鱘魚(yú)肝酶解條件優(yōu)化及酶解液對(duì)雙歧桿菌增殖效果的研究

王靖麟，王世博，徐 睿，李平蘭，武瑞赟

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100176）

隨著生活水平的提高，人們對(duì)健康的關(guān)注度逐漸提高，益生菌受到了廣泛的關(guān)注，其中雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）是一種厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌屬[1]，菌體不運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞呈桿狀、一端有時(shí)呈分叉狀[2]，是最早的定植于母乳喂養(yǎng)健康新生兒腸道中的益生菌，廣泛存在于人和動(dòng)物的消化道、口腔等環(huán)境中，具有維護(hù)腸道菌群平衡、改善乳糖不耐癥、抑制病原菌、提高免疫、改善人體精神狀態(tài)等功效[3-6]。雙歧桿菌特殊的生長(zhǎng)條件和高營(yíng)養(yǎng)要求使得雙歧桿菌的生長(zhǎng)較為緩慢，國(guó)內(nèi)外大量的研究主要集中在尋找能夠促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)繁殖的物質(zhì)，即促生長(zhǎng)因子。促生長(zhǎng)因子（bifidus factor，BF）是指可以促進(jìn)微生物生長(zhǎng)繁殖的一大類天然及合成物質(zhì)。常見(jiàn)的促生長(zhǎng)因子有寡聚糖類、多糖類（如云芝多糖水提物）、短鏈脂肪酸類物質(zhì)，天然植物及中草藥的提取物、蛋白及其水解產(chǎn)物（肽類）等[7-14]。其中已經(jīng)證實(shí)的肽類促生長(zhǎng)因子包括酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶作用產(chǎn)物；富含核蛋白的動(dòng)物組織，如一些陸生和水生動(dòng)物的胰臟、肝臟經(jīng)植物蛋白酶處理后的產(chǎn)物，且上述肽類雙歧因子具有廣泛的促生長(zhǎng)效應(yīng)，對(duì)多種雙歧均有促生長(zhǎng)作用[15-19]。目前肽類雙歧因子促生長(zhǎng)機(jī)理尚不明確。

我國(guó)鱘魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)日漸擴(kuò)大[20]，鱘魚(yú)加工量也在迅速增長(zhǎng)。然而鱘魚(yú)體型較大，加工過(guò)程中產(chǎn)生大量的內(nèi)臟、魚(yú)皮、魚(yú)骨等下腳料，占總質(zhì)量的50%以上，直接丟棄容易造成資源浪費(fèi)和環(huán)境的污染。其中鱘魚(yú)肝臟營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，富含維生素E、維生素A、維生素D和鐵等礦物質(zhì)元素以及蛋白質(zhì)。有學(xué)者以鱘魚(yú)肝為原料提取出了蛋白磷酸酶2A，這是酶抑制法檢測(cè)微囊藻毒素所使用的主要蛋白酶[21]。也有學(xué)者測(cè)定了鱘魚(yú)肝中脂溶性維生素A、D、E、K含量，發(fā)現(xiàn)鱘魚(yú)肝中維生素E含量較高[22]。以上研究為鱘魚(yú)肝的綜合利用提供了參考。研究發(fā)現(xiàn)，鱘魚(yú)肝中含有金屬硫蛋白（metallothionein，MT），其主要參與微量元素的儲(chǔ)存、運(yùn)輸和代謝[23-27]，由于金屬硫蛋白富含半胱氨酸，可為二硫鍵的合成提供原料，而含硫的肽以及二硫鍵對(duì)雙歧桿菌的生長(zhǎng)促進(jìn)活性密切相關(guān)[28]，這為其開(kāi)發(fā)肽類雙歧因子提供了可能性。因此，利用鱘魚(yú)肝制備生物活性肽有利于最大限度地利用水產(chǎn)資源，蛋白酶解后得到的肽類物質(zhì)也具有作為雙歧桿菌促生長(zhǎng)因子的開(kāi)發(fā)潛力。

本研究以鱘魚(yú)肝為原料，通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化法確定出最佳酶解條件，以6種雙歧桿菌為模式菌株，考察酶解產(chǎn)物對(duì)雙歧桿菌的促生長(zhǎng)效果，研究結(jié)果可為多肽類雙歧桿菌促生長(zhǎng)物質(zhì)的開(kāi)發(fā)以及為水產(chǎn)品加工過(guò)程中下腳料的綜合利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱘魚(yú)肝：取自西伯利亞鱘-史氏鱘雜交種；青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌：本實(shí)驗(yàn)室分離保藏；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：艾萬(wàn)拓股份有限公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）：上海源葉生物科技有限公司；二奎啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量試劑盒：碧云天生物有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）、四硼酸鈉：北京化工廠；L-亮氨酸、堿性蛋白酶（200 000 U/g）：北京酷來(lái)搏科技有限公司；中性蛋白酶（60 000 U/g）、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶科技有限公司；木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；胃蛋白酶（400 000 U/g）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；胰蛋白酶（250 000 U/g）：寶如億（北京）生物技術(shù)有限公司；半胱氨酸鹽酸鹽、MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博興生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9102型恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-20M型臺(tái)式高速離心機(jī)、TG16W型微量高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；FA1004型電子分析天平：上海天平儀器廠；WH-3型微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠；SCL-1300型垂直流潔凈工作臺(tái)：北京賽伯樂(lè)試驗(yàn)儀器有限公司；EF28型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SPX-250B-Z型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；722S紫外分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱘魚(yú)肝蛋白酶解液的制備

鱘魚(yú)肝→切塊→脫脂→瀝干→攪碎→加水勻漿→調(diào)節(jié)體系pH值→恒溫酶解→沸水浴滅酶（100 ℃、10 min）→冷卻→離心（8 000 r/min、10 min）→取上清液→酶解液

1.3.2 水解度測(cè)定

參照羅艷華等[29-30]對(duì)蛋白水解度測(cè)定方法中OPA法測(cè)定水解度。

1.3.3 蛋白酶種類篩選

使用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶分別對(duì)相同量的魚(yú)肝進(jìn)行單酶酶解，并根據(jù)各蛋白酶使用說(shuō)明，分別在其最適pH和溫度條件下添加相同量的酶，并以相同的料液比酶解相同時(shí)間，酶解后進(jìn)行高溫滅酶，測(cè)定水解度?？疾旄鞯鞍酌笇?duì)鱘魚(yú)肝蛋白水解度的影響，具體酶解條件如表1所示。

1.3.4 鱘魚(yú)肝酶解條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

選取水解度較高組使用的蛋白酶，設(shè)計(jì)5因素5水平單因素試驗(yàn)，分別考察酶解時(shí)間（4 h、5 h、6 h、7 h、8 h）、酶解初始pH值（7、8、9、10、11）、酶解溫度（37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL））與酶添加量（2 000 U/g、4 000 U/g、6 000 U/g、8 000 U/g、10 000 U/g）對(duì)鱘魚(yú)肝蛋白水解度的影響。

1.3.5 Plackett-Burman試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，參考PLACKETT R L等[31]試驗(yàn)方法，分別在試驗(yàn)因素的最大響應(yīng)區(qū)間中選擇高低兩水平，使用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)，具體方案如表2所示。

1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的貢獻(xiàn)率大小得到的3個(gè)顯著因素及效應(yīng)值來(lái)設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)的變化方向和步長(zhǎng)[32]。在所選擇的顯著因素中，若效應(yīng)值為正，則變化方向?yàn)樵黾?；若效?yīng)值為負(fù)，則變化方向?yàn)闇p少；效應(yīng)值絕對(duì)值越大，變化步長(zhǎng)應(yīng)越小，反之應(yīng)越大。最陡爬坡試驗(yàn)具體設(shè)計(jì)方案如表3所示。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Design of the steepest ascent tests

1.3.7 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

以最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果中的拐點(diǎn)作為中心點(diǎn)，由Plackett-Burman試驗(yàn)中篩選出的顯著影響因素為試驗(yàn)因素，并以水解度（Y）為響應(yīng)值，通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。具體方案如表4所示。對(duì)水解度值進(jìn)行二次多元回歸方程擬合，得到各因素與水解度響應(yīng)值之間的二次多元回歸方程，根據(jù)此方程確定最優(yōu)解，得到最優(yōu)酶解條件。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 4 Factors and levels of Box-Behnken tests

1.3.8 回歸模型驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面模型優(yōu)化得到的最佳酶解條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，比較模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值，驗(yàn)證模型的正確、有效性。

1.3.9 鱘魚(yú)肝酶解產(chǎn)物對(duì)雙歧桿菌體外生長(zhǎng)的影響

鱘魚(yú)肝酶解液凍干粉的制備：鱘魚(yú)肝→切塊→脫脂→瀝干→攪碎→加水調(diào)節(jié)料液比為1∶10（g∶mL），調(diào)節(jié)體系pH值為10.04，酶添加量5.27%→恒溫45 ℃酶解8.6h→沸水浴滅酶（100 ℃，10 min）→酶解液→冷卻→離心（8 000 r/min、10 min）→取上清液→微濾→40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→冷凍干燥48 h→鱘魚(yú)肝酶解液凍干粉。

在無(wú)菌無(wú)氧操作條件下，取雙歧桿菌凍干粉，用MRS肉湯培養(yǎng)基溶解，于（37±1）℃厭氧培養(yǎng)48 h，然后以3%的接種量連續(xù)傳代培養(yǎng)活化。活化后，傳代3代以上進(jìn)行試驗(yàn)。

在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的鱘魚(yú)肝酶解液凍干粉配制出不同質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基（不添加、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL），調(diào)節(jié)pH值為7.6左右充氮、滅菌；每種菌以3%的接種量分別接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，分別于（37±1）℃厭氧靜置培養(yǎng)，24 h后取出發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel2016、SPSS 25.0進(jìn)行方差分析、繪制統(tǒng)計(jì)圖表；Design-Expert 8.0.6進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)與Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。各處理組間的差異比較選擇TukeyHSD法，P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類篩選試驗(yàn)結(jié)果

蛋白酶的種類不同，其作用位點(diǎn)、方式及其所結(jié)合的底物特性將不同，從而酶解效果不同。由圖1可知，各蛋白酶對(duì)鱘魚(yú)肝的酶解能力不同，堿性蛋白酶酶解鱘魚(yú)肝的水解度最高，為40.44%，酶解效果顯著優(yōu)于其他酶。因此，選用堿性蛋白酶作為目標(biāo)酶，進(jìn)行后續(xù)酶解條件參數(shù)優(yōu)化。

圖1 不同種類蛋白酶對(duì)鱘魚(yú)肝蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of different protease types on the hydrolysis degree of sturgeon liver protein

2.2 鱘魚(yú)肝酶解條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2（a）可知，蛋白水解度隨著酶解溫度的升高呈先增加后減少的趨勢(shì)；酶解溫度在37～50 ℃范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的升高，蛋白水解度增加；酶解溫度為50 ℃時(shí)，蛋白水解度最高，為46.62%，繼續(xù)升高酶解溫度至55 ℃，蛋白水解度未進(jìn)一步提升?？赡苁且?yàn)槊附鉁囟鹊兔复呋实?；而酶解溫度過(guò)高時(shí)酶的活性結(jié)構(gòu)破壞，酶活力下降。因此，選擇最適酶解溫度為50 ℃。

由圖2（b）可知，蛋白水解度隨著酶添加量的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；酶添加量為1%～3%（2 000～6 000 U/g）范圍增加時(shí)，水解度升高速度較快；酶添加量為4%時(shí)（8 000 U/g），蛋白水解度最高，為53.76%，繼續(xù)增加酶添加量對(duì)蛋白水解度無(wú)進(jìn)一步提升作用。出現(xiàn)此現(xiàn)象原因可能是相同時(shí)間下蛋白酶添加至一定量時(shí)，蛋白已基本被酶作用完，所以繼續(xù)增加酶的用量酶解效果提升不顯著。因此，選擇最佳酶添加量為4%（8 000 U/g）。

圖2 各因素對(duì)鱘魚(yú)肝蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of various factors on the hydrolysis degree of sturgeon liver protein

由圖2（c）可知，不同料液比各處理組間蛋白水解度無(wú)顯著差異（P＞0.05），原因可能是因?yàn)閷?shí)際試驗(yàn)過(guò)程為邊振蕩邊酶解，振蕩作用促進(jìn)了酶在體系中的分散、均勻分布，并及時(shí)將蛋白表面已水解的肽分散使得酶時(shí)刻與底物充分接觸，同時(shí)克服了因料液比提高時(shí)體系黏度增大而使蛋白酶分散不均，因此減小了不同處理組間的差異。

由圖2（d）可知，蛋白質(zhì)水解度隨著酶解時(shí)間的增加呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；酶解時(shí)間為7 h時(shí)，蛋白水解度最高，為61.71%，進(jìn)一步提升時(shí)間，水解度未顯著提升（P＞0.05），說(shuō)明7 h左右時(shí)酶解反應(yīng)已基本結(jié)束。因此選擇7 h為最佳酶解時(shí)間。

由圖2（e）可知，魚(yú)肝蛋白質(zhì)水解度隨初始pH值的提升呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)；當(dāng)體系的初始pH值在7～9范圍內(nèi)逐漸升高時(shí)，鱘魚(yú)肝蛋白的水解度呈上升趨勢(shì)，體系初始pH為9時(shí)，水解度最高，為66.61%，繼續(xù)提升pH，酶解效果變差，水解度下降。出現(xiàn)這一變化的原因是酶發(fā)揮催化作用存在一最適pH，此pH下酶活性最高，催化蛋白水解效果最優(yōu)，偏離最優(yōu)pH值之后，蛋白酶活性下降，催化效果變差。因此，選擇最佳pH值為9。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

在單因素基礎(chǔ)上，由Plackett-Burman試驗(yàn)考察單因素的貢獻(xiàn)率與效應(yīng)值，確定主要影響因素。試驗(yàn)考察酶添加量（A）、初始pH值（B）、料液比（C）、酶解時(shí)間（D）、酶解溫度（E）5個(gè)因素對(duì)鱘魚(yú)肝蛋白水解度（Y）的貢獻(xiàn)率。根據(jù)各單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇的高低兩個(gè)水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表5所示。

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and results of Plackett-Burman tests

使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行效應(yīng)分析和方差分析，結(jié)果如表6所示。

表6 Plackett-Burman試驗(yàn)效應(yīng)分析Table 6 Effect analysis of Plackett-Burman tests

由表6可見(jiàn)，酶添加量（A）、初始pH值（B）、酶解時(shí)間（D）3因素的效應(yīng)值為正，應(yīng)該增加，料液比（C）、酶解溫度（E）2因素的效應(yīng)值為負(fù)，應(yīng)該減小。其中貢獻(xiàn)率大小表示各因素對(duì)該試驗(yàn)結(jié)果影響的大小，由貢獻(xiàn)率的大小可得到這5個(gè)因素對(duì)模型影響的大小依次為酶解時(shí)間＞酶添加量＞初始pH值＞料液比＞酶解溫度。因此，最終選擇酶解時(shí)間、酶添加量和初始pH值共3個(gè)因素進(jìn)行下一步的最陡爬坡試驗(yàn)。

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

如圖3所示，最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，在4號(hào)試驗(yàn)點(diǎn)處出現(xiàn)最高點(diǎn)和拐點(diǎn)，該點(diǎn)處酶添加量5%（10 000 U/g）、初始pH值10.5、酶解時(shí)間8 h，此時(shí)魚(yú)肝蛋白水解度達(dá)到最大，為80.95%。選擇該點(diǎn)作為下一步Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

圖3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析Fig.3 Results and analysis of the steepest ascent tests

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)酶解時(shí)間、酶添加量和初始pH值設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7，方差分析結(jié)果如表8所示。所選擇的回歸模型的P值小于0.01，表明整體模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有顯著的影響；而失擬項(xiàng)的P值為0.685 6＞0.05，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，模型選擇適當(dāng)。蛋白水解度（Y）對(duì)酶添加量（X1）、初始pH值（X2）和酶解時(shí)間（X3）的多元二次回歸方程為：

表8 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 8 Design and results of Box-Behnken tests

表9 回歸模型方差分析結(jié)果Table 9 Variance analysis of regression model

由所得方程可知，二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，其所代表的拋物面開(kāi)口向下，表明方程具有最大值。由Design-Expert 8.0.6分析計(jì)算，得出最優(yōu)酶解條件為酶添加量10 540 U/g、初始pH值10.04、酶解時(shí)間8.60 h，此時(shí)水解度可達(dá)83.86%。

2.6 回歸模型結(jié)果驗(yàn)證

在優(yōu)化得到的條件下，根據(jù)實(shí)際條件，設(shè)置酶添加量5.3%（10 540 U/g）、初始pH 10.0、酶解時(shí)間8.6h、料液比1∶10（g∶mL）、酶解溫度45 ℃進(jìn)行3組平行酶解試驗(yàn)，以對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。鱘魚(yú)肝蛋白水解度的平均值為81.70%，與預(yù)測(cè)值擬合度達(dá)97.42%，實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值基本一致，模型可信。

2.7 鱘魚(yú)肝酶解產(chǎn)物對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，6種雙歧桿菌在添加有鱘魚(yú)肝酶解液凍干粉的培養(yǎng)基中均能夠生長(zhǎng)增殖，且在一定質(zhì)量濃度條件下生長(zhǎng)效果較在基礎(chǔ)MRS培養(yǎng)基更優(yōu)。對(duì)不同雙歧桿菌而言，培養(yǎng)基中鱘魚(yú)肝酶解液凍干粉質(zhì)量濃度并不全是越高越好。對(duì)于短雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌，隨著培養(yǎng)基體系中酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的提高，雙歧桿菌活菌數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌的活菌數(shù)隨體系中鱘魚(yú)肝蛋白酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的升高總體上呈現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)；而對(duì)于兩歧雙歧桿菌，培養(yǎng)基中酶解產(chǎn)物濃度為0.1 mg/mL的情況下便達(dá)到了顯著的促生長(zhǎng)效果（P＜0.05），且在試驗(yàn)范圍內(nèi)，繼續(xù)提升添加量，促生長(zhǎng)效果不再顯著提升（P＞0.05）。不同菌種的結(jié)果出現(xiàn)差異的原因可能是菌種之間生長(zhǎng)特性的不同以及其各自對(duì)酶解產(chǎn)物體系中各類物質(zhì)利用情況的差異。由于加入的蛋白酶解產(chǎn)物組成比較復(fù)雜，成分并不單一；同時(shí)菌株對(duì)酶解產(chǎn)物的利用也是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，且菌株間存在差異，促生長(zhǎng)機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

圖4 鱘魚(yú)肝蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)雙歧桿菌體外生長(zhǎng)活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of sturgeon liver protein enzymatic hydrolysate on the viable Bifidobacterium count in vitro

在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，對(duì)于短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌，鱘魚(yú)肝蛋白酶解液凍干粉質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)的促增殖效果最好，在這一條件下相對(duì)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)照組，活菌數(shù)均顯著提高，且差異顯著（P＜0.05）；對(duì)于青春雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌而言，魚(yú)肝酶解液凍干粉質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL時(shí)促增殖效果最好，在對(duì)應(yīng)條件下相對(duì)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)照組，活菌數(shù)顯著提高，且差異顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗(yàn)確定了酶解主要影響因素酶添加量、初始pH值、酶解時(shí)間，最陡爬坡試驗(yàn)確定了中心點(diǎn)，Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)確定了二次多項(xiàng)回歸模型，最終確定最優(yōu)酶解條件：酶添加量5.3%（10 540 U/g），體系pH10.0，酶解時(shí)間8.6 h，酶解溫度45 ℃，料液比1∶10（g∶mL）。此條件下最終水解度可達(dá)83.86%。

結(jié)果表明鱘魚(yú)肝蛋白酶解產(chǎn)物具有作為一種雙歧桿菌促生長(zhǎng)因子的開(kāi)發(fā)潛力，并為鱘魚(yú)副產(chǎn)品綜合利用提供了新思路。