八寶葉片對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)

趙雪琦，陳志新，冷平生，胡增輝

(北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院，北京 102206/北京農(nóng)學(xué)院林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心，北京 102206)

干旱是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)面臨的一個(gè)巨大難題，嚴(yán)重威脅著農(nóng)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。典型的景天科植物因其特殊的景天酸代謝(Crassulacean acid metabolism, CAM)模式，均具有較強(qiáng)的耐旱能力。CAM植物每固定1 g CO2或生產(chǎn)1 g干物質(zhì)，水分的消耗量均比傳統(tǒng)的C3或C4植物小[1,2]，并且通過(guò)CAM途徑固定的CO2能讓植物在碳獲取量最大的同時(shí)消耗更少的水分[3]，這幫助一些植物能在干旱環(huán)境下能更高效的利用水分，更好的適應(yīng)逆境條件。

八寶(Hylotelephiumerythrostictum(Miq.) H. Ohba)為景天科八寶屬多年生肉質(zhì)草本植物，也是典型的兼性CAM植物。因其管理粗放，但景觀效果好并且抗旱性強(qiáng)的特點(diǎn)，近年來(lái)已經(jīng)成為城市園林綠化與生態(tài)建設(shè)中不可缺少的地被植物。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)八寶的研究主要集中在繁育技術(shù)[4-5]、園林應(yīng)用[6-7]、化學(xué)成分方面[8-9]；對(duì)其抗性的研究主要集中在耐鹽脅迫[10]、重金屬脅迫[11]等。雖然也有關(guān)于八寶耐旱性的相關(guān)報(bào)道[12]，但只是對(duì)八寶一天中白天和夜晚的生理變化進(jìn)行了研究，缺乏長(zhǎng)時(shí)間、脅迫程度更高的觀察研究，對(duì)其耐旱機(jī)制了解不夠。通過(guò)控制土壤水分的方式來(lái)進(jìn)行干旱脅迫容易造成土壤濕度不均勻的問(wèn)題，使用類(lèi)似甘露醇等的滲透調(diào)節(jié)劑又易對(duì)植物產(chǎn)生離子毒害，而PEG6000(聚乙二醇6000)因較高的分子量導(dǎo)致其不能自由的通過(guò)植物細(xì)胞壁，從而不會(huì)的對(duì)植物細(xì)胞造成離子毒害，同時(shí)又能引起滲透脅迫，因此使用PEG模擬干旱脅迫是一個(gè)較好的選擇。

本試驗(yàn)使用PEG6000模擬干旱脅迫處理八寶水培苗，測(cè)定葉片相關(guān)生理指標(biāo)，研究八寶葉片對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)，為揭示八寶的抗旱機(jī)理及其應(yīng)用推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料采自北京農(nóng)學(xué)院東大地，剪取健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的八寶幼苗進(jìn)行水培扦插，培養(yǎng)液為1/4Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，每3 d更換1次。光周期為14 h光照/10 h黑暗，晝夜溫度為24 ℃/20 ℃，相對(duì)濕度30 %。待生長(zhǎng)25 d長(zhǎng)出6～8片功能葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行脅迫處理。試驗(yàn)于2019年4月至7月在北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PEG處理 試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)處理，分別為：CK(1/4Hoagland營(yíng)養(yǎng)液)、10%PEG、20%PEG、30%PEG、40%PEG，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。所有處理溶液均用1/4Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制，為保證處理溶液濃度的穩(wěn)定性，每隔3 d更換1次處理液。分別于處理后的第0、3、6、9、15、20、25、30 天進(jìn)行采樣。采樣后立即放入液氮中淬冷，之后貯存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2.2 相對(duì)含水量測(cè)定 葉片的相對(duì)含水量(RWC)采用烘干法[13]測(cè)定。剪取植物成熟葉片立即稱質(zhì)量(記為鮮質(zhì)量)，然后將葉片放入加有蒸餾水的錐形瓶中，靜置24 h后取出葉片，用濾紙吸干葉片表面水分并稱質(zhì)量(記為飽和鮮質(zhì)量)，最后將葉片放入烘箱中，105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒質(zhì)量(記為干質(zhì)量)。每組處理重復(fù)3次。相對(duì)含水量%=[(鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)/(飽和-干質(zhì)量)]×100%。

1.2.3 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定 相對(duì)電導(dǎo)率(REC)的測(cè)定參考陳志新[10]的方法，選取成熟葉片用打孔器打10個(gè)圓形葉片，加5 mL蒸餾水，用真空抽氣泵抽氣30 min，震蕩后室溫靜置30 min測(cè)溶液電導(dǎo)率；隨后沸水浴10 min并迅速冷卻至室溫，測(cè)煮沸后的電導(dǎo)率。相對(duì)電導(dǎo)率(%)=(未煮沸電導(dǎo)率/煮沸電導(dǎo)率)×100%。

1.2.4 丙二醛含量測(cè)定 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法[14]。稱取0.2 g葉片，加入10 mL10%三氯乙酸和少量石英砂，研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移勻漿到試管中，4 000 r/min離心10 min，上清液即丙二醛提取液。取2 mL提取液(對(duì)照管加2 mL蒸餾水)加2 mL 0.6%硫代巴比妥酸搖勻?；旌弦涸诜兴≈蟹磻?yīng)10 min，取出試管迅速冷卻，4 000 r/min離心10 min，取上清分別在532、450、600 nm處測(cè)吸光值。

CMDA=6.45(A532-A600)-0.56A450(μmol/L)；MDA含量(μmol/g)=(CMDA×提取液總體積)/樣品質(zhì)量。CMDA為MDA的濃度，A532、A450、A600分別代表450 nm、532 nm和600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值。

1.2.5 可溶性糖含量測(cè)定 可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法[15]。稱取0.2 g葉片，加入10 mL蒸餾水研磨至勻漿，轉(zhuǎn)到10 mL離心管中，于沸水中提取30 min，過(guò)濾至25 mL容量瓶中定容，即樣本提取液。吸取樣品提取液0.5 mL于10 mL離心管中，加1.5 mL蒸餾水、0.5 mL蒽酮乙酸乙酯和5 mL濃硫酸，沸水浴中精確保溫1 min，自然冷卻至室溫后搖勻，在630 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。

可溶性糖含量(%)=[(C×VT×n)/(W×VS×106)]×100。C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的含糖量;VT：提取液總體積(mL);VS：測(cè)定時(shí)取用的樣品提取液體積(mL);n：稀釋倍數(shù);W：樣品質(zhì)量(g) 。

1.2.6 脯氨酸含量測(cè)定 稱取0.2 g葉片，加5 mL 3%的磺基水楊酸溶液研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移到試管中，沸水浴提取10 min，冷卻后過(guò)濾，濾液即為脯氨酸提取液[15]。吸取2 mL提取液于試管中，加入2 mL冰醋酸和2 mL 2.5%酸性茚三酮溶液，沸水浴加熱30 min。冷卻后加入4 mL甲苯，震蕩30 s，靜置片刻，用移液槍吸取脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)吸光度值。

脯氨酸含量(μg/g)=(X×提取液總量)/(樣品鮮質(zhì)量×測(cè)定時(shí)提取液量)。式中X為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的脯氨酸含量(μg)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理作圖，用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan法檢驗(yàn)進(jìn)行差異比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)八寶葉片相對(duì)含水量的影響

干旱脅迫第0天處理組與對(duì)照組葉片相對(duì)含水量無(wú)差異，但隨著處理濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，八寶葉片的相對(duì)含水量基本呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(圖1)。第3天開(kāi)始，10%PEG脅迫下的八寶葉片相對(duì)含水量始終高于對(duì)照，但除了3 d外無(wú)顯著差異。20%PEG脅迫下，第6天相對(duì)含水量開(kāi)始有明顯下降，下降了13%，到脅迫第30 d時(shí)下降了39.5%。在30%、40%PEG的脅迫下，第3天葉片相對(duì)含水量開(kāi)始就有顯著下降，分別下降了25.7%和36%；之后脅迫的第6 天到30天，30%和40%PEG脅迫之間基本無(wú)顯著差異，第30天時(shí)，僅為對(duì)照的45.2%和41.6%。

注：不同大寫(xiě)字母表示相同時(shí)間不同處理之間的差異顯著水平(P<0.05)，不同小寫(xiě)字母表示相同處理不同時(shí)間之間的差異顯著水平(P<0.05)；圖2，表1，表2，表3相同Note:Different capital letters indicate significant difference among different treatmentsat the same time point (P<0.05). Different small letters indicate significant difference among different time points under the same treatment(P<0.05)；The same as Fig.2,Table 1,Table 2,Table 3圖1 干旱脅迫對(duì)八寶葉片相對(duì)含水量的影響Fig.1 Effect of drought stress on the relative water contents of H. erythrostictum leaves

2.2 干旱脅迫對(duì)八寶葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

隨著干旱程度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，八寶葉片的相對(duì)電導(dǎo)率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)(圖2)，并且與對(duì)照相比都有顯著差異(P<0.05)。10%PEG脅迫的第3天和6天相對(duì)電導(dǎo)率僅增加了1.04倍和1.09倍；到第30天時(shí)，與對(duì)照相比增加了1.4倍。20%和30%PEG脅迫之間對(duì)八寶葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響差異不大。40%PEG脅迫在第30天最高，是對(duì)照的1.56倍。

圖2 干旱脅迫對(duì)八寶葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of drought stress on the relative electric conductivities of H. erythrostictum leaves

2.3 干旱脅迫對(duì)八寶葉片丙二醛含量的影響

如表1所示，八寶葉片丙二醛的含量隨著處理程度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。10%PEG脅迫對(duì)葉片丙二醛含量的影響雖與對(duì)照有顯著差異，但增幅較小；第30天時(shí)與對(duì)照相比增加了2.44倍。20%和30%PEG脅迫的濃度之間只有第6天和15天有顯著差異，分別為對(duì)照的1.8倍、2.05倍和2.3倍、2.94倍。40%PEG脅迫30 d時(shí)的葉片丙二醛含量最高，為對(duì)照的4.88倍。

2.4 干旱脅迫對(duì)八寶葉片可溶性糖含量的影響

八寶葉片的可溶性糖含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫程度的升高而增加(表2)。相同脅迫時(shí)間下，不同脅迫濃度對(duì)葉片可溶性糖含量的影響基本均與對(duì)照有顯著差異(P<0.05)。10%和20%兩個(gè)濃度的脅迫之間基本無(wú)顯著差異；10%PEG脅迫的第20天和第30天與對(duì)照相比分別增加了1.28倍和1.43倍。20%PEG脅迫的第3天和15天分別與對(duì)照相比增加了1.15倍和1.34倍；脅迫20、25、30 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間無(wú)顯著差異，與對(duì)照相比分別增加了1.36倍、1.43倍和1.5倍。40%PEG脅迫第30天時(shí)，葉片的可溶性糖含量增幅最大，為對(duì)照的1.99倍。

表1 干旱脅迫對(duì)八寶葉片丙二醛含量的影響Tab.1 Effect ofdrought stress on the MDA contents of H. erythrostictum leaves

表2 干旱脅迫對(duì)八寶葉片可溶性糖含量的影響Tab.2 Effect of drought stress on the soluble sugar contents of H. erythrostictum leaves

2.5 干旱脅迫對(duì)八寶葉片脯氨酸含量的影響

如表3所示，干旱脅迫下八寶葉片的脯氨酸含量同樣隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫程度的增加而增加。10%、20%和30%PEG在脅迫的第3天和第6天的增幅不明顯，但在第9天時(shí)均急劇上升，分別為對(duì)照的3.31倍、3.5倍和3.86倍。40%PEG脅迫下，八寶葉片脯氨酸含量則在第6天就顯著上升，為對(duì)照的3.28倍；在脅迫第30天時(shí)，葉片脯氨酸含量最高為對(duì)照的13.99倍；與脅迫第0天相比，葉片脯氨酸含量增加了13.28倍。

表3 干旱脅迫對(duì)八寶葉片脯氨酸含量的影響Tab.3 Effect ofdrought stress on the proline contents of H. erythrostictum leaves

3 討 論

植物在受到干旱脅迫時(shí)能產(chǎn)生很多抗逆性的反應(yīng)，包括脫水反應(yīng)、滲透調(diào)節(jié)等。在逆境條件下，植物通過(guò)對(duì)干旱信號(hào)的感知、傳導(dǎo)，從而能引發(fā)一系列復(fù)雜的生理變化，各個(gè)變化是緊密聯(lián)系的綜合性反應(yīng)。因此本研究對(duì)PEG模擬干旱脅迫下的八寶葉片進(jìn)行了相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。

相對(duì)含水量是可以反映植物抗旱能力強(qiáng)弱的有效指標(biāo)之一。植物葉片含水量高、水分流失慢，則植物的抗旱性較強(qiáng)[14]。本試驗(yàn)中10%PEG脅迫處理下的八寶葉片相對(duì)含水量在整個(gè)處理周期都維持在較高的水平，說(shuō)明輕度脅迫能使八寶葉片有更強(qiáng)的保水能力。20%PEG脅迫的第0～20天葉片相對(duì)含水量下降不明顯，說(shuō)明該程度的脅迫前期并未對(duì)八寶造成顯著的影響。但是30%、40%PEG脅迫下，隨著脅迫濃度的升高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，八寶葉片的相對(duì)含水量逐漸下降，這與景天科的長(zhǎng)藥景天(H.spectabile)、德國(guó)景天(Sedumhybridum)等植物結(jié)果相似[16-17]。

植物組織在感受到干旱脅迫的危害時(shí)，細(xì)胞膜的功能和結(jié)構(gòu)最先受到損害，其中質(zhì)膜的相對(duì)透性和膜脂過(guò)氧化則反映了細(xì)胞膜的受損過(guò)程[18]。葉片相對(duì)電導(dǎo)率的大小可以作為衡量植物在脅迫下的受傷害程度。在干旱脅迫下，植物細(xì)胞膜的通透性增加，電解質(zhì)大量外滲，相對(duì)電導(dǎo)率增加。從圖2可以看出，在脅迫0～6 d期間八寶葉片的相對(duì)電導(dǎo)率增加幅度較小，到脅迫第9天時(shí)開(kāi)始相對(duì)電導(dǎo)率增幅顯著，說(shuō)明此時(shí)干旱脅迫已經(jīng)對(duì)八寶葉片的細(xì)胞膜造成了較明顯的損傷。MDA是膜脂過(guò)氧化的終產(chǎn)物也是重要產(chǎn)物之一，他的產(chǎn)生可以加劇細(xì)胞膜的損傷，其含量的高低一定程度上可以反映植物抗逆性的強(qiáng)弱。本試驗(yàn)中，10%PEG脅迫下八寶葉片的MDA含量增幅較為平緩；而20%、30%、40%PEG脅迫下，20～30 d時(shí)葉片MDA含量明顯提高，說(shuō)明輕度干旱脅迫以及短期內(nèi)的中度或重度干旱脅迫對(duì)八寶葉片細(xì)胞膜造成的損傷較小，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性，而脅迫20 d之后中度、重度干旱造成葉片膜脂過(guò)氧化程度較高，損傷較大。

滲透調(diào)節(jié)是植物在逆境條件下降低滲透勢(shì)，忍耐和抵御逆境脅迫的一種重要方式[19]。其中可溶性糖和脯氨酸是一類(lèi)重要的參與滲透調(diào)節(jié)的有機(jī)溶質(zhì)，其含量的增加對(duì)提高細(xì)胞液濃度、植物吸水能力，降低植物細(xì)胞水勢(shì)十分有利[20]。在本試驗(yàn)中，隨著脅迫濃度的增加以及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，八寶葉片中可溶性糖含量和脯氨酸含量均不斷增加，這與其它試驗(yàn)結(jié)果一致[21]。說(shuō)明在干旱脅迫下八寶啟動(dòng)了防御機(jī)制，通過(guò)提高可溶性糖和脯氨酸含量來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，增強(qiáng)植物抗旱性，維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育。但是脯氨酸的增加程度遠(yuǎn)高于可溶性糖含量的增幅，也表明八寶主要是通過(guò)增加脯氨酸的含量來(lái)緩解干旱脅迫帶來(lái)的損傷。