72℃，6 min，4℃保溫。取3 μL擴增產(chǎn)物上樣于1.5%的瓊脂糖凝膠中，80 V恒壓電泳40 min后，紫外凝膠成像儀拍照。

2 結果與分析

2.1 改良CTAB法提取新鮮煙葉和復烤煙葉基因組DNA結果比較

新鮮煙葉基因組DNA凝膠電泳圖見圖1，4種新鮮煙葉基因組DNA質量濃度和純度檢測結果見表1。

表1 4種新鮮煙葉基因組DNA質量濃度和純度檢測結果

由圖1可知，利用CTAB法提取的新鮮煙葉基因組DNA主條帶很清楚，無明顯雜帶，點樣孔周圍基本沒有發(fā)亮物質。由表1可知，提取的4種新鮮煙葉基因組DNA OD260/OD280的比值為1.8～2.0，DNA純度較高，質量濃度也較大，符合后續(xù)試驗要求。

復烤煙葉基因組DNA凝膠電泳圖見圖2。

由圖2可知，所提取的復烤煙葉DNA主條帶不清晰，點樣孔周圍發(fā)亮，條帶彌散切拖尾嚴重。說明其內(nèi)含有大量RNA、蛋白質、多糖、多酚、鹽類等雜質。目前的CTAB法對復烤煙葉DNA提取不合適，需要進一步優(yōu)化DNA提取條件，去除這些雜質對DNA純度和含量的影響。

2.2 復烤煙葉基因組DNA提取方法優(yōu)化

2.2.1 復烤煙葉研磨次數(shù)優(yōu)化

復烤煙葉研磨次數(shù)優(yōu)化的瓊脂糖凝膠電泳分析見圖3。

由圖3可知，DNA主條帶的完整性明顯較差，均存在不同程度的雜質污染。研磨2次和研磨3次的DNA主條帶相比研磨1次和研磨4次主條帶清晰，效果較好。

不同研磨次數(shù)對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析見表2。

表2 不同研磨次數(shù)對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析

由表2可知，無論研磨幾次，OD260/OD280的比值均滿足試驗要求，但OD260/OD230的比值均較低，都存在著不同程度的小分子鹽類對其影響。相比之下，研磨2次的OD260/OD230最接近2.0，較符合要求。故綜合圖3和表2中數(shù)據(jù)得到結論：在研磨儀頻率為65 Hz，120 S的條件下，研磨2次提取的煙葉DNA效果好于研磨1次，3次，4次。

2.2.2 復烤煙葉轉速優(yōu)化

復烤煙葉轉速優(yōu)化的瓊脂糖凝膠電泳分析見圖4。

由圖4可知，樣品1、2含有嚴重的拖尾現(xiàn)象，看不到DNA主條帶。樣品3有明顯的DNA主條帶，但也有輕微拖尾現(xiàn)象。

不同轉速對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析見表3。

表3 不同轉速對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析

由表3可知，OD260/OD280均為1.8～2.0，說明其內(nèi)酚類和蛋白質去除較為完全，但是OD260/OD230的比值均低于2.0，這說明其內(nèi)有殘存的小分子或者鹽類的影響。隨著轉速的提高，OD260/OD230依次增高，由于該比值在2.0左右才滿足試驗要求，從表3可知轉速為9 000 r/min時試驗結果最符合要求。故認為轉速為9 000 r/min時效果最佳。

2.2.3 復烤煙葉水浴時間優(yōu)化

復烤煙葉水浴時間優(yōu)化的瓊脂糖凝膠電泳分析見圖5。

由圖5可知，提取的煙葉基因組均能得到清晰的DNA主條帶，但水浴25，35 min的DNA主條帶亮度較弱，完整性較差，有拖尾現(xiàn)象；水浴30，40 min所提DNA主條帶清晰，點樣孔附近有很少量蛋白質殘留，效果較好。

水浴時間對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析見表4。

表4 水浴時間對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析

由表4可知，無論水浴25，30，35，40 min，OD260/OD280的比值都能滿足試驗的要求均在1.95左右，而OD260/OD230唯有在65℃下水浴30 min才能在2.0左右（根據(jù)查閱文獻，該比值在2.0左右DNA的純凈度較高）。故綜合圖5及表4中數(shù)據(jù)得到結論，采用水浴時間為30 min提取的煙葉DNA的效果好于水浴 25，35，40 min。

2.2.4 復烤煙葉洗滌劑優(yōu)化

復烤煙葉洗滌劑優(yōu)化的瓊脂糖凝膠電泳分析見圖6。

由圖6可知，1號樣品無明顯DNA主條帶，且拖尾嚴重。2，3，4中可以看到明顯的DNA主條帶，但只有3號樣品有輕微的拖尾現(xiàn)象，點樣孔附近殘留的蛋白質最少，故樣品3的效果最佳，即采用70%乙醇進行DNA除雜效果最為明顯。

采用不同的洗滌劑對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析見表5。

表5 采用不同的洗滌劑對復烤煙葉DNA質量濃度的影響分析

由表5可知，采用無水異丙醇及無水乙醇處理樣品的OD260/OD230偏低，有較多的小分子或者鹽類雜質的存在。相比較，由OD260/OD230的比值可看出采用70%異丙醇和70%乙醇處理的鹽類雜質較少，但從DNA電泳結果可看出，70%異丙醇處理的DNA主條帶不清晰且拖尾嚴重，不能滿足試驗的需求。故綜合表5及圖6得出結論，采用70%的乙醇處理所獲得的DNA的純凈度最好且質量濃度較高。

2.3 PCR檢測

為了考查進一步優(yōu)化后的CTAB法對復烤煙葉基因組DNA的可用性，用引物28、W11進行PCR擴增。

PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳分析結果（引物S28） 見圖7，PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳分析結果（引物w11） 見圖8。

由圖7～圖8可知，4種不同的煙葉品種經(jīng)過PCR擴增后，均能從瓊脂糖凝膠電泳中看出有明顯的擴增條帶，說明提取的DNA能夠很好地滿足后續(xù)PCR對模板DNA的要求，即用進一步改良后的CTAB法提取煙草DNA的方法是可行的。

3 結論

通過對CTAB法提取植物基因組DNA過程中的研磨方式、裂解時間、離心轉速、洗滌劑選擇，這4個主要影響因素進行單因素優(yōu)化。結果表明，采用65 Hz于120 s條件下研磨2次；以轉速9 000 r/min對樣品進行離心；水浴時間30 min及70%乙醇作為洗滌劑。在該優(yōu)化條件下所提煙葉的DNA質量濃度和含量較之前有較大提升，可滿足后續(xù)PCR試驗要求。

除此之外，試驗中發(fā)現(xiàn)適當?shù)募哟驪VP、β-巰基乙醇的用量，其DNA提取效果更佳，主帶條清晰、無拖尾現(xiàn)象，純度較高且OD260/OD280的比值為1.8～2.0，OD260/OD230為2.0左右，能夠滿足后續(xù)PCR試驗對DNA模板的要求。通過多次重復試驗驗證，進一步優(yōu)化后的CTAB法提取的煙葉DNA結果穩(wěn)定。但不同品種間提取的DNA效果可能存在些許差異，需要適當?shù)卦鰷pβ-巰基乙醇的用量才可達到更好的提取條件。

與新鮮煙葉相比，提取的復烤煙葉基因組DNA效果不佳，分析原因可能是：①試驗材料的差異。健康、新鮮、幼嫩的煙草葉片細胞正處于分裂期，含有較多完整的DNA，并且代謝物較少，是理想的植物DNA提取材料。煙葉經(jīng)過復烤之后，存在較多的多糖、多酚等代謝產(chǎn)物，會使DNA的提取純度降低，并且其DNA的完整性也遭到不同程度的破壞，這對后期的DNA提取更加困難。②煙葉研磨方式。新鮮的煙葉其組織細胞有一定的韌性，液氮研磨或者組織研磨器研磨對DNA基本沒有損傷；煙葉經(jīng)過復烤之后，其內(nèi)的組織、細胞變得更加脆弱，外部的機械力量會加速研磨過程中DNA的降解，使得完整的DNA鏈斷開。③水浴過程。新鮮煙葉包裹著DNA的細胞壁較為堅韌，通常水浴40～50 min才可以將細胞壁完全破裂開來，使內(nèi)部的DNA完全裸露出來；復烤后的煙葉其細胞壁經(jīng)過打葉復烤過程的加工后已經(jīng)變得比較脆弱，此時只用水浴20～30 min即可，若水浴時間過長則會使DNA完全降解，導致最終無法提取出煙葉DNA。④離心過程。新鮮煙葉的DNA因未經(jīng)外部高強度力量的破壞，DNA鏈可經(jīng)受高轉速離心；復烤后的煙葉高轉速的離心力會使得完整的DNA鏈破碎成小片段，從而導致最終提的DNA條帶模糊，含量較低。⑤洗滌劑差異。對于新鮮煙葉來說，其DNA鏈較為完整，洗滌劑對DNA提取沒有影響，即哪種洗滌劑都可；對于復烤煙葉來說，其DNA鏈存在著不同程度的破壞，對于洗滌劑的要求較高，試驗后發(fā)現(xiàn)用70%的無水乙醇對DNA進行洗滌效果好于其他洗滌劑。