云南傳統(tǒng)腌制食品可培養(yǎng)乳酸菌多樣性及其發(fā)酵特性研究

張振宇，楊海英，詹夢濤，陸小凱，杜 剛

（1.云南民族大學 民族藥資源化學國家民族事務委員會-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南民族大學化學與環(huán)境學院，云南 昆明 650500）

云南地處祖國西南邊陲，境內崇山峻嶺、水系縱橫，低緯高原、南北落差顯著，造就了一山分四季，十里不同天的獨特立體氣候和豐富多彩的民族文化傳統(tǒng)[1-2]，歷來享有動植物王國、微生物資源寶庫的美譽。云南各地均有腌制（漬）保存食物的傳統(tǒng)，以民間小規(guī)模生產和家庭作坊生產為主，多屬自然發(fā)酵食品[3-5]，傳統(tǒng)腌制食品地域、食材、氣候類型、制作工藝的多樣性，為研究資源微生物帶來了諸多的可能性[6]。本研究選取云南多個地州傳統(tǒng)腌制食品6個品種共11份樣品進行可培養(yǎng)乳酸菌的分離鑒定及其發(fā)酵特性研究，以期從中獲得乳酸發(fā)酵優(yōu)勢菌株，為資源微生物開發(fā)及食品工業(yè)發(fā)酵提供線索與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6個品種11個樣品，采集自昭通、昆明、玉溪、西雙版納、楚雄、保山、德宏等7個地州用傳統(tǒng)工藝腌制的酸味濃郁、發(fā)酵成熟的農家自制品[7-8]，見表1。

葡萄糖、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、牛肉膏（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母浸出汁（生化試劑）：上海天鵝啤酒有限公司；吐溫-80（化學純）、檸檬酸三銨、乙酸鈉、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、碳酸鈣（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

表1 樣品的信息Table 1 Information of samples

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸出汁5 g，吐溫-80 1 mL，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉1 g，硫酸錳0.25g，硫酸鎂0.58g，磷酸二氫鉀2g，蒸餾水1000mL，pH自然。

產酸菌株篩選平板：MRS液體培養(yǎng)基添加2%瓊脂、2%碳酸鈣、0.04%溴甲酚紫。

1.2 儀器與設備

ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；XSP-10C雙目顯微鏡：上海光學儀器廠；TGL-15B高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；Eppendorf 5331聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Eppendorf公司；GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離和鑒定

無菌條件下，稱取10 g腌制樣品加入90 mL無菌生理鹽水中，勻漿后進行10倍梯度稀釋，選取適宜的濃度梯度，用涂布法接種于MRS培養(yǎng)基進行微生物分離[9]。32 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h[10]，隨機挑取菌落，多次平板劃線獲得純培養(yǎng)，挑取單菌落接種于產酸菌株篩選平板中央，于32 ℃恒溫培養(yǎng)，篩選出產生黃色透明水解圈的菌株[11]。

1.3.2 菌株細胞形態(tài)觀察

將分離獲得的菌株進行革蘭氏染色并顯微觀察細胞形態(tài)，采集細胞圖像[12]。

1.3.3 菌株生理生化試驗

將分離獲得的菌株進行明膠液化試驗、產H2S試驗、吲哚試驗、過氧化氫酶試驗、葡萄糖發(fā)酵產氣、七葉苷水解、淀粉水解等生理生化試驗[13-15]。

1.3.4 菌株分子生物學鑒定

將分離獲得的菌株用MRS平板純化培養(yǎng)3次，接種于30 mL MRS液體培養(yǎng)基，32 ℃培養(yǎng)24 h，取5 mL培養(yǎng)物于12 000 r/min離心10 min，收集菌體，用液氮凍融-十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。采用通用引物27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、1495r：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'，以基因組DNA為模板進行16S rDNA擴增。PCR擴增體系：TaqMIX 12 μL，引物各1 μL，模板2 μL，加無酶水補足20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預熱5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，經30個循環(huán)后72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京梓熙生物科技有限公司進行純化、測序，序列在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）基因庫中進行同源性比對，用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.5 菌株發(fā)酵特性研究

將10株乳酸菌活化后，分別接種于裝有200 mL MRS培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶，每個菌株做3個平行，置32 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)[16-18]。于12 h、24 h、48 h、72 h、96 h定時取樣測定發(fā)酵液中的乳酸、殘?zhí)?，作出產酸曲線、降糖曲線，對菌株發(fā)酵特性進行初步表征[19-20]。

1.3.6 乳酸的測定

用EDTA絡合滴定法[9]對發(fā)酵液中乳酸鈣進行滴定，按照以下公式進行乳酸換算：

式中：W乳酸表示乳酸的質量濃度，g/L；M乳酸表示乳酸的摩爾質量，90.08 g/mol；CEDTA表示EDTA標準溶液的物質的量濃度，mol/L；VEDTA表示滴定消耗EDTA標準溶液的體積，mL；V樣表示量取發(fā)酵液樣品的體積，mL。

2 結果與分析

2.1 菌株分離結果

用梯度稀釋-平板培養(yǎng)法對自然發(fā)酵成熟的11個樣品分別進行菌株分離，盡可能多的挑取菌落形態(tài)不同的細菌獲得純培養(yǎng)，進而用產酸菌株篩選培養(yǎng)基對純培養(yǎng)菌株進行復篩，以平板上變色-溶鈣圈出現(xiàn)的時間、大小為指標，獲得優(yōu)勢產酸菌株10株。

2.2 菌株鑒定結果

經革蘭氏染色等試驗，10株產酸菌株菌落形態(tài)特征描述見表2。

表2 10株菌株的菌落形態(tài)Table 2 Colony morphology of 10 strains

對分離菌株菌落形態(tài)特征與細胞形態(tài)觀察，結合生理生化試驗，參照《伯杰細菌鑒定手冊》、《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》，初步判斷10株產酸菌均為乳酸菌，其中桿菌9株、球菌1株。生理生化試驗結果見表3。

表3 10株菌株的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 10 strains

菌株16S rDNA序列PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像見圖1。擴增產物送至北京梓熙生物科技有限公司進行測序，序列在NCBI GenBank庫中進行同源性比對，用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，見圖2。將10株產酸菌株進行鑒定，結果見表4。由表4可知，10株菌分別屬乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串球菌屬（Leuconostoc）、腸球菌屬（Enterococcus），其中4株為戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）。

圖1 16S rDNA PCR擴增產物檢測結果Fig.1 Detection results of 16S rDNA PCR product

經鑒定，菌株1116b、1125b、1126b、1127b被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株1128b被鑒定為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），菌株1097b被鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），菌株1119b被鑒定為哈爾濱乳桿菌（Lactobacillus harbinensis），菌株1133b被鑒定為戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus），菌株1089b被鑒定為腸系膜明串球菌（Leuconostoc mesenteroides），菌株1129b被鑒定為糞腸球菌（Enterococcus faecium）。

圖2 基于16S rDNA序列10株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 10 strains based on 16S rDNA sequences

表4 10株菌株的鑒定結果Table 4 Identification results of 10 strains

2.3 菌株發(fā)酵特性研究

對純培養(yǎng)的10株乳酸菌進行初步發(fā)酵實驗，作出產酸曲線見圖3、降糖曲線見圖4。

圖3 10株菌株發(fā)酵產乳酸曲線Fig.3 Curve of lactic acid production by 10 strains

圖4 10株菌株發(fā)酵降糖曲線Fig.4 Curve of glucose consumption by 10 strains

由圖3、圖4可知，各菌株發(fā)酵特性差異較顯著：菌株1119b發(fā)酵過程中產酸量一路平穩(wěn)上升，但發(fā)酵終點乳酸產量較低、殘?zhí)橇枯^高；菌株1126b在發(fā)酵開始至24 h時即出現(xiàn)產酸速率的最大值，隨后增長趨勢減緩，發(fā)酵終點乳酸產量較高、殘?zhí)橇枯^低；菌株1097b、1129b發(fā)酵前期增長迅速，后期則表現(xiàn)出明顯的減緩趨勢，發(fā)酵終點乳酸產量處于中間水平；菌株1127b具有最高的發(fā)酵終點乳酸濃度及較低的殘?zhí)橇?，其發(fā)酵過程具有最高的轉化率。

總體來看，10株菌均有較強的產酸能力，乳酸產量為40.84～71.82 g/L，殘?zhí)呛吭?.04～20.04 g/L，乳酸轉化率為40.84%～71.82%，其中8株表現(xiàn)出同型或混合型乳酸發(fā)酵，其余2株表現(xiàn)出異型或混合型乳酸發(fā)酵。

3 結論

本研究通過對云南傳統(tǒng)腌制食品進行菌株分離、定向篩選，結合形態(tài)觀察、生理生化實驗、分子生物學鑒定等實驗，分離得到3個屬10個種乳酸菌，說明云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品中可培養(yǎng)乳酸菌多樣性豐富，是潛在的乳酸菌來源。通過進一步的乳酸發(fā)酵實驗，表明所分離菌株代謝類型多樣，且以具有優(yōu)良產酸性能的同型發(fā)酵為主，部分菌株表現(xiàn)出潛在的乳酸發(fā)酵應用價值，為資源微生物的開發(fā)利用提供了新的線索。