基于非水溶性大豆纖維的雙歧桿菌生物膜成膜條件優(yōu)化研究

陳翠翠，袁 野，杭 鋒，張 灝，，李元昆，陸文偉，

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué)（揚(yáng)州）食品生物技術(shù)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225004；4.新加坡國(guó)立大學(xué) 楊璐齡醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系，新加坡）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是人體和動(dòng)物腸道內(nèi)的重要菌群，對(duì)宿主具有積極的健康益處[1-2]，如促進(jìn)人體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[3]，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，治療腹瀉，降低膽固醇[4-5]等，因此近年來(lái)被廣泛應(yīng)用在功能性食品中。菌粉產(chǎn)品相比于液態(tài)益生菌產(chǎn)品，具有便于運(yùn)輸、耐儲(chǔ)藏和活菌數(shù)高的優(yōu)點(diǎn)，從工業(yè)角度更有利于開(kāi)發(fā)益生菌制劑產(chǎn)品。

生物膜是細(xì)菌自身與其分泌的多糖、蛋白、脂類(lèi)化合物和核酸等胞外聚合物基質(zhì)進(jìn)行有序地包裹，并形成具有一定結(jié)構(gòu)的微生物群落[6]。研究發(fā)現(xiàn)自然界中的99%細(xì)菌基本上都是以生物膜的形式存在的[7]。生物膜細(xì)菌在不利環(huán)境條件下，會(huì)通過(guò)自身分泌的胞外多糖聚合在固體表面，阻止了細(xì)菌與有害物質(zhì)的直接接觸，提高對(duì)惡劣環(huán)境的耐受性[8]。近年來(lái)，對(duì)生物膜的研究主要集中在污水處理和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，研究方向主要為抑制病原菌生物膜[9]的產(chǎn)生，特別是如何消除銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的生物膜[10-11]。同樣的，益生菌也可以通過(guò)生成生物膜增強(qiáng)自身對(duì)外界不利環(huán)境的抵御能力。GROSSOVA M等[12]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌生物膜比病原微生物生物膜對(duì)低pH值和膽鹽具有更高的抗性，CHEOW W S 等[13]驗(yàn)證形成生物膜后的鼠李糖乳桿菌微膠囊，冷凍干燥能力提高了將近40倍。

生物膜的形成在很大程度上受到環(huán)境的影響，且生物膜的結(jié)構(gòu)很大程度上取決于環(huán)境，環(huán)境會(huì)影響細(xì)胞的基因表達(dá)，第二信使環(huán)磷酸腺苷（cyclicadenosinemonophosphate，cAMP）和環(huán)二鳥(niǎo)苷酸（bis-（3'-5'）-cyclic diguanosine monophosphate，c-di-GMP）是控制生物膜形成的主要調(diào)控因子，調(diào)控生物膜表面蛋白、胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）的合成[14]。LIU J等[15]通過(guò)控制碳源（甘油）和氮源（谷氨酸）研究枯草芽孢桿菌生物膜中菌群面對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)是谷氨酸饑餓（而不是甘油）引起了生物膜生長(zhǎng)速率振蕩，說(shuō)明碳源和氮源對(duì)生物膜的影響不同。生物膜細(xì)菌多發(fā)生在潮濕環(huán)境下，以固相基質(zhì)為載體形成微生物群落。生物膜的產(chǎn)生離不開(kāi)成膜基質(zhì)，目前研究人員常用的成膜載體主要為微孔板[16]，在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中的指導(dǎo)意義較小。USHAKOVA N A等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌在麥麩基質(zhì)上成膜后具有更高的生物活性。OLSON J K等[18]研究發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌在生物相容微球上生成生物膜后，可通過(guò)宿主的胃腸道（包括低pH值、宿主免疫系統(tǒng)的效應(yīng)因子以及與共生菌的競(jìng)爭(zhēng)）保持更高的存活力。本試驗(yàn)通過(guò)建立基于非水溶性膳食纖維的成膜體系，探究培養(yǎng)基碳源、氮源，培養(yǎng)溫度、初始pH值和NaCl添加量對(duì)雙歧桿菌基于非水溶性膳食纖維的生物膜成膜的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)對(duì)基于非水溶性膳食纖維的雙歧桿菌成膜條件進(jìn)行了優(yōu)化，為進(jìn)一步提高雙歧桿菌的生物膜量，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

雙歧桿菌（Bifidobacterium）JSWX26-7：江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏庫(kù)。

1.1.2 化學(xué)試劑

低聚半乳糖、低聚果糖、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、魚(yú)粉蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、無(wú)水乙酸鈉、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、氯化鈉、半胱氨酸鹽酸鹽、三水合磷酸氫二鉀：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉：英國(guó)Oxoid公司；黃豆粉：市售。試驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：牛肉膏10.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，無(wú)水葡萄糖20.0 g/L，無(wú)水乙酸鈉2.0 g/L，三水合磷酸氫二鉀2.6 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，一水硫酸錳0.25 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，吐溫-80 1.0 mL/L，調(diào)整pH=6.8，于115 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基加入2.0%瓊脂。115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ME3002E臺(tái)式電子天平、FE-20 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LAB DANCER 漩渦振蕩器：德國(guó)IKA公司；GR60DA 立式自動(dòng)壓力滅菌鍋：南京庚辰儀器有限公司；DG250 厭氧工作站：英國(guó)Don Whitley Scientific公司；KQ-700E 超聲破碎機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；TG16AWS 臺(tái)式高速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化和動(dòng)態(tài)生物膜培養(yǎng)

取保藏于-80 ℃甘油管中的雙歧桿菌，用接種環(huán)在MRS平板上進(jìn)行三區(qū)劃線，37℃厭氧培養(yǎng)48h，挑取單菌落于5mL的MRS液體培養(yǎng)基[19]，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，再按2%（V/V）接種量接種于5 mL液體MRS培養(yǎng)基中，活化3代后備用。

取活化三代后的雙歧桿菌1 mL于裝有50 mL MRS液體培養(yǎng)基（黃豆粉添加量10 g/L）的錐形瓶中，并將其固定于樂(lè)扣盒中，放入?yún)捬醮?，密封。將?lè)扣盒固定于搖床上，設(shè)定轉(zhuǎn)速為100 r/min，使大豆纖維懸浮在培養(yǎng)基中而不沉降，讓菌體充分黏附于基質(zhì)上形成生物膜。使培養(yǎng)基在搖動(dòng)狀態(tài)下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 平板計(jì)數(shù)法測(cè)定成膜活菌數(shù)[17-20]

取出培養(yǎng)液充分振蕩混合均勻，吸取菌液1 mL于2 mL EP管中，同一試驗(yàn)組需要做兩份，一份于離心機(jī)中以100 r/min離心3 min（經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證明此轉(zhuǎn)速離心時(shí)菌體未離心下來(lái)，以黃豆粉為載體基質(zhì)的成膜菌可離心下來(lái)）取上清液進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果為游離活菌數(shù)；另外一份于超聲清洗機(jī)中，以700 W的功率超聲處理20 min[21]，計(jì)數(shù)結(jié)果為總活菌數(shù)。

成膜活菌數(shù)=總活菌數(shù)-游離活菌數(shù)

1.3.3 雙歧桿菌成膜條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

通過(guò)改變培養(yǎng)基中使用的碳源（葡萄糖、低聚半乳糖、低聚果糖）、氮源（胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、魚(yú)粉蛋白胨），培養(yǎng)溫度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）、初始pH值（5.8、6.3、6.8、7.3、7.8）、培養(yǎng)基中NaCl添加量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%），探究不同培養(yǎng)基碳源、氮源，培養(yǎng)溫度、初始pH值和NaCl添加量對(duì)雙歧桿菌基于非水溶性膳食纖維的生物膜成膜的影響。

1.3.4 雙歧桿菌成膜條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)雙歧桿菌成膜活菌數(shù)（Y）影響顯著的3個(gè)因素初始pH值（X1），培養(yǎng)溫度（X2）和NaCl添加量（X3），根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)[22]設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert軟件進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化[23]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為重復(fù)3次所得，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用MicrosoftExcel2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用方差分析（analysis of variance，ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)的差異分析采用T檢驗(yàn)進(jìn)行判斷，P＜0.05則認(rèn)為差異顯著。采用Design-ExpertV8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析和作圖。采用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌成膜條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同碳源對(duì)生物膜成膜情況的影響

由圖1可知，葡萄糖為碳源時(shí)成膜活菌數(shù)達(dá)到最大，為9.30×108CFU/mL。而以低聚半乳糖、低聚果糖為碳源時(shí)生物膜活菌數(shù)普遍較低。SLIZOVA M等[24]研究結(jié)果顯示，不同碳源對(duì)生物膜的影響不同，葡萄糖存在下檢測(cè)到大量生物膜的形成，與本研究試驗(yàn)結(jié)果基本一致。故選擇葡萄糖為最佳碳源。

圖1 培養(yǎng)基碳源對(duì)雙歧桿菌成膜的影響Fig.1 Effect of carbon source on biofilm formation of Bifidobacterium

2.1.2 不同氮源對(duì)生物膜成膜情況的影響

由圖2可知，當(dāng)選用魚(yú)粉蛋白胨或胰蛋白胨為主要氮源時(shí)，成膜活菌數(shù)最大，為1.24×109CFU/mL，而以酪蛋白和大豆蛋白胨為主要氮源時(shí)，其成膜能力明顯下降，最低成膜活菌數(shù)僅為5.8×108CFU/mL。結(jié)果表明，不同氮源對(duì)生物膜的成膜影響不同。為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，有效減低成本，故選擇胰蛋白胨為最佳氮源。

圖2 培養(yǎng)基氮源對(duì)雙歧桿菌成膜的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on biofilm formation of Bifidobacterium

2.1.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)生物膜成膜情況的影響

由圖3可知，隨著培養(yǎng)溫度的提高，成膜活菌數(shù)呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)。培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，成膜活菌數(shù)最高，為9.46×108CFU/mL，當(dāng)溫度低于或高于37 ℃時(shí)，不利于雙歧桿菌的生長(zhǎng)，細(xì)菌密度較低，無(wú)法達(dá)到生物膜初期黏附，造成生物膜形成能力的下降，其成膜活菌數(shù)普遍低于最適生長(zhǎng)溫度。故選擇培養(yǎng)溫度為37 ℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)雙歧桿菌成膜的影響Fig.3 Effect of culture temperature on biofilm formation of Bifidobacterium

2.1.4 初始pH值對(duì)生物膜成膜情況的影響

由圖4可知，隨著培養(yǎng)基初始pH值的增加，游離菌數(shù)、成膜菌數(shù)和總菌數(shù)均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)。培養(yǎng)前初始pH=6.8時(shí)，成膜菌、總菌均最多，分別為1.15×109CFU/mL和1.49×109CFU/mL。在一定范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谧钸mpH值范圍時(shí)，并不利于雙歧桿菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其成膜菌數(shù)和總菌數(shù)的下降。當(dāng)初始pH值過(guò)高時(shí)（pH=7.8），游離菌、成膜菌、總菌均最少，雙歧桿菌基本不能生長(zhǎng)。故選擇初始pH值為6.8。

圖4 初始pH值對(duì)雙歧桿菌成膜的影響Fig.4 Effect of initial pH on biofilm formation of Bifidobacterium

2.1.5 不同NaCl添加量對(duì)生物膜成膜情況的影響

由圖5可知，當(dāng)NaCl添加量為0～0.5%時(shí)，雙歧桿菌成膜菌數(shù)不斷升高；當(dāng)NaCl的添加量為0.5%時(shí)，雙歧桿菌成膜菌數(shù)達(dá)到最高，為1.06×109CFU/mL；當(dāng)NaCl添加量＞0.5%時(shí)，游離菌數(shù)、成膜菌數(shù)和總菌數(shù)均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。YAN J等[25]研究發(fā)現(xiàn)滲透壓力驅(qū)動(dòng)下能夠促進(jìn)霍亂弧菌對(duì)周?chē)鸂I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，有利于生物膜的形成。故選擇NaCl添加量為0.5%。

圖5 NaCl添加量對(duì)雙歧桿菌成膜情況的影響Fig.5 Effect of NaCl addition on biofilm formation of Bifidobacterium

2.2 雙歧桿菌成膜條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以成膜活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，以初始pH值（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）和NaCl添加量（X3）為考察因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。

表1 雙歧桿菌成膜條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of Box-Behnken experiments for biofilm formation condition optimization of Bifidobacterium

表2 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of response surface quadratic model

運(yùn)用Design Expert V8.0.6軟件對(duì)表1結(jié)果進(jìn)行擬合，得回歸方程：

由表2可知，所建立模型的P＜0.000 1，極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，表明該回歸模型具有較高可靠性；另外，模型的決定系數(shù)R2為0.996，說(shuō)明擬合程度很好，校正決定系數(shù)R2Adj為0.992，指出預(yù)測(cè)值與實(shí)際值具有高度的相關(guān)性。經(jīng)回歸模型方差分析，一次項(xiàng)X3和二次項(xiàng)X12、X22、X32對(duì)基于非水溶性膳食纖維的雙歧桿菌成膜活菌數(shù)影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），而一次項(xiàng)X1、X2、交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。經(jīng)Design Expert V8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行優(yōu)化分析得到最佳條件：初始pH值為7.11，培養(yǎng)溫度為37.01℃，NaCl添加量為0.35%。在此優(yōu)化成膜條件下，預(yù)測(cè)得到的生物膜活菌數(shù)最大理論值為1.28×109CFU/mL。根據(jù)回歸方程，得到各因素交互作用對(duì)雙歧桿菌成膜影響的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 初始pH值、培養(yǎng)溫度和NaCl添加量交互作用對(duì)雙歧桿菌成膜影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial pH,culture temperature and NaCl addition on biofilm formation of Bifidobacterium

由圖6可知，隨著3個(gè)因素水平的逐漸升高，雙歧桿菌成膜活菌數(shù)呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，交互作用的3個(gè)響應(yīng)面均出現(xiàn)極大值。等高線圖顯示X1X2（初始pH值、培養(yǎng)溫度）、X2X3（培養(yǎng)溫度、NaCl添加量）、X1X3（初始pH值、NaCl添加量）的交互作用相對(duì)較弱，這與響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果一致。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)以上得出的最優(yōu)發(fā)酵條件初始pH值為7.11，培養(yǎng)溫度為37.01 ℃，NaCl添加量為0.35%。根據(jù)實(shí)際操作條件調(diào)整為初始pH值7.0、培養(yǎng)溫度為37℃、NaCl添加量為0.35%，此條件下培養(yǎng)雙歧桿菌，進(jìn)行3次平行的驗(yàn)證試驗(yàn)，得到基于非水溶性膳食纖維的雙歧桿菌成膜活菌數(shù)平均實(shí)際值為1.22×109CFU/mL，所得結(jié)果與預(yù)測(cè)值基本一致，驗(yàn)證了模型的可靠性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)、Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)對(duì)雙歧桿菌動(dòng)態(tài)成膜情況因素的影響進(jìn)行了探究，結(jié)果表明基于非水溶性膳食纖維的雙歧桿菌動(dòng)態(tài)成膜的最優(yōu)工藝參數(shù)：培養(yǎng)基碳源為葡萄糖、氮源為胰蛋白胨、額外添加0.35%NaCl，培養(yǎng)溫度37℃、初始pH值7.0。在此最優(yōu)成膜條件下，制備的雙歧桿菌成膜活菌數(shù)最多為1.22×109CFU/mL，為實(shí)現(xiàn)雙歧桿菌生物膜的可控成膜，特別是為工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵制備提供了理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。