升清降濁膠囊含藥血清對高糖誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細胞增殖與凋亡影響的實驗研究

謝彧軒，羅 昕，楊小雙，楊 慧，童安榮

慢性腎衰竭(CRF)是指各種慢性腎臟病(CDK)引起的腎小球濾過率(GFR) 嚴重下降及與此相關(guān)的代謝紊亂和全身各系統(tǒng)受累為主要表現(xiàn)的臨床綜合征[1]。根據(jù)相關(guān)調(diào)查顯示，在我國慢性腎小球腎炎(31.23%)、糖尿病腎病(20.79%)、高血壓腎病(12.63%)是罹患CRF的前三位病因[2]。本次實驗從糖尿病腎病入手，以高糖環(huán)境誘導(dǎo)腎小球系膜細胞增殖。糖尿病持續(xù)的細胞外高糖以及高糖介導(dǎo)的各種病理因素可以直接激活腎小球系膜細胞(MC)，活化的MC可發(fā)生明顯的表型轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)增生、轉(zhuǎn)分化、釋放炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(ECM) 合成的增多和降解的減少，纖維連接蛋白(FN) 在系膜區(qū)的過度沉積等病理過程，進而形成惡性循環(huán)，使腎小球的損傷加劇，發(fā)生腎纖維化及腎小球硬化，最終導(dǎo)致了終末期腎衰竭(ESRD)[3-4]。此次實驗是觀察升清降濁膠囊含藥血清的加入，對高糖環(huán)境下系膜細胞的生長狀態(tài)有何影響，進一步研究該藥物防治慢性腎衰竭的機制。

1 資料與方法

1.1 一般材料：選用大鼠腎小球系膜細胞為上海名勁生物科技有限公司出品，官網(wǎng)貨號：CM-2055。SD大鼠40只，重量(220±20)g，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑與藥物：升清降濁膠囊購自寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院；澳洲胎牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國invitrogen生命技術(shù)有限公司；青鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒均購自杭州聯(lián)科技術(shù)股份有限公司。25 cm2透氣蓋培養(yǎng)瓶和6孔、96孔培養(yǎng)板購自美國corning公司。

1.3 主要儀器設(shè)備：單人單面凈化工作臺(中國蘇州凈化設(shè)備公司)；恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡CKX3(日本奧林巴斯公司)；電熱恒溫水溫箱(北京長源實驗設(shè)備廠，HH.W21 600-C)；湘儀TDZ5-WS多管架自動平衡離心機(長沙湘儀公司)；高壓滅菌鍋(日本TOMY公司，TOMY-SX-300)。

1.4 實驗方法

1.4.1 升清降濁膠囊含藥血清的制備：將雄性SD大鼠40只，隨機分為低糖空白血清組、高糖模型組、升清降濁膠囊高劑量組、升清降濁膠囊中劑量組、升清降濁膠囊低劑量組，每組8只。灌喂劑量的計算按人與大鼠間體表面積折算等效劑量。連續(xù)灌喂3 d，每天早晚各1次。第3天灌喂后1 h，無菌條件下腹主動脈取血，室溫下放置4 h，將血液置于離心機中，以3 000 r/min離心15 min后取出；將血清吸出，置于56 ℃水浴箱中水浴30 min滅活抗體，然后在單人凈化工作臺上通過直徑0.22 μm的濾器過濾除菌；無菌條件下裝入離心管，放置-80 ℃冰箱備用。

1.4.2 細胞培養(yǎng)：將MC細胞株接種于完全培養(yǎng)基之中。完全培養(yǎng)基的成分為：10%胎牛血清，1%青鏈霉素以及89%的DMED培養(yǎng)基。用25 cm2的培養(yǎng)瓶盛放培養(yǎng)細胞，并將其置于37 ℃、二氧化碳濃度5%的培養(yǎng)箱中。觀察細胞生長狀態(tài)，在細胞生長良好，呈指數(shù)增長時方可進行實驗。

1.4.3 實驗分組與給藥：實驗分為5組，即低糖空白血清組，高糖模型組，升清降濁膠囊高、中、低劑量組。低糖空白組以大鼠空白血清加含糖量為10 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，高糖模型組用含糖量為30 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基所配制的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。再分別向其他3組高糖完全培養(yǎng)基中加入10%的高、中、低3種濃度的升清降濁膠囊含藥血清干預(yù)細胞。

1.4.4 藥物對MC增殖抑制的檢測：將完成分組的細胞懸液接種到96孔板中，每組6個復(fù)孔，每孔100 μl。將培養(yǎng)板放入37 ℃、5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。之后向每孔加入10 μl CCK-8溶液，再次將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。細胞增殖抑制率=(1-藥物組吸光度) /對照組孔吸光度×100%。

1.4.5 Annexin-VFIC/PI復(fù)染流式檢測細胞凋亡率：將復(fù)蘇后的細胞吹打成細胞懸液，再將細胞懸液均勻地接種在6孔板中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日細胞貼壁后將培養(yǎng)基換成上述含不同濃度升清降濁膠囊含藥血清的培養(yǎng)基，以及低糖空白組、高糖模型組的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，細胞狀態(tài)良好時，用含EDTA的胰蛋白酶消化吸收細胞。以1 000 r/min,離心5 min，吸去上清液，將1×Buffer液加入無菌雙蒸水稀釋為5×Buffer液，每組加入200 μl吹打細胞。避光加入5 μl FITC和10 μl PI，避光放置15 min，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾后上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 升清降濁膠囊對系膜細胞增殖的抑制作用：高糖模型組的OD值及抑制率遠小于低糖空白血清組，提示高糖環(huán)境可顯著刺激細胞增殖。低糖空白血清組同升清降濁膠囊高劑量組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而升清降濁膠囊中劑量和高劑量與低糖空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明高糖環(huán)境可誘導(dǎo)系膜細胞增殖，而升清降濁膠囊對系膜細胞增殖的抑制效果隨濃度的升高而升高,見表1。

表1 處理48 h后大鼠腎小球系膜細胞增殖情況

2.2 升清降濁膠囊誘導(dǎo)系膜細胞凋亡的效果：在流式細胞散點圖上(圖1-圖4，目錄后)，第一象限、第二象限、第三象限、第四象限，分別表示活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞、壞死細胞。細胞總凋亡率為細胞早期凋亡率與晚期凋亡率之和。結(jié)果表明，低糖空白組與高糖模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但是低糖空白組的凋亡趨勢更明顯一些。加入升清降濁膠囊含藥血清后，細胞的凋亡率相比高糖模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明該藥物的加入有助于誘導(dǎo)細胞凋亡,見表2。

表2 處理48 h 后大鼠腎小球系膜細胞凋亡情況

注：*與高糖模型組比較，P>0.05;#與高糖模型組比較，P<0.05。

3 討論

腎小球系膜細胞是腎臟最重要的固有細胞之一，能夠維持腎小球系膜區(qū)細胞外基質(zhì)的代謝平衡[5]。根據(jù)相關(guān)資料顯示，MC是腎小球內(nèi)具有活躍功能的固有細胞，同時也是被深入研究的對象。MC能產(chǎn)生多種細胞因子與炎性介質(zhì)，還能分泌基質(zhì)降解酶物質(zhì)，這些都會參與和加重腎小球病變及損傷。各種刺激均易引起其增生，是構(gòu)成腎小球疾病的最主要病變原因。MC的過度增殖，一方面突入腎小球毛細血管腔，導(dǎo)致管腔狹窄或閉塞；另一方面又會造成ECM的大量產(chǎn)生和聚集[6]。ECM在腎小球內(nèi)的大量堆積，又是導(dǎo)致腎小球硬化和功能損害的主要機制。而腎小球硬化是各種慢性腎臟疾病進入慢性腎功能衰竭的共同途徑[7]。因此，倘若能有效抑制MC的過度增殖，阻止ECM的產(chǎn)生和聚集，則可以有效減輕腎小球功能的損傷，阻止腎小球硬化的發(fā)展，進一步保護腎功能，及早防止慢性腎衰的發(fā)生和發(fā)展。

傳統(tǒng)中醫(yī)典籍中沒有“慢性腎衰竭”這一病名的記載，但是根據(jù)該病的臨床表現(xiàn)可將其歸入祖國醫(yī)學的“水腫”“關(guān)格”等范疇。為了更好地防治CRF，導(dǎo)師童安榮主任醫(yī)師自擬了“升清降濁膠囊”，其組方為：柴胡，黃芩，黨參，黃芪，枳殼，生地，山茱萸，山藥，茯苓，葛根，遠志，石菖蒲，丹參，當歸，蟬蛻，僵蠶，大黃。查閱相關(guān)資料可知[8-9]，該方中多數(shù)藥物經(jīng)過大量的實驗研究已經(jīng)證實可有效抑MC的過度增殖。根據(jù)本次實驗結(jié)果，升清降濁膠囊含藥血清可有效抑制MC增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，且藥物濃度越高則效果越突出。由此可知，升清降濁膠囊抑制MC增殖，阻止ECM的產(chǎn)生和沉積，是防止腎小球硬化，防止慢性腎衰發(fā)生發(fā)展、保護腎功能的重要環(huán)節(jié)。