電針對腦缺血大鼠側腦室室管膜下區(qū)巢蛋白表達的影響

係夢琪 任秀君

缺血性腦中風是目前全世界第二大致死性疾病，死亡人數約占所有疾病的10%，是導致殘疾的主要神經性疾病，因其發(fā)病復雜、治愈率低、預后差、易復發(fā)而備受關注[1- 2]。目前國內外關于缺血性中風治療方法和預防的研究較少，西醫(yī)臨床治療中風的常用方法是溶栓，但溶栓藥物極易引起顱內出血，且時間窗較短，療效有限[3]。因而研究更有效、安全的治療方法至關重要。針灸治療中風歷史悠久，具有簡便、價廉、不良反應小的特點，在臨床中廣泛用于中風及其后遺癥的治療[4]，但其作用機制，尚不十分清楚。本實驗通過比較缺血前電針“豐隆”(ST40)，腦缺血后電針ST40、“百會”(GV20)與僅在腦缺血后電針ST40、GV20兩種針灸處方對腦缺血大鼠的影響，試圖說明電針預處理可通過增加缺血側側腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone，SVZ)巢蛋白(Nestin)陽性細胞增殖促進腦缺血后神經損傷和修復，療效優(yōu)于僅在腦缺血后進行治療，從而為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠24只，7周齡，體重(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院實驗室，保持自然生物節(jié)律(12小時光照/12小時黑暗)，溫度(24±1)℃，濕度(50±10)%，自由攝食，水瓶給水。所有程序均由北京中醫(yī)藥大學學術委員會實驗動物倫理分委員會審核批準(編號：BUCM-3-2018022802-1002)。

1.2 實驗試劑及儀器

FeCl3(10025-77-1，天津市福晨化學試劑廠)；Nestin抗體(ab11306，Abcam公司)；二抗HRP抗小鼠IgG(BM104，武漢博士德生物工程有限公司)；DAB顯色液(AR1022，武漢博士德生物工程有限公司)；無菌針灸針(0.30 mm×25 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；韓氏穴位神經刺激儀(LH202H，北京華衛(wèi)產業(yè)開發(fā)公司)；電子顯微鏡(BX40F4，Olympus公司)；數碼相機(E-330，Olympus公司)。

1.3 制作模型

大鼠用10%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，右側臥位固定在鼠板上，在外耳道和左眶上緣中間切開皮膚，做一個大約2 cm的縱向切口，分離肌肉后，去除部分顳骨，暴露出大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)，用浸有10 μL 50%FeCl3(用0.1 mol/L HCL配置)溶液的濾紙敷在該段動脈上20分鐘，取下濾紙后生理鹽水沖洗，縫合傷口，少許青霉素粉消炎抗菌，制作大腦中動脈血栓(middle cerebral artery thrombus,MCAT)模型[5]。

1.4 動物分組

大鼠按照隨機數字表法隨機分為4組：假手術組、模型組、電針1組、電針2組(每組6只)。(1)假手術組：飼養(yǎng)7天后，于第8天暴露MCA，用生理鹽水濾紙貼敷20分鐘。(2)模型組：飼養(yǎng)7天后，于第8天暴露MCA，用50%FeCl3濾紙貼敷20分鐘，造成腦缺血模型。(3)電針1組：電針雙側ST40，每天1次，連續(xù)7天，于第8天造成腦缺血模型，術后電針ST40、GV20，每天1次，連續(xù)7天；(4)電針2組：飼養(yǎng)7天，于第8天造成腦缺血模型，術后電針ST40、GV20，每天1次，連續(xù)7天。每組動物均為術后1、7天兩個時間點進行腦組織取材，每個時間點3只大鼠。電針1組、電針2組治療期間用布袋固定大鼠進行電針治療，其余各組同期布袋固定。實驗流程見圖1。

1.5 針刺方法

根據《實驗針灸學》[6]中的實驗動物穴位圖定位。ST40在膝關節(jié)后外側，腓骨正中，腓骨小頭下7 mm。GV20在頂骨正中。GV20 前2 mm穴點被選取用于連接電針。ST40直刺7 mm，GV20和前方2 mm處各向后斜刺2 mm；雙側ST40，GV20及其前方2 mm處分別接電針儀，疏密波，頻率2/100 Hz交替，刺激強度以1-2-3 mA為宜，大鼠肢體出現輕微顫動，治療持續(xù)時間30分鐘。

1.6 行為學檢測

在手術后1天運用改良的Bederson評分法[7]對所有動物神經功能缺損評分(neurological deficit score，NDS)進行檢測。0分(正常)：無神經功能缺陷；1分(輕度)：提尾時右側前爪不能伸展；2分(中度)：向右側轉圈；3分(重度)：向右側傾倒；4分(極重度)：意識喪失，不能自主活動。術后清醒時評分大于或等于1分者入選。

1.7 取材

各組大鼠生存期滿，戊巴比妥鈉腹腔麻醉后仰臥位固定，剖開胸腔暴露心臟，從左心室插入灌流針，剪開右心耳，生理鹽水灌注5分鐘后，4%多聚甲醛繼續(xù)灌注20分鐘直至動物四肢僵硬、肝臟變白，取出大腦用10%中性甲醛固定48小時以上，石蠟浸潤包埋，制成蠟塊，在前腦側腦室水平制備冠狀切片，片厚5 μm，常溫保存。

1.8 組織形態(tài)學觀察

每組大鼠在術后1天選取兩張石蠟切片，經蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后觀察缺血半暗帶的組織形態(tài)變化。

1.9 Nestin免疫組化檢測

每只大鼠隨機選取3張切片，進行免疫組化染色[8]，以檢測nestin在前腦SVZ的表達，切片以缺血側側腦室背外側角和側腦室外側壁為觀察部位，顯微鏡下放大400倍，照相機采集圖片，通過ImageJ軟件(http:// ImageJ.nih.gov)獲得面密度[9]。

1.10 統(tǒng)計學處理

注：電針1組造模前電針ST40 7天，第8天模型組和電針1、2組用50%FeCl3濾紙貼敷左側MCA建立MCAT模型，假手術組用生理鹽水代替FeCl3。術后即刻開始電針ST40、GV20，以后每天一次，每次30分鐘，持續(xù)7天。

圖1 實驗設計圖

2 結果

2.1 各組大鼠腦缺血術后行為學檢測結果

術后1天，模型組動物飲食減少，體重減輕，右側上肢屈曲，部分出現身體向右傾斜的現象，無意識喪失癥狀。與模型組比較，電針1、2組NDS降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；與電針2組相比較，電針1組神經功能缺損有減輕趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠腦缺血術后1天NDS結果

注：與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.2 大鼠腦缺血術后HE染色結果

腦缺血術后1天，假手術組缺血半暗帶皮層神經元和神經膠質細胞結構完整，排列整齊，核仁清晰，無胞漿紅染。模型組神經元排列散亂，偶見胞漿紅染，細胞周圍間隙擴大，部分血管紅細胞滲出，細胞核固縮、深染，核周出現空泡。電針治療后，缺血半暗帶膠質水腫減輕，正常神經元明顯增多，細胞空泡變性減少，組織形態(tài)趨于正常。見圖2。

2.3 大鼠腦缺血術后Nestin免疫組化染色結果

假手術組側腦室背外側角和側腦室外側壁Nestin陽性細胞數量較少，染色較淺，分布稀疏，陽性表達主要集中在側腦室外側壁。模型組缺血側側腦室背外側角染色加深，外側壁陽性細胞表達增厚，在室管膜下區(qū)聚集。與模型組比較，電針治療后，Nestin陽性反應強度進一步增強，電針1組更為明顯；Nestin陽性細胞沿著側腦室背外側伸展向外延伸在術后7天時更明顯。見圖3、圖4。

2.4 各組大鼠腦缺血術后Nestin面密度比較

與假手術比較，術后1、7天模型組側腦室背外側角和側腦室外側壁Nestin面密度均增加(P<0.01)。腦缺血術后1天，與模型組比較，電針1組側腦室背外側角(P<0.01)和側腦室外側壁Nestin面密度升高(P<0.01)，電針2組側腦室背外側角(P<0.05)和外側壁Nestin面密度也升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。腦缺血術后7天，與模型組比較，電針1、2組側腦室背外側角Nestin面密度升高(P<0.01)，側腦室外側壁Nestin面密度也有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。電針1、2組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、表3。

圖2 各組大鼠腦缺血術后1天缺血半暗帶皮層組織形態(tài)觀察(HE染色，×400)

圖3 各組大鼠腦缺血術后Nestin在缺血側側腦室背外側角的表達(免疫組化染色，×400)

圖4 各組大鼠腦缺血術后Nestin在缺血側側腦室外側壁的表達(免疫組化染色，×400)

表2 各組大鼠腦缺血術后缺血側側腦室背外側角Nestin面密度比較

注：n為高倍鏡下視野數。與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表3 各組大鼠腦缺血術后缺血側側腦室外側壁上段Nestin面密度比較

注：n為高倍鏡下視野數。與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

3 討論

缺血性中風是死亡和長期殘疾的主要原因之一，臨床上西醫(yī)治療中風常用的方法為溶栓[3]，而唯一獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的用于治療缺血性中風的溶栓劑是重組組織纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator，rtPA)。由于rtPA的治療范圍限制在癥狀發(fā)作時間開始3小時內，療效有限，并且常常會導致顱內出血[10]，這在很大程度上限制了rtPA的臨床應用。鑒于其發(fā)病的廣泛性和對患者的破壞性影響，臨床上迫切需要治療缺血性中風更好的方法。

再生策略，尤其是關于神經再生的治療策略，為許多中風患者提供了希望。神經發(fā)生在成年大腦SVZ和海馬齒狀回的顆粒下層(subgranular zone，SGZ)長期存在[11]。哺乳動物的大腦包含神經干細胞(neural stem cells ，NSCs)，它們具有自我更新、增殖和分化成多種神經細胞的能力[12]。當大腦缺血時，SVZ的NSCs增殖、分化，并異位遷移到紋狀體和大腦皮層的缺血半暗帶中，隨后，產生新的神經元來替代丟失的神經細胞[13]。然而此類自發(fā)的神經源性反應是有限的，并不足以抵消由腦缺血引起的腦損傷。因此，采取能夠刺激內源性NSCs增殖和分化的措施是非常重要的。通過針刺刺激NSCs的增殖、分化、遷移，可及時補充壞死凋亡的細胞，抑制缺血中心區(qū)范圍的擴大，促進神經功能的恢復。Nestin常在成年NSCs以及未成熟的神經祖細胞中瞬時表達，并且在細胞轉化為膠質細胞、神經元等分化細胞后消失，常被用來標記胚胎和成年大腦中的NSCs[14]。研究發(fā)現，腦缺血大鼠SVZ區(qū)的NSCs在造模后立即被激活，Nestin陽性細胞迅速增多，并在術后7天達到峰值[15]，針刺可使缺血側SVZ區(qū)Nestin表達水平增高，明顯促進腦缺血損傷后內源性NSCs的增殖[16- 17]。

本實驗結果顯示，電針1、2組大鼠NDS較模型組明顯降低，缺血半暗帶膠質水腫減輕，神經元趨于正常，提示針灸療法可以促進腦缺血損傷大鼠的功能恢復[18]。腦缺血術后，缺血側側腦室背外側角和外側壁Nestin陽性表達從1天開始增高，到術后7天達到高峰，腦缺血可能誘導SVZ區(qū)NSCs增殖，與既往文獻研究結果一致。缺血前電針ST40，缺血后電針 ST40和GV20，能夠使SVZ區(qū)Nestin的表達增強，陽性細胞向側腦室背外側伸展延續(xù)；缺血前不進行針刺預處理，僅在缺血后進行電針治療同樣可以達到增強NSCs增殖、遷移的目的，但效果不如前者，提示持續(xù)的電針治療可能使缺血側SVZ區(qū)NSCs處于連續(xù)增殖狀態(tài)，并沿著側腦室背外側伸展遷移，從而達到修復損傷的目的。

綜上所述，電針ST40、GV20可以改善神經功能，減輕缺血性腦損傷，促進SVZ區(qū)NSCs增殖，達到腦損傷后神經修復的目的；缺血前電針ST40，缺血后電針 ST40、GV20效果優(yōu)于缺血后電針 ST40、GV20。