釀酒酵母工程菌產(chǎn)青蒿酸的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

陳 偉，于文文，2，陳亞軍，徐 彬，滕 云

（1.浙江海正藥業(yè)股份有限公司 浙江省抗真菌藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臺(tái)州 318000；2.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310000）

青蒿素是現(xiàn)今針對(duì)瘧疾相關(guān)疾病最為有效的藥物[1-2]，青蒿素及其相關(guān)的系列衍生物在抗炎、預(yù)防及提高人類自身免疫等方面也具有一定的積極效果[3]，因此在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景較為廣闊[4]。青蒿素可以通過三種不同的方法進(jìn)行制備與獲得，分別是從種植的黃花蒿中提取[5-6]、全化學(xué)合成[7-8]以及利用基因工程手段構(gòu)建可產(chǎn)青蒿酸的微生物，通過發(fā)酵獲得青蒿酸，然后再經(jīng)過化學(xué)合成獲得[9]。

PADDON C J等[10-14]首創(chuàng)了青蒿酸的微生物發(fā)酵技術(shù)，通過基因改造技術(shù)得到直接產(chǎn)青蒿酸的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）工程菌，并通過系列優(yōu)化，不斷提高青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量。王冬等[15]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿酸的發(fā)酵制備存在成本偏高的問題。目前，國(guó)內(nèi)的研究主要集中在通過對(duì)菌種的基因工程改造，實(shí)現(xiàn)青蒿酸前體-紫橞槐二烯的微生物合成，但尚未實(shí)現(xiàn)青蒿酸的體內(nèi)合成[16-17]。于文文等[18]在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化確定了S.cerevisiae工程菌1211產(chǎn)青蒿酸較為適宜的發(fā)酵工藝并提高了青蒿酸的產(chǎn)量。本研究首先在50 L發(fā)酵罐中對(duì)S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵產(chǎn)青蒿酸的溶氧參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在確定最佳溶氧水平的基礎(chǔ)上，對(duì)S.cerevisiae工程菌1211分批發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、青蒿酸合成以及基質(zhì)消耗隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律進(jìn)行分析，明確發(fā)酵過程中基質(zhì)濃度變化對(duì)釀酒酵母工程菌1211代謝以及青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響。在此基礎(chǔ)上，利用Logistic方程和Luedeking-Piret方程，研究S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵過程變化規(guī)律，建立S.cerevisiae工程菌1211產(chǎn)青蒿酸分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，為發(fā)酵過程的預(yù)測(cè)和控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母（S.cerevisiae）工程菌1211：保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

葡萄糖（分析純）：山東西王糖業(yè)有限公司；蔗糖、琥珀酸、KH2PO4、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、CuSO4·5H2O、生物素、泛酸鈣、煙酸、肌醇、維生素B1、吡哆醛、對(duì)氨基苯甲酸、ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、CoCl2·6H2O、NaMoO4·2H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[18]：葡萄糖19.5 g/L，KH2PO48 g/L，（NH4）2SO415 g/L，MgSO4·7H2O 6.2 g/L，維生素溶液12 mL/L，金屬離子溶液10 mL/L，CuSO4·5H2O 40 μg/L，琥珀酸緩沖液（0.5 mol/L，pH 5.0）100 mL/L。

固體培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加20 g/L瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基[18]：蔗糖91.8 g/L，KH2PO48.7 g/L，（NH4）2SO410.3 g/L，MgSO4·7H2O 6.2 g/L，維生素溶液12 mL/L，金屬離子溶液10 mL/L，CuSO4·5H2O 24 mg/L。

以上培養(yǎng)基在121 ℃條件下滅菌25 min。

1.2 儀器與設(shè)備

15 L發(fā)酵罐和50 L發(fā)酵罐：上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司；JH3102稱量天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；ZWYR-C2112C型雙層真彩觸摸屏搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；1290型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)Agilent公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；M-100型生物傳感器分析儀：深圳西爾曼科技有限公司；SL 40型臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法

菌株的活化、搖瓶一級(jí)種子培養(yǎng)制備：參照文獻(xiàn)[18]。

15 L種子罐中S.cerevisiae工程菌1211種子的擴(kuò)大培養(yǎng)：裝液量8 L/15 L，發(fā)酵溫度30 ℃，菌種接種量10%（V/V），通氣比1.0 vvm，起始攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵溶氧（dissolved oxygen，DO）≥35%，溶氧＜35%時(shí)，系統(tǒng)自動(dòng)提高攪拌轉(zhuǎn)速，最高攪拌轉(zhuǎn)速≤800r/min，以維持溶氧＞35%，培養(yǎng)周期24h。

50 L發(fā)酵罐中S.cerevisiae工程菌1211的發(fā)酵培養(yǎng)：裝液量20 L/50 L，培養(yǎng)溫度30 ℃，菌種接種量10%（V/V），起始攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，攪拌轉(zhuǎn)速的設(shè)定范圍為200～450 r/min，發(fā)酵過程中通過流加28%氨水使培養(yǎng)基的pH值維持在5.5，通氣比1.6 vvm，發(fā)酵周期96 h。

1.3.2 溶氧對(duì)釀酒酵母工程菌1211發(fā)酵產(chǎn)青蒿酸的影響

S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵制備青蒿酸過程中，溶氧是最為關(guān)鍵的參數(shù)。菌體在生長(zhǎng)代謝過程中，菌體的生長(zhǎng)代謝和目標(biāo)產(chǎn)物的積累很大程度上受限于菌體所在發(fā)酵罐內(nèi)溶氧水平的高低。采用溶氧與轉(zhuǎn)速聯(lián)動(dòng)，固定空氣進(jìn)氣量，考察不同溶氧水平（10%～15%、15%～20%、20%～25%、25%～30%、30%～35%、35%～40%）對(duì)S.cerevisiae工程菌1211的生長(zhǎng)和青蒿酸產(chǎn)量的影響。

1.3.3 生物量測(cè)定

OD600nm值：采用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定發(fā)酵液的吸光度值。

細(xì)胞干質(zhì)量：取發(fā)酵液10mL于15mL離心管中，3000r/min離心15 min，棄去上清液，使用去離子水重復(fù)洗滌3次，最終獲得的濕菌體放入80 ℃的烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。

1.3.4 殘?zhí)橇康臏y(cè)定

發(fā)酵液經(jīng)3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（evaporative light scattering detection，ELSD）測(cè)定殘?zhí)牵ㄕ崽牵┖縖19]。

1.3.5 青蒿酸產(chǎn)量的測(cè)定

樣品前處理：取1 mL待測(cè)發(fā)酵液樣品和9 mL甲酸甲醇溶液（甲醇溶液中加入0.5%（V/V）純度為98%的甲酸）置于10 mL試管，充分混合均勻后，在超聲溫度45～50 ℃、功率200 W的條件下超聲破碎30 min，取混合液1 mL，12 000 r/min高速離心5 min，取上清液經(jīng)0.2 μm膜過濾獲得待測(cè)樣品。

青蒿酸含量：采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[18]。

1.3.6 動(dòng)力學(xué)模型的建立

（1）S.cerevisiae工程菌1211生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立

因S.cerevisiae工程菌1211的生長(zhǎng)曲線為較標(biāo)準(zhǔn)的S型生長(zhǎng)曲線，故選擇Logistic方程（式（1））[20-21]擬合菌體的生長(zhǎng)規(guī)律。

式中：dX/dt為S.cerevisiae工程菌1211生長(zhǎng)繁殖的速度，g/（L·h）；μm為S.cerevisiae工程菌1211菌體的最大比生長(zhǎng)速率，h-1；X為S.cerevisiae工程菌1211的生物量，g/L；Xm為S.cerevisiae工程菌1211的最大生物量，g/L；t為相應(yīng)的發(fā)酵時(shí)間，h。下同。

將Logistic方程通過積分處理，獲得相應(yīng)的代數(shù)方程，見式（2）。

式中：X0為S.cerevisiae工程菌1211的初始菌體生物量，g/L。

（2）青蒿酸合成動(dòng)力學(xué)模型的建立

采用Luedeking-Piret方程[22]對(duì)菌體的生長(zhǎng)繁殖與目標(biāo)產(chǎn)物的積累之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行描述，其方程式見式（3）。

式中：dP/dt為青蒿酸發(fā)酵積累的速度，g/（L·h）；P為青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量，g/L；α為生長(zhǎng)偶聯(lián)系數(shù)；β為非生偶聯(lián)系數(shù)。

其中，α≠0、β=0表示為生長(zhǎng)相關(guān)型；α≠0、β≠0表示為生長(zhǎng)部分相關(guān)型；α=0、β≠0表示為非生長(zhǎng)相關(guān)型。結(jié)合公式（2）和公式（3），對(duì)Luedeking-Piret方程進(jìn)行積分處理，得到相應(yīng)的代數(shù)方程，見式（4）。

式中：P0為青蒿酸初始產(chǎn)量，g/L。由于青蒿酸初始含量為0，因此P0可忽略不計(jì)。

（3）基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型的建立[23-24]

碳源基質(zhì)的消耗可以由類似Luedeking-Piret的式（5）來表示。

式中：dS/dt為基質(zhì)（碳源）消耗的速度，g/（L·h）；S為發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的質(zhì)量濃度，g/L；YX/S為發(fā)酵碳源用于S.cerevisiae工程菌1211菌體生長(zhǎng)的得率常數(shù)；YP/S為發(fā)酵碳源用于目標(biāo)產(chǎn)物青蒿酸積累得率常數(shù)；m為S.cerevisiae工程菌1211菌體維持系數(shù)。

將式（1）、式（3）和式（5）進(jìn)行積分換算得式（6）。

式中：S0為初始碳源質(zhì)量濃度，g/L；λ=1/YX/S；ω=1/YP/S。

1.3.7 動(dòng)力學(xué)模型的驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)所獲得的發(fā)酵模型是否準(zhǔn)確可靠，在發(fā)酵培養(yǎng)條件相同的前提下，進(jìn)行3個(gè)批次的平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，將發(fā)酵培養(yǎng)獲得的實(shí)際實(shí)驗(yàn)值與通過建模得到的模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶氧對(duì)釀酒酵母工程菌1211發(fā)酵產(chǎn)青蒿酸的影響

不同溶氧水平對(duì)S.cerevisiae工程菌1211的生長(zhǎng)和青蒿酸產(chǎn)量的影響見圖1。

由圖1a可知，在發(fā)酵前期，不同溶氧水平條件下，S.cerevisiae工程菌1211的OD600nm值差異不大；到發(fā)酵中期時(shí)，OD600nm值的差異逐漸變大；再到發(fā)酵后期，OD600nm值均趨于穩(wěn)定或略有下降。溶氧越高，OD600nm值越高，S.cerevisiae工程菌1211的初級(jí)代謝越旺盛。由此可知，溶氧水平對(duì)S.cerevisiae工程菌1211的生長(zhǎng)繁殖有著顯著的影響，足夠的溶氧可以明顯提高S.cerevisiae工程菌1211的生物量，大量的氧氣被用于菌株的繁殖生長(zhǎng)代謝。

由圖1b可知，當(dāng)溶氧處于10%～15%時(shí)，S.cerevisiae工程菌1211的青蒿酸產(chǎn)量較低，為（3 351.2±60.4）mg/L，分析原因可能是由于S.cerevisiae工程菌1211產(chǎn)青蒿酸需要通過甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA），而該途徑需要消耗大量的能量，此時(shí)，發(fā)酵體系中沒有足夠的氧氣支持菌株進(jìn)行呼吸作用，進(jìn)而導(dǎo)致青蒿酸產(chǎn)量較低。當(dāng)溶氧升高至25%～30%時(shí)，青蒿酸的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到最高，為（6 269.6±100.3）mg/L。之后隨著溶氧水平的進(jìn)一步提高，青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量出現(xiàn)下降。分析原因可能是由于高溶氧條件下，菌株的初級(jí)代謝非常旺盛，與產(chǎn)青蒿酸途徑在利用碳源等基質(zhì)的情況下形成了競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。當(dāng)溶氧為35%～40%時(shí)，青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量下降至（4 154.4±124.6）mg/L。因此，選擇溶氧水平25%～30%為50 L發(fā)酵罐的最適溶氧條件。

圖1 不同溶氧對(duì)釀酒酵母工程菌1211生長(zhǎng)（a）及青蒿酸產(chǎn)量（b）的影響Fig.1 Effect of dissolved oxygen on growth(a)and arteannuic acid yield(b)of engineered Saccharomyces cerevisiae 1211

2.2 釀酒酵母工程菌1211分批發(fā)酵產(chǎn)青蒿酸過程

圖2 50 L發(fā)酵罐中釀酒酵母工程菌1211分批發(fā)酵過程Fig.2 Batch fermentation process of engineered Saccharomyces cerevisiae 1211 cultivated in a 50 L fermenter

由圖2可知，S.cerevisiae工程菌1211生長(zhǎng)的延滯期為0～12 h，菌體生長(zhǎng)繁殖處于起始階段，發(fā)酵液中碳源消耗較少；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為12～48 h，菌體生長(zhǎng)繁殖速度較快，發(fā)酵液中碳源消耗速度大幅上升。為了實(shí)現(xiàn)較高的菌體生物量，以提高青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量，選擇在對(duì)數(shù)中后期，即培養(yǎng)34 h時(shí)，加入乳糖水解液誘導(dǎo)S.cerevisiae工程菌1211產(chǎn)青蒿酸。平穩(wěn)期為48～84 h，這一時(shí)期菌體的生物量以較緩慢的速率增加，青蒿酸則積累迅速。衰亡期84～96 h，在此階段，菌體大量衰亡，此時(shí)菌體的死亡速率超過菌體的生長(zhǎng)繁殖速率，導(dǎo)致菌體活細(xì)胞數(shù)呈相應(yīng)的下降趨勢(shì)，同時(shí)青蒿酸合成速率減慢。至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌體生物量為44.12 g/L，殘?zhí)橇拷咏?，青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量為6.21 g/L。由此可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，青蒿酸的合成與S.cerevisiae工程菌1211生長(zhǎng)變化趨勢(shì)一致，說明S.cerevisiae工程菌1211的菌體生長(zhǎng)繁殖規(guī)律與其目標(biāo)產(chǎn)物青蒿酸積累之間呈現(xiàn)出生長(zhǎng)相關(guān)型或生長(zhǎng)部分相關(guān)型的關(guān)系。

2.3 釀酒酵母工程菌1211菌體發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型

2.3.1 釀酒酵母工程菌1211菌體生長(zhǎng)模型

將圖2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入方程式（2），采用Origin 9.0進(jìn)行菌體生長(zhǎng)模型的非線性擬合，結(jié)果見圖3。

圖3 釀酒酵母工程菌1211干質(zhì)量實(shí)驗(yàn)值與模型擬合結(jié)果的比較Fig.3 Comparison of experimental values and model fitting values of cell dry weight of engineered Saccharomyces cerevisiae 1211

由圖3可知，菌體生長(zhǎng)模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.995 85，S.cerevisiae工程菌1211菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)X0、Xm和μm值分別為0.85、45.81和0.12，獲得菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程如下：

S.cerevisiae工程菌1211的生長(zhǎng)繁殖數(shù)據(jù)得到的動(dòng)力學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)值擬合較好。特別是在菌體的發(fā)酵前中期，發(fā)酵實(shí)驗(yàn)值與已建立的動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線較為一致，但是到了發(fā)酵末期，由于發(fā)酵罐中的青蒿酸含量逐漸升高，對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一定的抑制，從而使得菌體生物量相對(duì)于擬合值有所偏差。

2.3.2 釀酒酵母工程菌1211青蒿酸合成動(dòng)力學(xué)模型

根據(jù)圖2得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，將S.cerevisiae工程菌1211菌體相關(guān)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)X0、Xm和μm值分別代入方程式（4）中，采用Origin 9.0進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果見圖4。

圖4 青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)值與模型擬合結(jié)果的比較Fig.4 Comparison of experimental values of artemisinic acid yield with calculated values by model

由圖4可知，青蒿酸合成動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.979 04，得到青蒿酸合成動(dòng)力學(xué)參數(shù)α=0.074、β=0.001 1，由此可知，S.cerevisiae工程菌1211菌體在50 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，菌體生長(zhǎng)過程中青蒿酸的積累與菌體生長(zhǎng)繁殖為部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型，從而獲得青蒿酸積累的動(dòng)力學(xué)方程如下：

通過數(shù)據(jù)建模得到的青蒿酸合成動(dòng)力學(xué)模型曲線與經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)獲得的實(shí)驗(yàn)值之間的擬合情況較好。在發(fā)酵合成產(chǎn)物前期，青蒿酸合成擬合曲線與實(shí)驗(yàn)值幾乎保持一致。但當(dāng)發(fā)酵后期，菌體逐漸進(jìn)入衰亡期，同時(shí)，菌體生長(zhǎng)一定程度上也受到產(chǎn)物青蒿酸的抑制后，菌體產(chǎn)青蒿酸的能力也開始下降，發(fā)酵末期的青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量明顯低于模型預(yù)測(cè)值。

2.3.3 釀酒酵母工程菌1211基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型

根據(jù)圖2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，將所得的參數(shù)X0、Xm、μm、α、β值分別代入方程式（6）中，采用Origin 9.0進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果見圖5。

圖5 蔗糖含量實(shí)驗(yàn)值與模型擬合結(jié)果的比較Fig.5 Comparison of experimental values and model fitting results of sucrose content

由圖5可知，基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.995 48，得到基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)S0=90.85、m=0.007、λ=1.21、ω=2.51，由此可知，S.cerevisiae工程菌1211菌體在50 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)方程如下：

蔗糖在S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵過程中被消耗的動(dòng)態(tài)變化可以很好的由基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型曲線進(jìn)行描述?；|(zhì)的實(shí)際消耗與模型擬合稍有偏差僅發(fā)生在菌體的生長(zhǎng)末期，蔗糖消耗速率未達(dá)到擬合曲線速率，可能與菌體生長(zhǎng)代謝變慢、受到產(chǎn)物抑制以及產(chǎn)青蒿酸能力下降有關(guān)。

2.4 動(dòng)力學(xué)模型的驗(yàn)證

由表1可知，除了發(fā)酵末期實(shí)驗(yàn)值與理論值差距較大，其他實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的平均值與模型預(yù)測(cè)值兩者之間的誤差大部分都是在±10%以下。因此，S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵產(chǎn)青蒿酸的過程能夠用以上發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型來描述。

表1 模型理論值與試驗(yàn)值的比較Table 1 Comparison of theoretical value calculated by modelsand experimentalvalue

3 結(jié)論

S.cerevisiae工程菌1211在50 L發(fā)酵罐中的最佳發(fā)酵溶氧參數(shù)為25%～30%，在此條件下青蒿酸發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到（6 269.6±100.3）mg/L，與搖瓶產(chǎn)量相比提升了309.9%[18]。根據(jù)Logistic方程和Luedeking-Piret方程，借助Origin 9.0軟件，發(fā)現(xiàn)S.cerevisiae工程菌1211青蒿酸的合成和菌體的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出部分生長(zhǎng)偶聯(lián)關(guān)系，建立了S.cerevisiae工程菌1211分批發(fā)酵高產(chǎn)青蒿酸的動(dòng)力學(xué)模型，S.cerevisiae工程菌1211的菌體繁殖生長(zhǎng)、青蒿酸合成以及基質(zhì)消耗模型擬合度R2分別達(dá)到0.995 85、0.979 04和0.995 48，較好的反映了S.cerevisiae工程菌1211發(fā)酵過程中菌體生物量、青蒿酸合成和基質(zhì)消耗隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律，該研究為S.cerevisiae工程菌1211產(chǎn)青蒿酸的發(fā)酵工藝后續(xù)改進(jìn)、發(fā)酵過程的放大與控制提供了一定的理論基礎(chǔ)。