中介素1-53抑制NLRP3炎癥小體減輕多柔比星引起的心肌損傷

蔡晨 吳迪 李朋洋 王斌

100039 北京大學航天臨床醫(yī)學院 航天中心醫(yī)院心內科(蔡晨、吳迪、王斌)；77030 Houston，Texas Heart Institute(李朋洋)；515041 汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內科(王斌)

以多柔比星(doxorubicin，DOX)為代表的蒽環(huán)類藥物是常用的腫瘤化療藥物。但DOX劑量依賴性的心臟毒性嚴重限制了其使用，對于癌癥幸存者來說藥物引起的心力衰竭已成為其主要死因[1-2]。蒽環(huán)類藥物所致心血管并發(fā)癥包括急性冠狀動脈綜合征、擴張型心肌病和心律失常等[3]。國際心臟病學會將心臟毒性定義為左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)下降超過10%或LVEF<50%[4]。DOX最具代表性的心臟毒性為左心室舒張末壓降低和LVEF受損，導致心臟有效泵血減少，從而引發(fā)充血性心力衰竭[5]。

中介素(intermedin，IMD)是2004年發(fā)現(xiàn)的降鈣素基因相關肽超家族的新成員[6-7]。IMD1-53很可能是體內降解的主要活性片段[8]，對多種心血管疾病有強大的保護作用[9]。Li等[10]發(fā)現(xiàn)，IMD1-53水平與非ST段抬高型急性心肌梗死相關；Wu等[11]發(fā)現(xiàn)，IMD1-53對敗血癥大鼠的心臟功能具有保護作用。但是，IMD1-53對于DOX誘導的急性心肌損傷是否具有保護作用尚不清楚。因此，本實驗將在DOX誘導的心肌損傷小鼠模型上研究IMD1-53是否具有保護作用，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8～9周齡雄性C57BL/6J小鼠[(24±2)g]由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，動物飼養(yǎng)管理實驗操作符合《北京市實驗動物管理條例》等法規(guī)要求。常規(guī)條件飼養(yǎng)，實驗前12 h禁食，自由飲水。

1.2 主要試劑

一抗：RAMP1(sc-11379)、RAMP2(sc-11380)、RAMP3(sc-11381)購自Santa Cruz 公司；β-actin購自Abcam公司；NLRP3(D4D8T)購自Cell Signaling Technology公司；caspase-1(C4851)購自Sigma公司；二抗：辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗購自美國Santa Cruz生物科技公司；IMD1-53購自美國Pheonix Pharmaceuticals 公司；IL-1β Elisa試劑盒購自武漢博士德公司；其他試劑為市售分析純產品。

1.3 實驗分組及模型構建

DOX引起小鼠急性心肌損傷模型：14只雄性8～9周齡C57BL/6J小鼠采用單純隨機抽樣分為2組：CON組6只，腹腔注射0.02 ml/g生理鹽水；DOX組8只，腹腔注射15 mg/kg DOX。DOX誘導5 d，期間DOX組有2只小鼠死亡。

IMD減輕DOX引起小鼠急性心肌損傷模型：36只雄性8～9周齡C57BL/6J小鼠采用單純隨機抽樣分為3組：對照組(CON組)12只，腹腔注射0.02 ml/g生理鹽水；DOX組12只，腹腔注射15 mg/kg DOX；DOX+IMD1-53組(IMD組)12只，腹腔注射15 mg/kg DOX和60 nmol/kg IMD1-53。造模第5天時，3組小鼠同時行超聲心動圖檢測(造模前未進行超聲心動圖檢測)。造模7 d后，3組小鼠乙醚麻醉后摘眼球取血，用于進一步Elisa檢測；頸椎脫臼處死3組小鼠，取出心臟，用于HE染色及Western blot檢測。模型構建期間，6只DOX組小鼠死亡，2只IMD組小鼠死亡。

小鼠骨髓巨噬細胞體外培養(yǎng)DOX引起的NLRP3炎癥小體激活模型：由于DOX在體外實驗中無法直接激活NLRP3炎癥小體，首先用LPS刺激巨噬細胞。實驗分為4組：CON組巨噬細胞中不加入任何藥物；LPS組巨噬細胞中加入50 ng/ml LPS處理4 h；DOX組巨噬細胞經50 ng/ml LPS處理4 h后再加入10 mmol/ml的DOX誘導8 h；IMD組巨噬細胞經50 ng/ml LPS處理4 h后再加入10 mmol/ml的DOX和10-7mol/L IMD1-53同時誘導8 h。采用Western blot方法檢測NLRP3和caspase-1的蛋白含量。

1.4 超聲心動圖檢測

戊巴比妥麻醉小鼠后備皮，應用Vevo770小動物超聲儀(Visual Sonics，Toronto，Canada)，探頭頻率30 MHz，將探頭置于小鼠胸骨前，二維超聲顯示左室短軸切面，于乳頭肌水平應用M超聲記錄左心室運動曲線，測定LVEF和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)等指標。連續(xù)測量5個心動周期，計算均值。

1.5 心臟質量/脛骨長度比值(HW/TL)測量

將取出的小鼠心臟，用0.9%生理鹽水沖洗殘余血液，沖洗干凈后放在濾紙上吸干水分。使用分析天平測量小鼠心臟質量。取小鼠右脛骨，剝離脛骨上肌肉組織后，用游標卡尺測量右脛骨長度。計算小鼠心臟質量/脛骨長度比值(HW/TL)=心臟質量(mg)/右脛骨長度(cm)。

1.6 HE染色

將小鼠心臟包埋于石蠟塊中做石蠟切片并儲存于-4℃冰箱。石蠟切片從-4℃冰箱中取出后晾干，浸入蘇木精染液5～15 min，自來水洗3～5 min。0.5%～1%鹽酸乙醇溶液分化數(shù)秒，自來水洗1～5 min。弱堿性水溶液顯藍30～60 s，自來水洗5～10 min。之后蒸餾水洗1～2次。0.5%伊紅染色2～3 min，蒸餾水洗1～2次。脫水：80%乙醇30～60 s；95%乙醇30～60 s；無水乙醇1 min；重復無水乙醇1 min。透明：浸入二甲苯1 min；重復浸入二甲苯1 min。中性樹膠封固。

1.7 Western blot檢測

將準備好的心肌組織加入裂解液(含1 mol/L PMSF)，冰上研磨，在4℃ 1 200轉/min離心10 min，取上清。Bradford法檢測蛋白濃度，按比例加入5×上樣緩沖液煮樣，10%SDS-PAGE電泳，200 mA恒流電轉轉膜，5%脫脂牛奶封閉30 min，TBST洗膜3次，每次5 min，結合相應一抗。放4℃冰箱孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，結合相應的二抗，室溫孵育1 h，用ECL化學發(fā)光試劑盒與硝酸纖維素膜孵育后，放入暗盒內曝光，顯影后再定影。用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-actin標化，所有實驗重復3次。

1.8 Elisa檢測

加入樣品和標準品，37℃反應90 min。加生物素標記抗體，37℃反應60 min。1×洗滌緩沖液洗滌3次，每次浸泡1 min左右。加ABC，37℃反應30 min。1×洗滌緩沖液洗滌5次，每次浸泡1～2 min左右。TMB 37℃避光反應20～25 min。加入TMB 終止液，用酶標儀在450 nm測定OD值讀數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 DOX引起急性心肌損傷時IMD受體的表達變化

大體形態(tài)顯示，CON組小鼠的HW/TL為(69.61±1.73)mg/cm，DOX組為(46.49±2.61)mg/cm，后者小鼠心臟明顯縮小，HW/TL下降33%(P<0.01)。Western blot結果顯示，與CON組相比，DOX組的心肌組織中內源性IMD受體RAMP1和RAMP2的蛋白表達分別升高了5.08倍(圖1A)和2.31倍(圖1B)(均為P<0.01)，而RAMP3蛋白表達升高了12%(P>0.05)(圖1C)。提示在DOX誘導急性心肌損傷的病理過程中，內源性IMD受體系統(tǒng)也發(fā)生了變化，因此，內源性IMD參與了心肌損傷的發(fā)生。

2.2 IMD1-53改善DOX引起的心臟功能損傷

CON組小鼠1周后生存率為100%，DOX組為50%(6/12)，IMD組為83%(10/12)，與DOX組相比，IMD組小鼠1周生存率提高了33%，提示IMD1-53改善DOX注射后小鼠的生存率。注射IMD1-53后，小鼠心臟大小產生明顯變化(圖2A)，CON組小鼠HW/TL為(66.80±1.34)mg/cm，DOX組為(42.01±1.17)mg/cm，IMD組為(50.64±1.61)mg/cm。與CON組相比，DOX組小鼠的HW/TL下降37%；與DOX組相比，IMD組小鼠的HW/TL升高20%(均為P<0.01，圖2B)，提示IMD1-53改善了DOX引起的心臟縮小。

與CON組比較，aP<0.01(n=6)圖1 DOX誘導的小鼠心肌損傷模型中IMD受體系統(tǒng)的表達變化

通過大體形態(tài)分析IMD1-53對于DOX引起的心臟縮小的保護作用，小鼠心臟大體標本(A)和通過HW/TL計算出DOX及IMD1-53引起心臟大小變化的量(B)。與CON組比較，aP<0.01；與DOX組比較，bP<0.01圖2 IMD1-53抑制DOX誘導的小鼠心臟縮小

超聲心動圖顯示，CON組小鼠的LVEF為53.62%±3.28%，DOX組為31.98%±2.61%，IMD組為46.37%±2.23%。與CON組相比，DOX組小鼠的LVEF下降40%；與DOX組相比，IMD組的LVEF升高44%(均為P<0.01)。CON組小鼠的LVFS為26.35%±2.01%，DOX組為15.07%±1.09%，IMD組為22.73%±1.035%。與CON組相比，DOX組小鼠的LVFS下降43%(P<0.01)；與DOX組相比，IMD組的LVFS升高51%(P<0.05)。提示IMD1-53改善DOX引起的左心收縮功能減低(圖3)。

2.3 IMD1-53減輕DOX引起的心肌炎癥

HE染色結果顯示，相比于CON組，DOX組小鼠心肌間質內有明顯的炎癥細胞聚集；而相比于DOX組，IMD組心肌間質內的炎癥細胞明顯減少(圖4)。

2.4 IMD1-53抑制NLRP3炎癥小體激活

通過Elisa方法檢測小鼠血清中IL-1β水平，CON組為(70.28±3.07)pg/ml，DOX組為(100.83±9.84)pg/ml，IMD組為(85.69±0.77)pg/ml。通過Western blot方法檢測小鼠心肌中NLRP3和caspase-1蛋白含量。與CON組相比，DOX組的NLRP3蛋白水平升高了18.47倍(圖5A)，caspase-1蛋白表達量升高了24倍(圖5B)，血清IL-1β水平升高了54.2%。與DOX組相比，IMD組的NLRP3蛋白表達量下降70%(圖5A)，caspase-1蛋白表達下降67%(圖5B)，血清IL-1β水平下降20.4%。以上提示，IMD1-53通過抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β軸，改善了DOX引起的心肌炎癥。

進一步通過小鼠骨髓巨噬細胞體外培養(yǎng)驗證外源性IMD1-53對DOX引起的NLRP3炎癥小體激活的影響，結果顯示，與LPS組比較，DOX組的NLRP3蛋白水平升高72.3%(P<0.05)(圖6A)，caspase-1蛋白表達量升高91%(P<0.01)(圖6B)。與DOX組相比，IMD組NLRP3蛋白表達量下降31.8%(圖6A)，caspase-1蛋白表達下降32.4%(P<0.01)(圖6B)。Elisa方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的含量，CON組為(53.51±1.74)pg/ml，LPS組為(528.40±4.22)pg/ml，DOX組為(1 548.16±23.89)pg/ml，IMD組為(904.10±28.41)pg/ml。與CON組相比，DOX組IL-1β上升28.67倍；與DOX組相比，IMD組IL-1β下降41.6%(均為P<0.01)。提示在體外試驗中，DOX進一步加重了LPS引起的NLRP3炎癥小體激活，而IMD1-53對其產生抑制作用。

超聲心動圖顯示各組小鼠LVEF變化，3組小鼠超聲心動圖的典型圖片(A)、LVEF(B)和LVFS(C)。與CON組比較，aP<0.01；與DOX組比較，bP<0.01，cP<0.05圖3 IMD1-53改善DOX引起的心臟收縮功能減退

HE染色顯示小鼠心肌細胞和心肌間質炎癥細胞聚集(箭頭所示)圖4 IMD1-53減輕DOX引起的心肌炎癥

Western blot分析DOX誘導的小鼠心臟組織中NLRP3(A)和caspase-1(B)的蛋白表達變化。與CON組比較，aP<0.01；與DOX組比較，bP<0.01圖5 IMD1-53抑制NLRP3炎癥小體激活

3 討論

DOX作為一線腫瘤化療藥物極大地提高了患者的生存率，但其引起的劑量相關性心臟毒性限制了其使用。目前，臨床上多通過早期監(jiān)測和早期干預來降低DOX引起的心臟損傷。

DOX通過氧化應激、線粒體損傷、DNA損傷、促進細胞凋亡等機制引起心肌受損，最終導致心肌細胞死亡[12]。本研究顯示，與CON組相比，小鼠注射DOX后心臟明顯縮小，HW/TL降低，心臟中IMD受體RAMP1和RAMP2明顯升高，提示IMD可能通過其受體及受體后信號通路產生心臟保護作用；而外源性注射IMD1-53可降低小鼠死亡率，顯著改善小鼠心臟的收縮功能。

炎癥小體是先天性免疫系統(tǒng)的組成部分，NLRP3炎癥小體是心臟組織中表達最廣泛的，其在非感染性刺激時可以被激活[13-14]。當DOX引起心肌細胞無菌性損傷時，NLRP3炎癥小體被激活，產生大量促炎細胞因子IL-1β分泌到細胞外，從而引發(fā)心肌細胞進一步損傷。

DOX引起心肌細胞死亡，這些死亡的心肌細胞產生的細胞碎片所引起的無菌性損傷又被稱為損傷相關分子模式，激活NLRP3炎癥小體[13]。激活的炎癥小體通過釋放強效促炎細胞因子IL-1β，進一步加重心肌細胞損傷，從而促進心肌重構和心臟衰竭。

既往研究表明IMD具有抗炎作用，可以抑制炎癥反應和氧化應激。其同系物腎上腺髓質素也具有很強的抗炎作用。Li等[15]發(fā)現(xiàn)，IMD1-53可以通過降低炎癥因子釋放、減少氧化應激產物形成來減輕心肌的缺血再灌注損傷；吳迪等[11]研究表明，IMD1-53可以減輕敗血癥大鼠的心肌損傷；此外也有研究表明，IMD可以通過抑制炎癥反應和氧化應激減輕腎病綜合征[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，IMD1-53可降低小鼠死亡率和改善小鼠心臟功能。體內和體外實驗同時證實了IMD1-53可以抑制NLRP3炎癥小體活化，從而進一步抑制IL-1β的釋放，減輕心肌炎癥。同時HE染色顯示，外源性IMD1-53可減少心肌間質中炎癥細胞聚集。這些結果表明，IMD1-53可能通過抑制NLRP3炎癥小體激活減輕DOX引起的心肌炎癥。

IMD作為強大的心血管系統(tǒng)保護劑，具有抑制氧化應激、抑制內質網應激、抑制細胞凋亡等作用[11]，這些作用很可能也是其抑制DOX所引起的心臟損傷的機制，需要進一步的研究驗證。

本研究初步證實了外源性IMD1-53可改善DOX引起的小鼠心臟功能受損，其機制可能與IMD抑制NLRP3炎癥小體有關。本研究為減輕DOX心臟毒性提供了新的思路，值得進一步探討。

本研究驗證了IMD可以改善DOX引起的急性心肌損傷，但IMD與DOX引起的慢性心肌損傷之間的關系尚不明確；同時，IMD抑制心肌損傷的同時是否損害DOX的抗腫瘤作用需要進一步研究。

利益沖突：無