重組人堿性磷酸酶表達(dá)及其調(diào)節(jié)人白細(xì)胞釋放TNF-α活性研究

惠覓宙，秦璐楠，高辰哲，薄 樂(lè)，劉天奇，吳書(shū)音，韓建春，翁曉剛，雙 寶*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

炎癥是人體組織抵御外來(lái)有害物質(zhì)入侵的非特異性免疫反應(yīng)，主要由血液中白細(xì)胞滲出到血管外患處釋放炎癥因子（如TNF-α 等）造成。TNFα是一種哺乳動(dòng)物分泌的蛋白，是體內(nèi)炎癥反應(yīng)的初始細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和促進(jìn)炎癥作用。TNF-α促進(jìn)多種炎癥因子（如IL-1、IL-6）釋放，與炎癥發(fā)展密切相關(guān)。其中，外來(lái)微生物通過(guò)裂解產(chǎn)生內(nèi)毒素脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和Toll-樣受體4（Toll-like receptors4，TLR4）結(jié)合造成組織炎癥損傷。皮膚和黏膜紅腫硬痛為體表炎癥常見(jiàn)表現(xiàn)。炎癥參與人類疾病的病理過(guò)程，肥胖、心腦血管疾病和代謝性疾病，近年來(lái)均被定義為炎癥性疾?。↖nflammatory diseases）。

堿性磷酸酶分多個(gè)亞型（TNAP、IAP、PLAP），廣泛分布于人體不同組織，包括心[1]、腦[2]、胎盤血管上皮細(xì)胞[3]、腸道黏膜[4]和肝臟細(xì)胞等[5]。1997年荷蘭科學(xué)家Poelstra 等首次報(bào)道分布在小腸黏膜表面的腸堿性磷酸酶（IAP）可滅活腸道內(nèi)大腸桿菌裂解產(chǎn)生的LPS，阻止LPS 與TLR4 受體結(jié)合[6]。Bhan 和Sonoko 通過(guò)敲除腸堿性磷酸酶基因發(fā)現(xiàn)，無(wú)腸堿性磷酸酶動(dòng)物易患糖尿病和高血脂[7-8]。荷蘭生物制藥公司AM-Pharma 的Peters 和Lukas 使用重組人腸堿性磷酸酶治療內(nèi)毒素相關(guān)膿毒血癥腎損傷和結(jié)腸炎[9-10]。

目前堿性磷酸酶是否可通過(guò)體內(nèi)其他核酸產(chǎn)物的脫磷調(diào)節(jié)TNF-α釋放尚不明確。本研究采用黑曲霉和CHO 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)和制造重組人腸堿性磷酸酶（recAP），進(jìn)一步研究recAP 是否具有抑制炎癥因子TNF-α分泌的生物活性，分析細(xì)胞內(nèi)除LPS外其他酶反應(yīng)基質(zhì)，旨在擴(kuò)大重組人腸堿性磷酸酶臨床應(yīng)用范圍并明確相關(guān)機(jī)制，為炎癥性疾病治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

因此，投放調(diào)味品的種類和數(shù)量皆不可亂來(lái)。特別是對(duì)于多味菜，必須分清味的主次，才能恰到好處地使用主、輔調(diào)料。

出發(fā)菌株黑曲霉菌株TH-2由肇東市日成酶制劑有限公司提供。大腸桿菌DH5α及農(nóng)桿菌AGL1和pT-Tgla、pT-6R 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌遺傳實(shí)驗(yàn)室提供。pMD-19T由TaKaRa試劑公司提供。 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO、recAP 模板質(zhì)粒和pMH3-PLAP 質(zhì)粒由紹興惠薈生物有限科技公司提供。本試驗(yàn)構(gòu)建堿性磷酸酶黑曲霉表達(dá)載體pSZH-ChimAP和CHO重組表達(dá)載體pMH3-ChimAP。

1.1.2 試驗(yàn)材料與藥品

圍墻板材采用AS裝配式墻板，現(xiàn)場(chǎng)裝配施工。每個(gè)柱距布置3塊AS裝配式墻板，底部1塊為寬1 000 mm墻板，上面兩塊為寬500 mm墻板。AS裝配式圍墻兩面無(wú)需處理，板與板之間的縫隙、圍墻板與槽口的縫隙均使用嵌縫劑做板縫處理。

引物由博仕生物公司合成；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自TaKaRa 試劑公司；鮭魚(yú)精DNA 購(gòu)自ThermoFisher 公司；電轉(zhuǎn)杯、電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自Bio-Rad公 司；DMEM/F-12 培 養(yǎng) 基、G418 購(gòu)自Gibico 公司；Hygromycin B、PRMI-1640培養(yǎng)基、LPS（大腸桿菌0111：B4）、bIAP（P6774-2KU）購(gòu)自Sigma 公司；抗生素、DNA Marker、Protein Marker 購(gòu)自上海生物工程有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒、基因組提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物公司；陽(yáng)離子柱sp XK50、陰離子柱Q XK50柱購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司；磷酸苯二鈉比色法試劑盒（TE0007）購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；試管定量基質(zhì)顯色法鱟試劑盒（EC32545S）購(gòu)自廈門鱟試劑生物科技有限公司；ATP、腺苷購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；無(wú)機(jī)磷測(cè)試盒（C006-1-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；人靜脈血白細(xì)胞分離試劑盒（內(nèi)毒素<0.1 EU）購(gòu)自天津?yàn)笕A科生物科技有限公司；TNF-α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D system公司。

1.2 方法

1.2.1 重組人腸堿性磷酸酶表達(dá)與純化

1.2.1.1 基因克隆

收集細(xì)胞培養(yǎng)液離心過(guò)濾，30 ku 膜包濃縮約6 倍。利用sp XK50 離子交換柱純化除雜蛋白。收集流穿液通過(guò)Q XK50 離子交換柱作無(wú)熱原處理，純化后目的蛋白SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果如圖5 所示。HPLC 法檢測(cè)蛋白純度為92.45%，結(jié)果如圖6 所示。按照堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒（磷酸苯二鈉比色法）測(cè)定其活性為140.125 U·mL-1。

以pMD19T-ChimAP 質(zhì)粒[11]為模板，引物擴(kuò)增基因片段，將擴(kuò)增片段瓊脂糖膠回收純化，連接轉(zhuǎn)化。提取質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后送測(cè)。得到各基因測(cè)序結(jié)果與已知Blast 序列對(duì)比，比對(duì)正確質(zhì)粒分別命名為pMD 19T-ChimAP。

比如在學(xué)習(xí)初中數(shù)學(xué)《軸對(duì)稱圖形》這一知識(shí)點(diǎn)時(shí)，在實(shí)際教學(xué)中，教師可鼓勵(lì)學(xué)生結(jié)合之前積累的知識(shí)內(nèi)容，使用多媒體為學(xué)生展示蝴蝶、窗花、表盤等生活中常見(jiàn)的軸對(duì)稱圖形。在教學(xué)中，教師在展示這些圖形后，可以讓學(xué)生從數(shù)學(xué)角度探索軸對(duì)稱圖形的特點(diǎn)。同時(shí)在課堂中教師講解完軸對(duì)稱知識(shí)概念后，教師還可引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)一步思考，以體會(huì)數(shù)學(xué)藝術(shù)特征，并且感受到現(xiàn)實(shí)生活同數(shù)學(xué)知識(shí)間的聯(lián)系。通過(guò)這樣的教學(xué)設(shè)計(jì)，激發(fā)學(xué)生主動(dòng)思考的興趣，同時(shí)讓學(xué)生在探索過(guò)程中掌握軸對(duì)稱圖形的相同點(diǎn)。

1.2.1.2 構(gòu)建堿性磷酸酶表達(dá)載體

將流穿液上樣至平衡液（20 mmol·L-1Tris+50 mmol·L-1NaCl pH 7.5）平衡后的陰離子柱Q XK50柱，采用預(yù)洗液（20 mmol·L-1Tris + 200 mmol·L-1NaCl pH 7.5）預(yù)洗調(diào)零，洗脫液（20 mmol·L-1Tris+1 mol·L-1NaCl pH 7.5）洗脫，收集洗脫峰，采用SDS-PAGE 電泳與高壓液相色譜法（HPLC）檢測(cè)洗脫液中recAP蛋白。

（2）激光淬火前準(zhǔn)備 清洗缸筒工件表面的油污、雜質(zhì)等，并確保激光淬火部位表面外觀質(zhì)量；缸筒激光淬火部位表面粗糙度較高，表面均勻涂上SiO2激光吸光涂料，減小缸筒表面激光的發(fā)射來(lái)保證激光的吸收率；缸筒激光淬火前烘干涂層，為后續(xù)激光淬火做準(zhǔn)備；檢驗(yàn)設(shè)備的工作狀態(tài)，保證淬火過(guò)程中設(shè)備的正常運(yùn)行。

1.2.1.3 黑曲霉重組菌株的篩選及鑒定

取500 μL 農(nóng)桿菌AGL1 菌液制備農(nóng)桿菌感受態(tài)，取1 μL 重組質(zhì)粒DNA 加入農(nóng)桿菌感受態(tài)中，通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。選取少量多個(gè)單菌落為模板，使用引物glaA-sense 和glaA-antisense 作PCR鑒定，通過(guò)電泳檢測(cè)陽(yáng)性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子[12]。將獲得的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子與打碎的受體黑曲霉菌絲共培養(yǎng)并篩選，吸取生長(zhǎng)足量且良好菌絲，CTAB法提取其基因組DNA。以基因組DNA 為模板，利用糖化酶引物擴(kuò)增鑒定。以ddH2O為陰性對(duì)照，原始菌株基因組DNA 和對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)入的重組表達(dá)載體質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.1.4 CHO穩(wěn)定細(xì)胞株篩選及擴(kuò)大培養(yǎng)

取狀態(tài)良好CHO 細(xì)胞與20 μg 線性化載體（PvuⅠ酶切）及5 μL鮭魚(yú)精混勻后加入電轉(zhuǎn)杯，電擊轉(zhuǎn)化后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2個(gè)含10 mL培養(yǎng)液的Φ100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。24 h后更換含有適當(dāng)濃度G418的篩選培養(yǎng)基，48 h 后更換培養(yǎng)基，用G418 繼續(xù)篩選。待單細(xì)胞長(zhǎng)成集落斑點(diǎn)后，10 μL槍頭滑動(dòng)挑取至96 孔板。待細(xì)胞大致長(zhǎng)滿，換成無(wú)血清B001 培養(yǎng)基，24 h 后取培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋，磷酸苯二鈉比色法檢測(cè)堿性磷酸酶活性。選取檢測(cè)表達(dá)量相對(duì)較高的細(xì)胞克隆，轉(zhuǎn)移至24 孔板備份。傳代1～2 周后，檢測(cè)B001 24 h 表達(dá)量。選取高表達(dá)克隆2 次篩選，步驟同1 次篩序。經(jīng)2 次克隆篩選出高表達(dá)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)至T 25 中，比較獲得高表達(dá)克隆株，命名為CHO-recAP 細(xì)胞株。將CHO- recAP 細(xì)胞株作為收獲蛋白種子細(xì)胞系，擴(kuò)大培養(yǎng)至20 L 生物反應(yīng)器中，細(xì)胞活率低于80%時(shí)，收獲豐收液。

至于未來(lái)的40年會(huì)發(fā)生什么，我無(wú)從知道。但我唯一確定的是，在這場(chǎng)迄今人類最宏大、最能體現(xiàn)智慧光芒與勇氣膽識(shí)的艱難探索中，需要你，需要我，更需要每個(gè)自然資源人的努力。

1.2.1.5 目的蛋白純化

收獲豐收液3～5 L，采用4 750 r·min-1離心6 min，取離心上清液過(guò)濾，3 層濾膜孔徑分別為0.8、0.45、0.22 μm。采用Millipore 30 ku膜包將過(guò)濾后上清濃縮換液，置換液為陽(yáng)離子柱sp XK50平衡緩沖液。上樣至平衡液（20 mmol·L-1NaAc-HAc + 50 mmol·L-1NaCl pH 5.4）平衡后的陽(yáng)離子柱sp XK50，吸光值增大時(shí)收集流穿液。洗脫液（20 mmol·L-1NaAc-HAc+1 mol·L-1NaCl pH 5.4）洗脫陽(yáng)離子柱上雜蛋白。

構(gòu)建黑曲霉表達(dá)載體過(guò)程為：利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ對(duì)質(zhì)粒pMD 19T-ChimAP 雙酶切，回收基因片段；利用限制性內(nèi)切酶Nhe Ⅰ和HindⅢ對(duì)質(zhì)粒pSZH6R雙酶切，回收載體片段?；厥掌芜B接并轉(zhuǎn)化培養(yǎng)至產(chǎn)生抗性菌落。用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，正確的轉(zhuǎn)化子命名為pSZH-ChimAP。

1.2.2 recAP抗炎活性測(cè)定

1.2.2.1 堿性磷酸酶活性檢測(cè)

使用Tris-HCl（50 mmol·L-1，pH 7.0～8.0）緩沖液配制10 mmol ATP，稀釋recAP至0.5 U·mL-1。取950 μL recAP 和50 μL ATP 溶液混合均勻（溶液終濃度均為0.5 mmol），37 ℃孵育60 min。使用無(wú)機(jī)磷測(cè)試盒檢測(cè)不同pH 7.0～8.0 recAP 對(duì)ATP（0.5 mmol）釋放的游離磷Pi含量。釋放Pi與鉬酸作用生成磷鉬酸，磷鉬酸被還原為鉬藍(lán)，在660 nm處有最大吸收峰值。以上測(cè)定以65 ℃處理60 min 失活recAP作空白對(duì)照。

構(gòu)建CHO 表達(dá)載體過(guò)程為：用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和NotⅠ對(duì)質(zhì)粒pMD 19T-ChimAP 雙酶切，回收基因片段；利用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和NotⅠ對(duì)質(zhì)粒pMH3-PLAP雙酶切，回收載體片段?；厥盏膬善芜B接并轉(zhuǎn)化培養(yǎng)至產(chǎn)生抗性菌落，Eco RⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，正確的命名為pMH3-ChimAP。

使用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定堿性磷酸酶活性。磷酸苯二鈉在堿性條件下被堿性磷酸酶水解，形成游離酚和磷酸。在堿性條件下酚與氨基安替比林結(jié)合，并經(jīng)氧化生成深淺不一紅色醌式結(jié)構(gòu)物。在510 nm處檢測(cè)吸光值，通過(guò)比色分析計(jì)算堿性磷酸酶活性水平。1個(gè)活性單位定義為37 ℃下100 mL 待測(cè)樣品與磷酸苯二鈉作用15 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金式單位（U·L-1）。

在港口發(fā)展方面，江海聯(lián)動(dòng)、功能互補(bǔ)的港口服務(wù)體系初步形成。一批專業(yè)化、現(xiàn)代化水平較高的大型綜合性港區(qū)正在崛起，干線港口規(guī)?；?、集約化、專業(yè)化水平不斷提升，以南寧、貴港、梧州、肇慶、佛山等主要港口為核心的內(nèi)河港口體系逐步形成。截至2017年年底，珠江水系擁有生產(chǎn)用泊位2092個(gè)，港口年綜合通過(guò)能力超過(guò)6 億噸；貨物綜合通過(guò)能力超過(guò)1000 萬(wàn)噸的港口總數(shù)達(dá)11個(gè)。

1.2.2.2 重組人腸堿性磷酸酶測(cè)定LPS滅活效果

使用Tris-HCl（50 mmol·L-1，pH 7.4）緩沖液將recAP 稀釋為50 U·mL-1。生理pH 7.4 條件下，recAP（酶活為1、5、10 U·mL-1）與LPS（5 ng·mL-1）37 ℃孵育3 h，通過(guò)鱟試劑顯色法測(cè)定545 nm處吸光值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比確定LPS含量。以上測(cè)定以65 ℃下處理60 min失活的recAP作空白對(duì)照。

1.2.2.3 磷鉬酸法測(cè)定ATP游離磷釋放量

用ZMD-2型電子密度計(jì)，采用排水法測(cè)量燒結(jié)試樣的燒結(jié)密度；用Leica DM4000型顯微鏡，對(duì)燒結(jié)試樣的橫截面進(jìn)行孔隙度測(cè)試；用DM400M型金相顯微鏡，對(duì)燒結(jié)試樣進(jìn)行顯微組織分析；用HR-150A型洛氏硬度計(jì)，測(cè)量試樣的硬度(HRB)．

1.2.2.4 人靜脈血白細(xì)胞分離

健康志愿者共6 人，男女各半，年齡26±5歲，經(jīng)長(zhǎng)春嘉和外科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和本人同意。本研究采用糖密度梯度離心法，使用人靜脈血白細(xì)胞分離試劑盒分離靜脈血中白細(xì)胞。常溫下采集人靜脈血1 800 r·min-1離心25 min，吸取單核細(xì)胞層（淋巴細(xì)胞和少部分單核細(xì)胞）和多核細(xì)胞層（中性粒細(xì)胞為主）混合，充分裂解紅細(xì)胞，反復(fù)清洗2次，用3 mL 含10%FBS 的1 640培養(yǎng)基重懸。采用白細(xì)胞分類染色液染色觀察細(xì)胞形態(tài)，調(diào)整密度至1×106cell·mL-1，備用。每次采集不同志愿者的血液排除個(gè)體差異，確保試驗(yàn)可重復(fù)，至少重復(fù)3人。

1.2.2.5 人白細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（HUVECs）用含有10%FBS 的DMEM/F 12 培養(yǎng)基37 ℃貼壁培養(yǎng)，胰蛋白酶消化懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105cell·mL-1。每孔加入細(xì)胞100 μL，接種于96 孔板，37 ℃培養(yǎng)24 h。試驗(yàn)當(dāng)天，將新鮮提取的人靜脈血白細(xì)胞加入單層培養(yǎng)的HUVECs 96 孔板中，建立白細(xì)胞和HUVECs模型。試驗(yàn)完成后，新鮮提取另一人靜脈血白細(xì)胞重復(fù)試驗(yàn)，確保結(jié)果可重復(fù)。

預(yù)先將recAP（5 U·mL-1）與LPS（0.5 ng·mL-1）提前孵育3 h后加入細(xì)胞培養(yǎng)物中刺激白細(xì)胞。37 ℃培養(yǎng)24 h 后，收集上清液，檢測(cè)TNF-α 蛋白水平。低濃度（0.10、0.25、0.50 μmol）腺苷被加入白細(xì)胞和HUVEC 細(xì)胞模型，24 h 后收集培養(yǎng)上清，確定TNF-α 水平。使用ELISA測(cè)定試劑盒（TNF-α Elisa 試劑盒，R＆D system，DY210）測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α。有關(guān)特定方法和步驟參閱制造商說(shuō)明。

1.2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graph prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件作t檢驗(yàn)比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組人腸堿性磷酸酶表達(dá)

2.1.1 ChimAP基因克隆

以pMD 19T-AP質(zhì)粒為模板基因片段。連接轉(zhuǎn)化后，大腸桿菌轉(zhuǎn)化子雙酶切鑒定。測(cè)序正確質(zhì)粒命名為pMD 19T-ChimAP（見(jiàn)圖1）。

圖1 基因ChimAP PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of genes ChimAP

2.1.2 堿性磷酸酶表達(dá)載體構(gòu)建

話是這么說(shuō)，那天我還是生氣了。一想到佟老板的飛揚(yáng)跋扈，我就氣不打一處來(lái)。佟老板的話聽(tīng)著文質(zhì)彬彬，細(xì)想全是無(wú)賴話。

根據(jù)山西省工業(yè)布局和區(qū)域經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展對(duì)水資源需求的緊迫程度，“十二五”期間先期開(kāi)工四大骨干工程：一是從清漳河和濁漳河調(diào)水連接汾河，解決晉中南部盆地的祁縣、太谷、平遙、靈石、介休等5個(gè)縣用水需求的東山供水工程；二是由漳河辛安泉向長(zhǎng)治盆地郊區(qū)、平順、屯留、黎城等8個(gè)區(qū)縣調(diào)水的辛安泉引水工程；三是解決國(guó)家集中貧困區(qū)呂梁革命老區(qū)4市16縣供水問(wèn)題的中部引黃工程；四是小浪底向運(yùn)城盆地涑水河流域的調(diào)水工程，解決運(yùn)城鹽湖、聞喜、絳縣、夏縣、垣曲5個(gè)區(qū)縣的用水問(wèn)題。

用XbaⅠ和Hind Ⅲ鑒定黑曲霉表達(dá)載體pSZHChimAP 時(shí)，電泳結(jié)果顯示1 500 bp，15 000 bp 片段，下一步通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入黑曲霉鑒定，如圖2A 所示。同理，用Eco RⅠ和NotⅠ鑒定CHO表達(dá)載體pMH3-ChimAP時(shí)，電泳結(jié)果顯示出1 500、8 453 bp 片段，下一步轉(zhuǎn)入CHO 細(xì)胞中篩選，如圖2B所示。

圖2 表達(dá)載體鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of expression vectors

2.1.3 重組黑曲霉菌株篩選及鑒定

圖3a 結(jié)果表明，表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入并獲得含重組質(zhì)粒農(nóng)桿轉(zhuǎn)化子。將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子與黑曲霉共培養(yǎng)并篩選，吸取足量菌絲，提取其基因組DNA。用PCR 鑒定同源重組轉(zhuǎn)化子，結(jié)果見(jiàn)圖3B和C，未獲得含堿性磷酸酶基因重組菌株。

2.1.4 CHO穩(wěn)定株篩選及擴(kuò)大培養(yǎng)

線性化pMH3-ChimAP 轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞，G418加壓篩選5～8 d后挑取單克隆至96孔板。待長(zhǎng)滿后挑取表達(dá)量高的轉(zhuǎn)入24 孔板，經(jīng)一段時(shí)間傳代后檢測(cè)表達(dá)量。挑選6 個(gè)表達(dá)量高的克隆二次篩選，步驟同1次。將24孔板中培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基表達(dá)24 h，最終獲得5株表達(dá)量高且穩(wěn)定的高純度細(xì)胞克隆，分別為：B8A11、B8A12、G5D10、D8A1、G5A1，酶 活 分 別 為904.072、887.221、988.327、849.307、847.200 U·mL-1。從24 孔板擴(kuò)培至T25中，凍存細(xì)胞。繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)收液。具體篩選流程如圖4所示。

圖3 重組黑曲霉轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物酶切鑒定（HindⅢ）Fig.3 Identification of PCR products by enzyme digestion（HindⅢ）

圖4 穩(wěn)定株篩選流程與結(jié)果Fig.4 Result of the stable CHO cells after selection

2.1.5 目的蛋白純化及活性檢測(cè)

所選取患者在治療過(guò)程中均未出現(xiàn)嚴(yán)重不良癥狀,觀察組中有1例患者出現(xiàn)惡心癥狀,所占比例為2.50%,對(duì)照組中有1例患者出現(xiàn)惡心癥狀,1例患者出現(xiàn)頭痛癥狀,所占比例為5.00%,兩組數(shù)據(jù)沒(méi)有明顯差異存在(X2=0.866,P=0.352)。

圖5 蛋白SDS-PAGE檢測(cè)Fig.5 SDS-PAGE detection of recAP

圖6 蛋白HPLC檢測(cè)Fig.6 HPLC detection of recAP

2.2 堿性磷酸酶抗炎活性研究

2.2.1 堿性磷酸酶對(duì)LPS活性的影響

而且今年，我們還很高興邀請(qǐng)到了專攻新西蘭葡萄酒的專家，劉玲女士輔助David作翻譯講解。David的專業(yè)講解，劉玲老師在翻譯之余也時(shí)不時(shí)拋出自己的經(jīng)驗(yàn)和種種干貨，讓參與嘉賓贊聲連連。也難怪有嘉賓表示：“內(nèi)容很多干貨?？吹贸龃髱熯x酒很用心。每款酒都能代表產(chǎn)區(qū)特色、品種風(fēng)格，哪怕是同樣品種，不同酒款的特色也很鮮明，讓我們深入感受到，個(gè)性新西蘭，何止長(zhǎng)相思。”

2001-2012年海南省入境旅游者人均天消費(fèi)總體呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，增長(zhǎng)了30.03美元，排名從第二十五名上升至第二十名。人均天消費(fèi)與全國(guó)平均值差距越來(lái)越小，縮小了9.3美元。其中外國(guó)游客人均天消費(fèi)增長(zhǎng)了20.9美元，港澳臺(tái)游客人均天消費(fèi)增長(zhǎng)了146.6美元。同時(shí)，港澳臺(tái)游客人均天消費(fèi)的增長(zhǎng)量大于外國(guó)游客，約是外國(guó)游客的5倍。其12年間增長(zhǎng)的速度也比外國(guó)游客增長(zhǎng)的速度快，增長(zhǎng)了8.65%。海南省入境旅游者人均天消費(fèi)構(gòu)成中，長(zhǎng)途交通所長(zhǎng)比重較大。2012年海南省入境旅游者人均天消費(fèi)主要在提高層次方面的消費(fèi)，在購(gòu)物和娛樂(lè)方面消費(fèi)較多，說(shuō)明海南省旅游業(yè)發(fā)展越來(lái)越健康。

37 ℃孵育3 h 后，recAP（1 U·mL-1）使LPS（5 ng·mL-1）活力降低30%左右。recAP（5 U·mL-1）使LPS 活力降低40%左右。recAP（10 U·mL-1）使LPS 活力降低60%左右。結(jié)果表明recAP 為劑量依賴型有效滅活內(nèi)毒素，如圖7所示。

圖7 內(nèi)毒素活性檢測(cè)Fig.7 Detection of LPS activity

2.2.2 建立人白細(xì)胞TNF-α模型

在船閘建設(shè)方面，長(zhǎng)洲樞紐三線四線船閘、老口樞紐船閘、桂平樞紐二線船閘、邕寧樞紐船閘的建成運(yùn)行，打通了上游關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。其中，三線四線船閘投用后，長(zhǎng)洲樞紐船閘總通過(guò)能力提升至1.36億噸（單向），成為世界上通過(guò)能力最大的單級(jí)船閘。此外，龍灘水電站、百色樞紐通航設(shè)施建設(shè)取得新突破，有望在“十三五”期間開(kāi)工建設(shè)。

使用增加劑量的LPS（0.05、0.10、0.50 ng·mL-1）刺激人白細(xì)胞和HUVECs 細(xì)胞，24 h 后收集培養(yǎng)液上清，檢測(cè)TNF-α 水平。LPS 可刺激TNF-α 分泌水平呈劑量依賴型增加，表明成功建立低濃度LPS 刺激人白細(xì)胞TNF-α 模型，結(jié)果如圖8所示。

圖8 人白細(xì)胞TNF-α 模型建立Fig.8 Establishment of human leukocyte TNF-α model

2.2.3 堿性磷酸酶對(duì)白細(xì)胞分泌TNF-α的影響

與空白組相比，0.5 ng·mL-1LPS明顯增加TNF-α分泌。recAP 明顯抑制LPS 誘導(dǎo)的人白細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生。在LPS 不存在情況下，recAP 也明顯抑制TNF-α 產(chǎn)生，結(jié)果如圖9 所示。以上結(jié)果表明，recAP酶反應(yīng)基質(zhì)不只LPS一種。

圖9 堿性磷酸酶對(duì)TNF-α 的影響Fig.9 Effect of alkaline phosphatase on TNF-α

2.2.4 堿性磷酸酶使ATP去磷酸化

在pH 7.0～8.0 時(shí)，recAP 有效使ATP 脫磷，脫磷作用存在pH 依賴。ATP 經(jīng)recAP 脫磷后產(chǎn)生終產(chǎn)物腺苷，結(jié)果如圖10所示。

圖10 游離磷釋放量檢測(cè)Fig.10 Detection of free phosphatase

2.2.5 腺苷對(duì)白細(xì)胞分泌TNF-α的影響

與空白組相比，腺苷明顯抑制生理狀態(tài)下人白細(xì)胞TNF-α 產(chǎn)生，證明recAP通過(guò)使ATP脫磷產(chǎn)生腺苷間接抑制TNF-α 釋放，結(jié)果如圖11所示。

圖11 腺苷對(duì)TNF-α的影響Fig.11 Effect of adenosine on TNF-α

3 討 論

目前嵌合型人堿性磷酸酶基因ChimAP（人胎盤堿性磷酸酶耐熱部分+人腸道堿性磷酸酶活性部分）基因在黑曲霉中表達(dá)尚無(wú)報(bào)道。研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與黑曲霉共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)黑曲霉生長(zhǎng)速度緩慢，最終未獲得含ChimAP的黑曲霉重組菌株。由于堿性磷酸酶為一種非特異性脫磷酶，推測(cè)AP 可能影響黑曲霉生長(zhǎng)相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路。CHO 細(xì)胞為目前最常用的生產(chǎn)治療蛋白的哺乳動(dòng)物宿主。研究利用電穿孔法將ChimAP轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞，篩選5個(gè)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，但表達(dá)量較低，后續(xù)研究會(huì)加大篩選效率，提高產(chǎn)量[13]。經(jīng)20 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)14 d后獲得豐收液，豐收液過(guò)濾純化后獲得recAP酶活為140 125 U·L-1，比活性為578 U·mg-1。CHO細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的recAP可呈劑量依賴型滅活LPS[14]。

Peters等利用腎上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)recAP減輕LPS誘導(dǎo)體外炎癥反應(yīng)[15]。研究建立人白細(xì)胞和HUVECs分泌炎癥因子TNF-α 抗炎生物活性模型[16]，發(fā)現(xiàn)recAP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的人白細(xì)胞TNF-α分泌有明顯抑制作用，與Peters等研究結(jié)果接近。但研究發(fā)現(xiàn)在LPS 不存在情況下，recAP 仍有明顯抑制作用，表明recAP 對(duì)人白細(xì)胞TNF-α抑制作用不僅通過(guò)LPS，還通過(guò)其他底物。體內(nèi)外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腺苷抑制LPS 誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生[17]。研究發(fā)現(xiàn)在LPS 不存在情況下，腺苷呈劑量依賴型抑制人白細(xì)胞TNF-α。表明ATP為recAP靶向底物之一，其脫磷終產(chǎn)物腺苷發(fā)揮抗炎作用。除ATP外，recAP還可能通過(guò)其他基質(zhì)脫磷產(chǎn)生抑制人白細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α作用，推測(cè)包括細(xì)胞核酸DNA 和RNA 降解產(chǎn)物。以上基質(zhì)的脫磷終產(chǎn)物均可能為recAP 脫磷底物，并參與recAP對(duì)TNF-α 分泌的抑制作用。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)篩選出一株穩(wěn)定表達(dá)recAP 的CHO 細(xì)胞株。經(jīng)生物反應(yīng)器生產(chǎn)和豐收液純化后，獲得recAP 純度為92.45%，比活性為578 U·mg-1，有效滅活LPS。recAP在生理pH范圍內(nèi)對(duì)ATP去磷酸化作用顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明recAP對(duì)TNF-α分泌的抑制作用不依賴LPS，除LPS外還通過(guò)ATP去磷酸化產(chǎn)生腺苷抑制人白細(xì)胞炎癥因子TNF-α 分泌。本研究可擴(kuò)大recAP 臨床應(yīng)用范圍，建立非LPS依賴的recAP抑制人白細(xì)胞TNF-α 產(chǎn)品活性測(cè)定方法。