微波輔助提取柿蒂熊果酸和齊墩果酸的工藝研究

楊 靖，陳志剛，張苗靖，吳建虎，戎友燕，宋藝超，武晉海，

（1.山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000；2.山西省孝義市林業(yè)局，山西孝義 032301；3.山西師范大學(xué)現(xiàn)代文理學(xué)院，山西臨汾 041000）

柿蒂（Diospyros kakiThumb.）別名柿丁，為柿科植物柿的干燥花萼，扁圓形，基部有果梗痕；外表面呈黃褐色或紅棕色，內(nèi)表面呈黃棕色，密被細(xì)絨毛，質(zhì)硬而脆，主產(chǎn)于四川、廣西、福建等地。其味苦、性溫，具有降氣、止反胃、嘔吐及呃逆的功能，研究發(fā)現(xiàn)，柿蒂的提取物還具有鎮(zhèn)靜、抗心律失常、抗生育的作用。柿蒂的主要有效成分為有機(jī)酸類化合物、萜類化合物、糖類化合物等，其中含量最高的有機(jī)酸是熊果酸和齊墩果酸。研究人員在柿蒂化學(xué)成分的分離與鑒定的研究中用70%甲醇提取柿蒂中有效成分，首次分離得到4種萜類化合物化合物，其中包括2,4-羥基齊墩果酸、2,4-二羥基熊果酸。

齊墩果酸（Oleanolic acid,OA），又名慶四素，是一種五環(huán)三萜類化合物，以游離或與糖苷結(jié)合成苷的形式，具有保肝、降糖降脂、抗誘變抗癌[1]、調(diào)節(jié)免疫、抗菌抗病毒、抗炎、抗高血壓等作用。熊果酸（Ursolic acid，UA），又名烏索酸、烏蘇酸、α-香樹脂醇，是一種弱酸性五環(huán)三萜類化合物，具有毒性低、毒性周期短的特點(diǎn)，也是一種毒副作用較小的天然藥物，具有抗腫瘤作用、抗心血管疾病作用，以及保肝、抗肝炎作用。

目前，關(guān)于柿蒂中熊果酸和齊墩果酸的提取研究較少。雖然國內(nèi)柿蒂產(chǎn)量大，但生產(chǎn)加工上易造成資源浪費(fèi)，加之其主要活性成分為三萜酸[2]。采用微波法輔助乙醇提取柿蒂中熊果酸和齊墩果酸[3-4]，經(jīng)蒸發(fā)濃縮后，采用高效液相色譜[5]（HPLC） 法對提取量進(jìn)行檢測，再用正交試驗(yàn)法對其提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[6-11]，為柿蒂保健功能的研究、應(yīng)用及開發(fā)具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

柿蒂，河南省一等，購自北京同仁堂臨汾連鎖藥店。

1.2 儀器與設(shè)備

超微粉碎機(jī)、微波爐、色譜柱等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 柿蒂的預(yù)處理

干燥至恒質(zhì)量，將其放置于超微粉碎機(jī)中粉碎，過100目篩，得柿蒂粉。保鮮膜封存于干燥燒杯，低溫貯藏，備用。

1.3.2 柿蒂中熊果酸和齊墩果酸的提取過程及方法

參考劉仙俊等人[12]采用微波輔助乙醇溶劑提取方法。精確稱取2.00 g柿蒂粉分別置于250 mL的錐形瓶中，按照不同因素組成方案，加入相應(yīng)的乙醇體積分?jǐn)?shù)，然后放置柿蒂溶液到微波爐中，通過不同的微波條件進(jìn)行微波提取處理。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

（1）料液比的最佳條件分析。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時間90 s，微波功率300 W，設(shè)置料液比分別為 1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，根據(jù)結(jié)果分析，確定最佳料液比。

（2）乙醇體積分?jǐn)?shù)的最佳條件分析。固定提取時間90 s，微波功率300 W，料液比1∶20，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%，60%，70%，80%，90%，根據(jù)結(jié)果確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

（3）提取時間的最佳條件分析。固定料液比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，微波功率300 W，設(shè)置提取時間分別為30，60，90，120，150 s，根據(jù)結(jié)果確定最佳提取時間。

（4）微波功率的最佳條件分析。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶20，提取時間90 s，設(shè)置微波功率分別為100，200，300，400，500 W進(jìn)行微波處理，根據(jù)結(jié)果確定最佳微波功率。

1.3.4 正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)[9-10]，確定了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、微波功率最佳參數(shù)。為確定其4種因素對柿蒂中熊果酸和齊墩果酸提取量的綜合影響，采用L9（34）的正交設(shè)計(jì)，其中以熊果酸和齊墩果酸的提取含量為理化指標(biāo)。

1.4 柿蒂中熊果酸和齊墩果酸含量的測定

1.4.1 熊果酸和齊墩果酸提取物濃縮處理

經(jīng)微波處理樣品，用冰水迅速冷卻，然后將其轉(zhuǎn)移到水浴恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速150 r/min，振蕩時間40 min，水浴溫度24℃。振蕩結(jié)束后，將樣品快速轉(zhuǎn)移至50 mL的離心管中，用5 mL無水乙醇洗滌容器，洗滌3次，將提取物完全洗滌至離心管中。將每組柿蒂液轉(zhuǎn)移至離心管后離心，設(shè)定其溫度為室溫，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心10 min。離心上清液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾圓底燒瓶，溫度設(shè)置為43℃，轉(zhuǎn)速為75 r/min，蒸發(fā)干所有的乙醇，結(jié)束操作。

1.4.2 樣品的制備方式

熊果酸和齊墩果酸提取物濃縮處理后，蒸餾圓底燒瓶內(nèi)含有柿蒂的待測物質(zhì)，為了防止其放置時間過久，將其緊貼在瓶內(nèi)，即刻用10 mL甲醇（分析純）洗滌蒸餾圓底燒瓶，用手工用力搖晃，使其完全洗滌溶解，此過程進(jìn)行2次，最終將2次的洗滌液都即刻轉(zhuǎn)移到25 mL的容量瓶中，然后再定容至刻度線，充分搖勻，完全溶入即得到樣品溶液。

1.4.3 熊果酸和齊墩果酸兩種標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制方式

參照古力齊曼·阿布力孜等人[10]、用電子天平精確稱取熊果酸和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2.00 mg，然后將其放在100 mL的小燒杯，用甲醇（分析純）溶解，用玻璃棒徹底攪拌使其完全溶解，再用玻璃棒引流到10 mL容量瓶中，最后定容至刻度線，充分搖晃均勻后，備用。

1.4.4 熊果酸和齊墩果酸試樣的測定

（1） 參照王敏、任彥榮、陳軍、吳玲等人[13-16]的方法確定色譜條件。色譜柱為1PDA柱（Multi，6 μm，210 nm×4 nm），流速 1.5 mL/min，流動相為甲醇（色譜醇） ∶水∶醋酸=90∶10∶0.2，柱子溫度24℃，其中檢測波長為210 nm。

（2） 試樣的測定[17-18]。用有機(jī)微孔過濾膜過濾樣品液，然后再進(jìn)行取樣，用取樣器取適當(dāng)濾液，其中進(jìn)樣量為5 μL，在色譜條件下進(jìn)行柿蒂中熊果酸和齊墩果酸的含量測定。

1.4.5 樣品中2種有機(jī)酸的測定

（1） 測定方法。

式中：C——高效液相色譜法檢測到的熊果酸和齊墩果酸分別的濃度；

V——定容體積（25 mL）；

m——樣品質(zhì)量（2 g）。

2 結(jié)果與分析

采用DPS數(shù)學(xué)軟件V15.10進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對熊果酸和齊墩果酸總提取量的影響

探究料液比的最佳條件[19-20]，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時間90 s，微波功率300 W，設(shè)置料液比分別為 1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

料液比對熊果酸和齊墩果酸總提取量的影響見圖1。

從圖1可看出，從1∶5以5的階梯連續(xù)加到1∶20的料液比范圍內(nèi)，伴隨著料液比的遞增，熊果酸和齊墩果酸的總含量有微小的遞增趨勢，直到料液比為1∶20時，2種有機(jī)酸的總提取量達(dá)到最高，其含量為1.027 mg/g；隨著料液比的繼續(xù)增加，達(dá)到1∶25時，熊果酸和齊墩果酸的總含量開始呈下降趨勢，這大概是因?yàn)樾芄岷妄R墩果酸的提取已比較充分，繼續(xù)增加料液，含量沒有多大的變化，反而增加了濃縮時間，損失量相對也會增加。所以，過大的料液比會導(dǎo)致總提取量下降，因此最終選擇1∶20的料液比作為最佳料液比。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對熊果酸和齊墩果酸總提取量的影響

探究乙醇體積分?jǐn)?shù)的最佳條件[21]，固定提取時間90 s，微波功率300 W，料液比1∶20，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，60%，70%，80%，90%進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對熊果酸和齊墩果酸總提取量的影響見圖2。

從圖2可看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，2種有機(jī)酸的總提取量相對較低；乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到60%和70%時，總提取量呈顯著性增加趨勢；繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)到80%，總提取量幾乎達(dá)到了最高0.987 mg/g，但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時，熊果酸和齊墩果酸的總提取量卻開始呈略微下降趨勢，但是相差不大，沒有顯著性降低；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，增加了對2種有機(jī)酸的溶解力，所以具有相對較高的提取量。所以，最終選擇使提取量最高的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%作為最佳。

2.1.3 提取時間對熊果酸和齊墩果酸的總提取量的影響

探究提取時間的最佳條件[22]，固定料液比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，微波功率300 W，提取時間設(shè)置為30，60，90，120，150 s進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

提取時間對熊果酸和齊墩果酸的總提取量的影響見圖3。

從圖3可看出，提取時間為30 s時，已經(jīng)達(dá)到了相對較高的總提取量1.386 mg/g；當(dāng)微波提取時間增加到90 s，依然呈現(xiàn)下降趨勢，但是下降的勢頭不是很明顯。原因可能是由于隨著微波加熱時間過長，里面的一些其他黏度較高的物質(zhì)會慢慢析出來，附著在柿蒂表面，不容易被提取出來，所以隨著提取時間延長，熊果酸和齊墩果酸的總提取量開始降低。經(jīng)綜合考慮，選取微波提取時間30 s為最佳提取時間。

2.1.4 微波功率對熊果酸和齊墩果酸總提取量的影響

探究提取微波功率的最佳條件[23]，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶20，提取時間30 s，微波功率設(shè)置為100，200，300，400，500 W，然后依據(jù)上述條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

微波功率對熊果酸和齊墩果酸總提取量的影響見圖4。

從圖4可看出，微波功率為100～200 W時，總提取量呈略微上升趨勢；但是達(dá)到300 W時，最高總提取量為0.656 mg/g；隨著微波提取功率的增加，柿蒂中的熊果酸和齊墩果酸的總提取量略微下降。可見，微波功率過高，受熱容易分解，會破壞2種有機(jī)酸的總提取量。所以最終選擇微波提取功率300 W。

2.2 正交試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、微波功率都不同程度地影響著柿蒂中齊墩果酸和熊果酸總提取率。因此，每次用柿蒂粉2.000 0 g，對料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時間（C） 和微波功率（D） 4個主要因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。

熊果酸和齊墩果酸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，熊果酸和齊墩果酸總提取量的結(jié)果與分析見表2。

表1 熊果酸和齊墩果酸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 熊果酸和齊墩果酸總提取量的結(jié)果與分析

通過正交試驗(yàn)結(jié)果的分析，可以明顯地看到4個因素的極差結(jié)果，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、微波功率對極差值R分別是0.705，0.253，0.596和0.161，因此，這4個因素對熊果酸和齊墩果酸的提取量的影響順序依次為料液比＞提取時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波功率，即A＞C＞B＞D。由以上排序知道，料液比對熊果酸和齊墩果酸提取量的影響最大，其次是提取時間，料液比的影響不大，但是料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對2種有機(jī)酸提取量的影響相差較大，影響效果最小的是微波功率。所以，最佳組合為 A3B3C3D3，即料液比 1∶25，乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，提取時間90 s，微波功率400 W，用該試驗(yàn)指標(biāo)提取柿蒂中熊果酸和齊墩果酸的工藝提取，最終提取量為1.615 mg/g。

熊果酸和齊墩果酸總提取量的方差分析見表3。

表3 熊果酸和齊墩果酸總提取量的方差分析

由表3可以看到，料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時間（C），對2種有機(jī)酸的總提取量有很大的影響，其中F值能夠體現(xiàn)出這4個試驗(yàn)因素對于熊果酸和齊墩果酸的總提取量的影響，F(xiàn)值與影響大小成正比。其中，F(xiàn)（A）=187.622，F(xiàn)（B）=161.044，F(xiàn)（C）=152.102，由之前的極差值R可以得出，微波提取功率對于熊果酸和齊墩果酸總提取量的影響最小，幾乎可以不計(jì)。綜上所述，上述4個試驗(yàn)因素對于熊果酸和齊墩果酸的總提取含量的影響次序?yàn)榱弦罕龋咎崛r間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波功率。所以，根據(jù)這個試驗(yàn)與已經(jīng)存在的一些研究報道相比在醫(yī)藥方面具有一定的價值。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，柿蒂齊墩果酸和熊果酸總提取量分別為1.609，1.617，1.626 mg/g，平均值為1.617 mg/g，高于正交設(shè)計(jì)表中任一提取工藝的試驗(yàn)結(jié)果，說明通過正交試驗(yàn)得出的優(yōu)化條件穩(wěn)定、可靠[24]。與已有的研究報道相比，試驗(yàn)結(jié)果具有一定的應(yīng)用價值。

2.4 誤差分析

試驗(yàn)與之前報道過的柿蒂中熊果酸和齊墩果酸提取量有一定的差距，這可能與試驗(yàn)過程中的操作失誤有關(guān)，比如在制作樣品過程中，定容至10 mL，均使用無水乙醇，而沒有選擇單因素固定的乙醇體積分?jǐn)?shù)。還有可能是因?yàn)闃悠分谱魍瓿珊螅瑳]有立刻測量，中間相隔了幾天，導(dǎo)致測量出來的含量總體不高。

3 結(jié)論

采用微波法輔助提取柿蒂中熊果酸和齊墩果酸，首先是進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選擇4個因素的最佳水平，然后再進(jìn)行正交試驗(yàn)，最終優(yōu)化提取工藝，得到最佳組合為料液比1∶25，乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，提取時間90 s，微波功率300 W。通過該最佳組合進(jìn)行試驗(yàn)，最終得到熊果酸和齊墩果酸總提取量1.615 mg/g，有效實(shí)現(xiàn)了提取量最大化。