阿司匹林對(duì)腦缺血損傷大鼠JAK/STAT信號(hào)通路的影響

孫永 孫輝 姚凱華 李志鋒 李永文

缺血性腦血管病因其具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)對(duì)人類(lèi)的生命和健康威脅甚大，已成為危害人類(lèi)生命的第三大殺手[1]。腦缺血性損傷是缺血性腦血管病中重要的病理生理過(guò)程[2]。阿司匹林是臨床最常用的具有解熱鎮(zhèn)痛的非甾體類(lèi)抗炎藥物；研究表明阿司匹林可增強(qiáng)腦部血流循環(huán)，防止因腦缺血造成腦梗死的發(fā)生[3]。另有研究表明，阿司匹林還可改善缺血部位的能量代謝，參與抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程[4]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腦缺血有密切關(guān)聯(lián)，是調(diào)節(jié)腦缺血后腫瘤壞死因子-α、白介素等造成腦缺血后細(xì)胞損傷的細(xì)胞因子反應(yīng)的關(guān)鍵通路[5]。JAK2/STAT3通路的激活可能介導(dǎo)缺血腦損傷神經(jīng)元的凋亡過(guò)程。阿司匹林對(duì)腦缺血損傷大鼠JAK/STAT信號(hào)通路的影響筆者所見(jiàn)鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠局灶性腦缺血性損傷模型，研究大鼠局灶性腦缺血性損傷后以及不同濃度阿司匹林干預(yù)后JAK2、磷酸化 JAK2(pJAK2)、STAT3、磷酸化 STAT3 (pSTAT3)蛋白水平表達(dá)變化及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況，旨在探討阿司匹林對(duì)腦缺血性損傷大鼠JAK/STAT信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 12～15周齡的無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)健康SD雄性大鼠100只(合格證號(hào)：SCXK京2006-0009)，體重200～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；阿司匹林購(gòu)自上海先聲藥業(yè)有限公司；JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3 多克隆抗體均來(lái)自美國(guó) Bioworld 公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔/兔抗小鼠IgG購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，小鼠抗大鼠 β-actin抗體、TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 、DAB顯色試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；磁共振掃描儀購(gòu)自德國(guó)西門(mén)子公司；凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；BXM-950光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海炳宇光學(xué)儀器有限公司；CM1850石蠟切片機(jī)購(gòu)自北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司；蛋白印跡設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Bio Rad公司。

1.2 模型構(gòu)建與分組處理 將80只大鼠進(jìn)行編號(hào)，隨機(jī)分為4組，每組20只，分別為假手術(shù)組、模型組、阿司匹林低劑量組(10 mg/kg)、阿司匹林高劑量組(50 mg/kg)。模型構(gòu)建：大鼠麻醉后，取0.285 mm直徑的尼龍線(xiàn)，參照文獻(xiàn)[6]，用絲線(xiàn)將頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈結(jié)扎，將準(zhǔn)備好的尼龍繩沿頸總動(dòng)脈插入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈后，松開(kāi)血管夾，推進(jìn)線(xiàn)栓約 9 mm 左右阻塞同側(cè)的大腦中動(dòng)脈；在右側(cè)頸總動(dòng)脈切口上方固定線(xiàn)栓，完成大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)造模。假手術(shù)組不做血管結(jié)扎或阻塞，其余操作同模型組。4組大鼠灌注術(shù)后第1天開(kāi)始腹腔注射給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)給藥7 d，假手術(shù)組和模型組腹腔給予等量無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液。見(jiàn)圖1。

1.3 神經(jīng)功能缺損程度(mNNS)評(píng)分 第7天給藥30 min后，參考文獻(xiàn)[6]采用改良的mNNS評(píng)分方法，將大鼠行為分為7個(gè)等級(jí)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：大鼠爬行正常，沒(méi)有不對(duì)稱(chēng)活動(dòng)；1分：大鼠尾部垂直提起時(shí)前肢或后肢彎曲；2分：大鼠在1分的基礎(chǔ)上伴有不能直線(xiàn)行走；3分：大鼠爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；4分：大鼠自由活動(dòng)時(shí)向左側(cè)傾倒；5分：大鼠在4分的基礎(chǔ)上出現(xiàn)左前爪后拖；6分：大鼠肢體完全不能支撐身體，無(wú)法自發(fā)爬行。

圖1 線(xiàn)栓法制備MCAO手術(shù)過(guò)程；A：仔細(xì)分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈；B：結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈；C：夾住頸內(nèi)動(dòng)脈；D：后切開(kāi)頸總動(dòng)脈，從頸總動(dòng)脈插入螺紋，然后松開(kāi)動(dòng)脈夾，將線(xiàn)插入頸內(nèi)動(dòng)脈；E：固定線(xiàn)；F：縫合皮膚

1.4 磁共振(MRI)法測(cè)量腦梗死體積 大鼠經(jīng)神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分結(jié)束后，使用磁共振掃描儀檢測(cè)腦梗死體積，大鼠取仰臥位，找到標(biāo)準(zhǔn)軸位后，在橫斷面T2-加權(quán)成像的基礎(chǔ)上進(jìn)行冠狀面3層掃描，層厚度1.5 mm，間距0.2 mm。T2-加權(quán)成像檢測(cè)大鼠腦梗死體積，梗死區(qū)域?yàn)樯n白色，正常腦組織區(qū)域?yàn)榛疑?。利用Image J分析軟件計(jì)算腦梗死體積(%)=(梗死區(qū)體積/全腦組織體積)×100%。

1.5 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取大鼠梗死部位腦組織，放入 4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟常規(guī)包埋并在組織切片機(jī)上做連續(xù)6 μm 切片按試劑盒步驟進(jìn)行TUNEL染色。主要步驟為切片脫蠟水化后， 蛋白酶 K(10 mmol/L)處理20 min，PBS 清洗5 min×3次，將載玻片浸入TUNEL反應(yīng)混合物在37℃下避光溫育60 min，PBS清洗5 min×3 次；在 37℃ 下，用POD反應(yīng)液避光溫育30 min；PBS 清洗 5 min×3 次；滴加 DAB 底物溶液顯色，室溫孵育10 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀(guān)察神經(jīng)元凋亡情況。以顯示藍(lán)色的核染色為正常細(xì)胞，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)。凋亡神經(jīng)元所占百分比(凋亡率)：每只大鼠取 4 張切片，每張切片在200 倍視野下隨機(jī)選取 3 個(gè)不重疊視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例，取平均值。

1.6 Western Blot檢測(cè)JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3 取新鮮梗死部位腦組織加入RIPA組織裂解液中勻漿器打碎，冰浴5 min后離心，離心條件：13 000 r/min，4℃，時(shí)間10 min，獲得上清，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行上清中蛋白濃度的定量檢測(cè)，用2×電泳緩沖液稀釋蛋白至相同濃度。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離蛋白，用Tris/甘氨酸緩沖液將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%TBST液中室溫封閉2 h，將PVDF膜放入相應(yīng)一抗稀釋液(均為1∶1 000)中孵育，4℃過(guò)夜。次日，將膜取出，TBST液洗滌10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液(均為1∶10 000)，室溫孵育2 h，加入DAB發(fā)光液，凝膠成像儀下讀取讀取灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 假手術(shù)組大鼠評(píng)分為0，即無(wú)明顯神經(jīng)功能萎縮現(xiàn)象；其他組都存在不同程度的神經(jīng)功能缺損，還出現(xiàn)了精神萎靡、反應(yīng)遲鈍和進(jìn)食減少等狀況。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組相比，阿司匹林高、低劑量組神經(jīng)功能損傷評(píng)分出現(xiàn)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，阿司匹林高劑量組效果更為明顯，與低劑量組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 阿司匹林對(duì)大鼠癥狀學(xué)評(píng)分的影響 n=20,分,

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與阿司匹林低劑量組比較，△P<0.05

2.2 阿司匹林對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響 假手術(shù)組大鼠兩側(cè)腦組織未發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)域，與假手術(shù)組相比，模型組腦梗死體積明顯增大(P<0.05)；與模型組相比，阿司匹林高、低劑量組腦梗死體積明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，阿司匹林高劑量組效果更為明顯，與低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖2。

組別腦梗死體積假手術(shù)組 0.00模型組 53.51±4.31*阿司匹林低劑量組36.81±3.21#阿司匹林高劑量組25.12±3.10#△

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與阿司匹林低劑量組比較，△P<0.05

圖2 阿司匹林對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響;A假手術(shù)組;B模型組;C阿司匹林低劑量組;D阿司匹林高劑量組

2.3 阿司匹林對(duì)MCAO大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 假手術(shù)組大鼠中出現(xiàn)少量凋亡細(xì)胞；與假手術(shù)組相比，缺血性模型組于術(shù)后24 h可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，阿司匹林治療后，與模型組相比，阿司匹林高、低劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，阿司匹林高劑量組效果更為明顯，與低劑量組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。見(jiàn)圖3，表3。

2.4 阿司匹林對(duì)MCAO大鼠JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步觀(guān)察阿司匹林對(duì)大鼠缺血腦梗死的作用機(jī)制，本研究采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)了缺血區(qū)腦組織中JAK2、pJAK2、STAT3、

圖3 阿司匹林對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響;A假手術(shù)組;B模型組;C阿司匹林低劑量組;D阿司匹林高劑量組

組別凋亡率假手術(shù)組 10.23±2.19模型組 46.24±3.24*阿司匹林低劑量組35.67±3.02#阿司匹林高劑量組24.78±3.22#△

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與阿司匹林低劑量組比較，△P<0.05

pSTAT3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，模型組中pJAK2、pSTAT3表達(dá)水平明明顯升高(P<0.05)；阿司匹林治療后，與模型組相比，阿司匹林高、低劑量組pJAK2、pSTAT3表達(dá)水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，阿司匹林高劑量組下降更為明顯，與低劑量組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。見(jiàn)圖4，表4。

圖4 阿司匹林對(duì)MCAO大鼠JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表達(dá)的影響

組別JAK2pJAK2STAT3pSTAT3假手術(shù)組 0.41±0.050.11±0.024.49±0.136.15±0.15模型組 0.38±0.040.58±0.07*4.46±0.0415.21±0.12*阿司匹林低劑量組0.42±0.050.39±0.06#4.48±0.1112.35±0.26#阿司匹林高劑量組0.41±0.060.14±0.03#△4.51±0.118.71±0.22#△

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與阿司匹林低劑量組比較，△P<0.05

3 討論

大腦供血的動(dòng)脈發(fā)生狹窄或阻斷時(shí)，會(huì)導(dǎo)致腦組織因供血供氧不足出現(xiàn)局部缺血甚至壞死，大腦功能受到損害，對(duì)機(jī)體的生理活動(dòng)產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響[7]。缺血性腦梗死與心血管疾病和惡性腫瘤并列成為對(duì)人類(lèi)生命構(gòu)成極大威脅的致死性疾病[8]。

阿司匹林的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與改善腦組織的能量代謝、減少自由基生成、抑制興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性有關(guān)，臨床研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林可顯著降低心肌梗死及腦卒中的發(fā)病率[9]。本研究給予MCAO大鼠不同濃度阿司匹林治療后，與模型組相比，腦梗死體積明顯縮小，神經(jīng)功能損傷程度明顯減輕，同時(shí)抑制了神經(jīng)細(xì)胞凋亡的數(shù)量，大鼠局部腦缺血損傷得到緩解，該結(jié)果與既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10]一致，再次證實(shí)了藥物的治療效果。

JAK/STAT信號(hào)通路將來(lái)自細(xì)胞外的化學(xué)信號(hào)傳遞給細(xì)胞核，導(dǎo)致與免疫、增殖、分化和凋亡等相關(guān)的基因的DNA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[11]。在JAK/STAT信號(hào)通路中，細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞膜上的細(xì)胞因子受體結(jié)合后活化JAK催化受體發(fā)生酪氨酸磷酸化形成pJAK，pJAK與細(xì)胞膜上的受體相偶聯(lián)后發(fā)生酪氨酸磷酸化，STAT蛋白與受體結(jié)合，在pJAK的催化下發(fā)生磷酸化形成pSTAT[12]。pSTAT與受體親和力較低，因此pSTAT與受體分離，形成二聚體的活性形式轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，并結(jié)合到啟動(dòng)子上誘導(dǎo)相應(yīng)基因表達(dá)，完成信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，可直接影響相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而改變靶細(xì)胞的增殖或分化狀態(tài)[13]。JAK2/STAT3是JAK/STAT信號(hào)通路的一種，已有研究表明腦缺血性腦損傷會(huì)釋放大量的炎性細(xì)胞因子如IL-2、IL-6可使 JAK2/STAT3信號(hào)通路激活[14]。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化的JAK2、STAT3蛋白表達(dá)量與神經(jīng)元凋亡的時(shí)間段和部位基本一致[15]。Yu等[16]發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血性24 h后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)隨著pSTAT3 蛋白表達(dá)的增加而增多。Huang等[17]通過(guò)對(duì)STAT3基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)STAT3在小鼠腦缺血中會(huì)干擾基因轉(zhuǎn)錄，影響突觸傳遞，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)及影響細(xì)胞代謝等。因此，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路激活抑制能夠顯著減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，縮小腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損，具有明顯的腦保護(hù)作用。

研究藥物的分子機(jī)制，探尋藥物作用的靶點(diǎn)有利于藥物的使用及藥物的優(yōu)化。阿司匹林的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制具體機(jī)制上不清楚。Shen等[18]發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血性損傷后經(jīng)灌胃阿司匹林，大鼠腦梗死體積減小，且JAK2磷酸化水平下降，推測(cè)阿司匹林可能通過(guò)JAK2介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮大腦神經(jīng)的保護(hù)作用。本研究通過(guò)對(duì)JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血性損傷后，腦組織中pJAK2、pSTAT3 表達(dá)顯著上調(diào)。與模型組比較，阿司匹林干預(yù)后pJAK2、pSTAT3表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡減少，神經(jīng)功能缺損得到明顯改善，與既往研究結(jié)果相似。

綜上所述，大鼠腦缺血性損傷后可能引發(fā)了 JAK2、STAT3的活化；阿司匹林可能通過(guò)抑制JAK2/ STAT3 信號(hào)通路的活化，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善缺血性對(duì)大鼠的神經(jīng)功能缺損，減輕腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但阿司匹林是否還能通過(guò)調(diào)節(jié)其他通路來(lái)影響疾病進(jìn)程，仍需進(jìn)一步的研究。