高效液相色譜法測(cè)定大鼠體內(nèi)復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清中人參皂苷Rb1的含量

周 圍，謝金玲，鐘衛(wèi)干，周倍伊

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

復(fù)方扶芳藤合劑由扶芳藤、人參、黃芪等中藥組成，臨床用于治療心脾兩虛、氣血不足等證。方中人參大補(bǔ)元?dú)?，益氣生精止渴，補(bǔ)脾益肺，安神益智［1］。人參的主要活性成分人參皂苷Rb1能增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，減少細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，明顯抑制腦和肝中過(guò)氧化脂質(zhì)形成，減少大腦皮層和肝中脂褐素的含量，同時(shí)也能增加超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶在血液中的含量，具有抗氧化作用［2-4］。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)復(fù)方扶芳藤合劑有效成分的檢測(cè)進(jìn)行了一些研究［5-6］，但對(duì)復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清中有效成分的檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清中人參皂苷Rb1 的含量，為開(kāi)展復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清中有效成分的測(cè)定提供一定的參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SD雄性大鼠120只，體質(zhì)量180～200 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SYXK桂2010-0001。

1.2 試藥 復(fù)方扶芳藤合劑樣品由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供（批號(hào)20181010，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z45021781）；人參皂苷Rb1 對(duì)照品（純度91.2%，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110704-201827）；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

1.3 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀，含Wa?ters 2998 PDA 光電二極管矩陣檢測(cè)器（美國(guó)沃特世公司）；賽多利斯SECURA225D-1CN 天平（德國(guó)Sartorius 公司）；Allegra X-22R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）；ELGA Classic UV 超純水系統(tǒng)（英國(guó)埃爾格公司）；海爾DW-86L386 超低溫冰箱（中國(guó)海爾）；Organomation MICROVAP 118 氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 大鼠含藥血清樣品的制備 采用隨機(jī)數(shù)表法，將SD 大鼠分為4 組，每組30 只:復(fù)方扶芳藤合劑低劑量組（A）、復(fù)方扶芳藤合劑中劑量組（B）、復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組（C）和空白對(duì)照組（D）。復(fù)方扶芳藤合劑低、中、高劑量組連續(xù)7 d灌胃給藥，給藥劑量分別為2.72 ml/kg、5.43 ml/kg、10.87 ml/kg，每天1次；空白對(duì)照組灌胃給予等容量的生理鹽水。末次給藥后腹腔主動(dòng)脈取血（取血前禁食過(guò)夜，正常給水，按3 ml/kg 10%水合氯醛麻醉），3 000 r/min 離心10 min，56 ℃水浴鍋滅活30 min，即得對(duì)應(yīng)血清，-80 ℃冰箱保存。

2.2 人參皂苷Rb1含量的測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取人參皂苷Rb1 對(duì)照品約5 mg，精密稱定為5.202 mg，轉(zhuǎn)移至5 ml 棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得每1 ml含1.04 mg人參皂苷Rb1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取各劑量組的含藥血清1 000 μl，解凍，加3 000 μl 乙腈旋渦混合2 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，氮?dú)獯蹈?，? 000 μl甲醇溶解，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾［7］，作為待測(cè)定的供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的制備 取空白對(duì)照組大鼠血清1 000 μl，解凍，加3 000 μl 乙腈旋渦混合2 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，氮?dú)獯蹈?，? 000 μl甲醇溶解，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為待測(cè)定的陰性溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱:welch Μltimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫:25 ℃；流動(dòng)相:乙腈∶水（33∶67）等度洗脫；流速1.0 ml/min；檢測(cè)器為2998 PDA Detector 檢測(cè)器。結(jié)果表明，在此洗脫條件下，血清中其他物質(zhì)不干擾人參皂苷Rb1 的測(cè)定，復(fù)方扶芳藤合劑中其他成分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也沒(méi)有影響，峰形良好，出峰時(shí)間為12.992 min（見(jiàn)圖1、圖2、圖3）。

圖1 人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液

圖2 陰性溶液

圖3 供試品溶液

2.2.5 線性關(guān)系考察 使用自動(dòng)進(jìn)樣器精密吸取人參皂苷Rb1對(duì)照品儲(chǔ)備液1 μl、2 μl、4 μl、6 μl、8 μl、10 μl、12 μl、14 μl、16 μl，按2.2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定并記錄人參皂苷Rb1 的峰面積。以峰面積積分值Y 對(duì)進(jìn)樣量X（μg）進(jìn)行線性回歸，求得人參皂苷Rb1 回歸方程為Y=197 011 X-220 764（r2=0.999 5）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1 在1.02～16.32 μg 范圍內(nèi)，其峰面積Y 與進(jìn)樣量X（μg）呈良好的線性關(guān)系（n=9）。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在2.2.4 項(xiàng)色譜條件下，精密吸取同一大鼠復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清的供試品溶液10 μl，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 進(jìn)樣分析，測(cè)定并記錄人參皂苷Rb1 的峰面積，計(jì)算得RSD 為2.0%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 在2.2.4 項(xiàng)色譜條件下，精密吸取人參皂苷Rb1 對(duì)照品溶液10 μl進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定并記錄人參皂苷Rb1 的峰面積，計(jì)算RSD為2.7%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一大鼠復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清，按2.2.2 項(xiàng)下制備供試品溶液6 份。取各供試品溶液，在2.2.4 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μl，測(cè)定并記錄人參皂苷Rb1 的峰面積，計(jì)算人參皂苷Rb1 平均含量，結(jié)果平均含量為80.78 μg/ml，RSD 為1.62%（n=6），結(jié)果表明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收試驗(yàn) 取同一大鼠復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清，精密量取6 份，每份0.5 ml，精密加入含人參皂苷Rb1 1.04 mg/ml 的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4 ml，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.2.4 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定并記錄人參皂苷Rb1的峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為102.4%，RSD=1.26%（n=6）。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.3 含量測(cè)定 依據(jù)分組處理得到對(duì)應(yīng)血清，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備各供試品溶液。在2.2.4 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定并記錄人參皂苷Rb1 的峰面積。各個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，計(jì)算每組樣品中人參皂苷Rb1的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 含藥血清中人參皂苷Rb1的含量測(cè)定結(jié)果 （n=3）

3 討 論

含藥血清作為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣本成分復(fù)雜，血清內(nèi)蛋白質(zhì)含量高，直接進(jìn)樣分析，不僅會(huì)損壞儀器，還會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的雜質(zhì)峰，對(duì)人參皂苷Rb1 出峰分離造成干擾，同時(shí)還會(huì)消耗大量的流動(dòng)相溶劑，延長(zhǎng)進(jìn)樣分析時(shí)間。本研究在含藥血清中加入乙腈，使血清內(nèi)的蛋白變性，離心后的上清液用氮吹法濃縮純化，經(jīng)處理后的檢測(cè)樣本符合檢測(cè)要求。

實(shí)驗(yàn)中以不同梯度的乙腈∶水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度考察，并控制出峰時(shí)間，保證目標(biāo)成分的峰形無(wú)拖尾。當(dāng)乙腈∶水=33∶67 時(shí)，人參皂苷出峰時(shí)間為12.992 min，其峰面積Y 與進(jìn)樣量X（μg）呈良好線性關(guān)系，r2=0.999 5；平均加樣回收率為102.4%，RSD 為1.26%（n=6）。由于檢測(cè)樣本處理得當(dāng)，其他組分相互之間干擾較小，每組耗時(shí)縮短，減少使用流動(dòng)相溶劑，節(jié)約進(jìn)樣分析時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該方法對(duì)大鼠體內(nèi)復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清中人參皂苷Rb1的含量測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性良好。