松梔丸HPLC指紋圖譜模式識(shí)別及大黃素含量測定

粟倩，胡玉珍，羅堃，夏伯候，張智敏，李亞梅，林艷

松梔丸HPLC指紋圖譜模式識(shí)別及大黃素含量測定

粟倩，胡玉珍，羅堃，夏伯候，張智敏，李亞梅，林艷

湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208

建立松梔丸HPLC指紋圖譜并測定主要差異性成分大黃素的含量，為松梔丸質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。采用HPLC對(duì)3批松梔丸共60個(gè)樣品進(jìn)行檢測，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2.0版）計(jì)算相似度，運(yùn)用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）對(duì)松梔丸進(jìn)行模式識(shí)別，尋找差異性成分，并對(duì)其含量進(jìn)行測定。建立了松梔丸的指紋圖譜，標(biāo)定了17個(gè)共有峰。3批樣本的相似度為0.898～0.971。通過PCA和OPLS-DA基本能區(qū)分不同批次松梔丸，確定大黃素為松梔丸的主要差異性成分。3批松梔丸中大黃素含量分別為0.013 5～0.017 1 mg/g、0.036 7～0.043 6 mg/g、0.022 1～0.031 0 mg/g。HPLC圖譜結(jié)合PCA和OPLS-DA可快速評(píng)價(jià)松梔丸的質(zhì)量，為松梔丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

松梔丸；指紋圖譜；大黃素；模式識(shí)別

松梔丸由茯苓、梔子根、穿破石、崗梅、地骨皮、太子參、砂仁、丹參等藥加水蒸煮、濃縮、以水泛丸、干燥而成，具有清熱利濕、健脾益氣功效，主治慢性丙型肝炎[1]。松梔丸可有效改善慢性丙型肝炎患者臨床癥狀、體征和肝功能，降低丙型肝炎病毒RNA定量，從而減輕肝臟損傷，尤其在改善肝功能及停藥后的反跳率方面有優(yōu)勢[2]。松梔丸處方來源于湖南湘西侗族蒙氏家族祖?zhèn)髅胤剑?007年獲國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為中藥第三類新藥[3]。目前尚未見松梔丸指紋圖譜和差異性化學(xué)成分的研究，無法對(duì)松梔丸的質(zhì)量進(jìn)行全面控制。

中藥指紋圖譜具有綜合、宏觀、非線性的特點(diǎn)，可對(duì)中藥成分進(jìn)行全面的分離及測定，反映中藥的整體質(zhì)量信息。通過指紋圖譜特征相似程度的比較，可用于中藥真?zhèn)舞b別、質(zhì)量評(píng)價(jià)、考察穩(wěn)定性和一致性[4-5]。運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA），可降低多元數(shù)據(jù)的維數(shù)，并根據(jù)數(shù)據(jù)中固有模式對(duì)項(xiàng)目進(jìn)行分類[6]。因此，本試驗(yàn)采用PCA、OPLS-DA對(duì)松梔丸HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析，比較樣品制備的差異性，為松梔丸的全面質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)（包括Empower工作站、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測器），美國Waters公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BP211D分析電子天平（十萬分之一），美國Sartorius公司。

大黃素對(duì)照品（批號(hào)wkq18041909，純度≥98%），四川省維克奇生物科技有限公司；3批松梔丸共60個(gè)樣品（批號(hào)20160101、20160102、20160201，編號(hào)分別為S1～S20、S21～S40、S41～S60），泰凌醫(yī)藥有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，德國Merck公司；冰醋酸為色譜純，天津市化學(xué)試劑研究所；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取大黃素對(duì)照品，加甲醇溶解，制成每1 mL含0.06 mg的溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 供試品溶液制備

取本品粉末（過5號(hào)篩）1.0 g，置50 mL錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18（12）柱（250 mm×4.6 mm）；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min；流動(dòng)相：乙腈（A）-1%醋酸水溶液（B）；梯度洗脫程序：0～30 min，2%～25%A；30～40 min，25%～40%A；40～45 min，40%～70%A；45～55 min，100%A；55～60 min，100%A。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密稱取大黃素對(duì)照品0.6 mg，加甲醇制成0.06 mg/mL對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，測定大黃素峰面積積分值，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程＝22 763－35 182，＝0.999 7，表明大黃素在6～60 ng范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

取同一批松梔丸（批號(hào)20160101），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批松梔丸（批號(hào)20160101），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批松梔丸（批號(hào)20160101），按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取60個(gè)松梔丸樣品，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1。選取峰面積較大的17個(gè)峰作為樣品共有峰，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)后，指認(rèn)13號(hào)峰為大黃素。將結(jié)果導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2.0版），確定共有峰，生成對(duì)照?qǐng)D譜并進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見圖2、表1。60個(gè)松梔丸樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為0.898～0.971，表明各批次松梔丸的化學(xué)成分組成基本一致，質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，但不同批次樣品色譜峰的峰面積有差異，說明其化學(xué)成分含量存在一定差異。

圖1 60個(gè)松梔丸樣品HPLC指紋圖譜

圖2 松梔丸樣品HPLC對(duì)照?qǐng)D譜

表1 60個(gè)松梔丸樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

編號(hào)相似度 編號(hào)相似度 編號(hào)相似度 S10.933 S210.963 S410.939 S20.924 S220.970 S420.965 S30.927 S230.966 S430.968 S40.927 S240.964 S440.958 S50.920 S250.970 S450.970 S60.912 S260.956 S460.966 S70.944 S270.958 S470.970 S80.944 S280.965 S480.966 S90.931 S290.962 S490.969 S100.924 S300.961 S500.966 S110.941 S310.960 S510.967 S120.937 S320.966 S520.964 S130.925 S330.966 S530.957 S140.900 S340.963 S540.947 S150.898 S350.971 S550.953 S160.898 S360.955 S560.960 S170.909 S370.915 S570.905 S180.952 S380.905 S580.948 S190.948 S390.959 S590.949 S200.931 S400.915 S600.917

2.6 化學(xué)模式識(shí)別

2.6.1 主成分分析

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件，以松梔丸色譜圖中的17個(gè)共有峰積分面積為變量對(duì)樣品進(jìn)行分析。前3個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率分別為41.14%、26.25%和15.74%，累積方差貢獻(xiàn)率為83.12%（見表2），因此提取前3個(gè)主成分對(duì)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。不同批次松梔丸在PCA得分圖上分為3類，批號(hào)20160101（S1～S20）的松梔丸為1類，且分布較集中，與其余2批明顯分開，批號(hào)為20160102（S21～S40）的松梔丸為1類，分布集中；批號(hào)為20160201（S41～S60）的松梔丸為1類，分布較分散。批號(hào)為20160102（S21～S40）和批號(hào)為20160201（S41～S60）的2批松梔丸有分開趨勢，但界限不明顯，二者稍有重疊，PCA不能將這2批松梔丸明顯分開，因此需進(jìn)一步采用OPLS-DA對(duì)樣品進(jìn)行區(qū)分。

表2 松梔丸HPLC指紋圖譜共有峰主成分載荷

峰號(hào)PC1PC2PC3PC4PC5PC6 10.185 20.082 30.451 50.211 9-0.250 6-0.318 2 20.133 30.257 90.294 80.083 10.608 5-0.010 7 30.094 10.072 50.544 00.086 90.194 9-0.323 2 40.256 20.230 30.042 80.459 6-0.003 50.320 1 50.045 10.064 70.487 60.260 6-0.223 60.722 7 60.213 20.318 20.071 80.195 30.273 30.189 8 70.318 20.195 70.091 80.170 2-0.154 0-0.139 2 80.339 40.142 30.104 20.065 6-0.230 8-0.044 1 90.077 60.394 90.111 10.045 0-0.471 4-0.178 0 100.239 80.272 30.247 20.034 2-0.236 2-0.055 8 110.162 20.318 70.036 60.469 8-0.081 00.125 2 120.159 60.265 00.152 80.595 70.182 1-0.177 9 130.285 40.273 10.164 00.057 10.090 80.116 5 140.308 90.258 60.094 80.040 10.023 30.056 5 150.332 50.220 90.037 80.023 70.004 50.063 9 160.338 60.206 80.036 50.029 60.012 20.035 6 170.303 60.263 60.111 70.070 80.021 20.088 5 貢獻(xiàn)率0.411 40.262 50.157 40.057 50.042 40.023 8 累積貢獻(xiàn)率0.411 40.673 90.831 20.888 80.931 20.955 0

圖3 3批松梔丸樣品PCA得分圖

2.6.2 正交偏最小二乘-判別分析

運(yùn)用OPLS-DA建立不同批次松梔丸HPLC指紋圖譜差異模型。模型R2Y＝0.97，表明模型的擬合度較好；Q2Y＝0.96，表明模型的預(yù)測能力較強(qiáng)，反映3組樣本具有明確分離的趨勢。該方法能很好地將不同批次的松梔丸樣品分為3類，結(jié)果見圖4。可以看出，3批樣品明顯分布在得分圖不同的區(qū)域，其中批號(hào)為20160102（S21～S40）松梔丸分布最集中，位于得分圖左上角，批號(hào)為20160101（S1～S20）松梔丸分布較集中，位于得分圖的右側(cè)，批號(hào)為20160201（S41～S60）松梔丸分布較分散，位于得分圖的左下角。表明不同批次的松梔丸在化學(xué)成分上存在一定差異，且有趨勢性。對(duì)建立的模型進(jìn)行20次置換檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，R2＝0.049，Q2＝-0.406，表明模型可靠。

圖4 3批松梔丸樣品OPLS-DA得分圖

提取OPLS-DA模型中17個(gè)變量的變量重要性投影（VIP），對(duì)17個(gè)共有峰峰面積VIP值進(jìn)行排序，結(jié)果見圖5。根據(jù)VIP圖可以看出，13號(hào)峰（VIP＝1.242 4）、17號(hào)峰（VIP＝1.205 2）、14號(hào)峰（VIP＝1.183 8）、3號(hào)峰（VIP＝1.155 8）、15號(hào)峰（VIP＝1.150 9）、16號(hào)峰（VIP＝1.150 6）、10號(hào)峰（VIP＝1.136 7）、4號(hào)峰（VIP＝1.115 1）、5號(hào)峰（VIP＝1.057 7）對(duì)松梔丸有顯著影響，這些成分是引起不同批次松梔丸成分差異的主要標(biāo)志性成分，其中13號(hào)峰為大黃素。

圖5 3批松梔丸樣品OPLS-DA差異標(biāo)志物VIP圖

2.7 大黃素含量測定

按3批松梔丸共60個(gè)樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中大黃素的含量，結(jié)果見表3。3批松梔丸樣品的大黃素含量范圍分別為0.013 5～0.017 1 mg/g（批號(hào)20160101）、0.036 7～0.043 6 mg/g（批號(hào)20160102）、0.022 1～0.031 0 mg/g（批號(hào)20160201），3批松梔丸樣品的大黃素含量有明顯差異（＜0.01）?？梢?，不同批次樣品的大黃素含量不同，據(jù)此可以區(qū)分不同批次的松梔丸樣品。大黃素含量測定結(jié)果與指紋圖譜模式識(shí)別結(jié)果一致，兩者可相互驗(yàn)證。

表3 松梔丸樣品中大黃素含量測定結(jié)果（mg/g）

編號(hào)含量 編號(hào)含量 編號(hào)含量 S10.014 5 S210.037 7 S410.023 2 S20.014 4 S220.038 2 S420.023 4 S30.015 1 S230.040 2 S430.023 3 S40.015 2 S240.038 7 S440.026 1 S50.013 6 S250.038 8 S450.023 1 S60.015 5 S260.040 2 S460.023 6 S70.016 0 S270.042 0 S470.025 0 S80.015 6 S280.039 7 S480.022 4 S90.016 0 S290.038 0 S490.023 2 S100.016 2 S300.036 7 S500.022 1 S110.017 1 S310.037 7 S510.023 5 S120.015 8 S320.043 2 S520.025 0 S130.015 3 S330.041 7 S530.024 2 S140.015 0 S340.042 4 S540.024 0 S150.014 8 S350.043 6 S550.024 4 S160.015 1 S360.041 1 S560.023 0 S170.014 8 S370.039 0 S570.031 0 S180.013 9 S380.042 7 S580.027 8 S190.013 5 S390.040 7 S590.029 0 S200.014 0 S400.040 5 S600.027 8

3 討論

為提高松梔丸的質(zhì)量控制水平，本研究采用HPLC建立松梔丸的指紋圖譜，共標(biāo)定17個(gè)共有峰，對(duì)其中大黃素進(jìn)行了含量測定，結(jié)果表明不同批次的松梔丸樣品大黃素含量差異較大。為比較不同批次樣品之間差異，采用無監(jiān)督模式識(shí)別PCA和有監(jiān)督模式識(shí)別OPLS-DA，結(jié)果顯示不同批次樣品間有差異，3個(gè)批次樣品有明顯分開趨勢，同一批次樣品間差異較小，每一批次的樣品都有集中趨勢。批號(hào)20160102（S21～S40）與批號(hào)20160201（S41～S60）樣品雖明顯分為2個(gè)區(qū)域，但距離相對(duì)較近，批號(hào)20160101（S1～S20）分布的區(qū)域距離另2批樣品的區(qū)域相對(duì)較遠(yuǎn)，表明此批號(hào)樣品制備工藝與其他2批差異較大，而批號(hào)20160102（S21～S40）與批號(hào)20160201（S41～S60）的制備工藝較為接近。本研究建立的松梔丸指紋圖譜共有模式較為理想，結(jié)合模式識(shí)別方法對(duì)不同批次松梔丸樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，可為松梔丸質(zhì)量的全面控制提供參考。

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Pattern Identification of Fingerprint ofPills and Determination of Emodin by HPLC

SU Qian, HU Yuzhen, LUO Kun, XIA Bohou, ZHANG Zhimin, LI Yamei, LIN Yan

To establish an HPLC fingerprint ofPills and determine the content of the main difference component (emodin); To provide the basis for the quality evaluation ofPills.HPLC was used to detect 3 batches (a total of 60 samples) ofPills. Similarity analysis was counted through TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System (V2.0). Principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discrimination analysis (OPLS-DA) were used to evaluate, find the difference components and detect their contents.The fingerprint ofPills was established. 17 common peaks were obtained with similarities between 0.898 and 0.971. PCA and OPLS-DA could basically separate different batches ofPills, and emodin was determined as the main different chemical component ofPills. The contents of emodin in the three batches ofPills were 0.013 5–0.017 1 mg/g, 0.036 7–0.043 6 mg/g, 0.022 1– 0.031 0 mg/g, respectively.The HPLC fingerprint combined with PCA and OPLS-DA methods can quickly evaluate the quality ofPills, providing references for quality control ofPills.

Pills; fingerprint; emodin; pattern identification

R284.1

A

1005-5304(2020)05-0070-05

10.3969/j.issn.1005-5304.201903365

林艷，E-mail：linyan198210@163.com

（2019-03-27）

（2019-04-29；編輯：陳靜）