核轉(zhuǎn)錄因子Sp1在手術(shù)創(chuàng)傷后腹膜組織中的活性改變與腹膜粘連形成關(guān)系探討

陳立堂，陳勇平

（廣東省惠東縣人民醫(yī)院1急診科，2普通外科，廣東 惠州516300）

腹部外科手術(shù)極易引發(fā)術(shù)后腹膜粘連形成，通常情況下會引發(fā)疼痛、腸梗阻等，同時使再次手術(shù)的難度增加［1-2］。目前，臨床尚未清楚腹膜粘連形成的分子機(jī)制。在纖維化過程中，核轉(zhuǎn)錄因子Sp1在膠原的合成與表達(dá)啟動中發(fā)揮著極為重要的作用［3］。本研究探討核轉(zhuǎn)錄因子Sp1在手術(shù)創(chuàng)傷后腹膜組織中的活性改變與腹膜粘連形成關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年8月至2019年8月我院收治的直腸癌手術(shù)患者108例，分為正常腹膜組 （開腹后第一時間將腹膜組織從切口左側(cè)2.0 cm處銳性切?。┖蛣?chuàng)傷腹膜組 （手術(shù)后將腹膜組織從切口右側(cè)2.0 cm處銳性切?。拷M各54例。組織獲取后第一時間保存在液氮中備用。正常腹膜組中男34例，女20例，年齡26～85歲，平均 （55.6±9.4）歲。創(chuàng)傷腹膜組中男33例，女21例，年齡27～85歲，平均 （56.2±9.8）歲。兩組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。

1.2 方法①腹膜組織核蛋白提取與Sp1探針標(biāo)記：依據(jù)美國PIERCE公司生產(chǎn)的NE-PERTM核蛋白抽提試劑盒方法將各組腹膜組織中的核蛋白提取出來，運用Bradford法對核蛋白濃度進(jìn)行測定，然后在-70℃的溫度下分裝保存?zhèn)溆?。依?jù)加拿大GENEKA公司生產(chǎn)的Sp1 NUSHIFT檢測試劑盒對Sp1雙鏈寡核苷酸探針進(jìn)行標(biāo)記，T4多核苷酸激酶作用下用 ［γ-32P］ATP對其5'端進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)MicroSpinTMG25分離柱純化后對探針放射活性進(jìn)行測定。②腹膜組織核轉(zhuǎn)錄因子Sp1的DNA結(jié)合活性與特異性檢測：依據(jù)加拿大GENEKA公司生產(chǎn)的Sp1 NUSHIFT檢測試劑盒，將 4 μL DNA結(jié)合緩沖液 ＋10 μg核蛋白提取物加入0.5 mL Eppendorf管中，在4℃的溫度下進(jìn)行20 min的孵育，將1 μL已標(biāo)記寡核苷酸雙鏈探針加入其中，在4℃的溫度下繼續(xù)進(jìn)行20 min的孵育，將4 μL加樣緩沖液加入其中，混勻，加樣。同時進(jìn)行Sp1特異性競爭抑制實驗，兩組均設(shè)立特異性對照檢測，一組將50倍未標(biāo)記變異寡核苷酸探針加入，另一組將50倍未標(biāo)記特異寡核苷酸探針加入，在非變性聚丙烯酰胺凝膠60 g／L中進(jìn)行2 h電泳，電壓為180 V，干膠，放射自顯影。采用Bandscan分析軟件測定電泳條帶灰度，計算平均光密度 （A）。核轉(zhuǎn)錄因子活性用各條帶A值表示。③腹膜組織的Masson染色：常規(guī)石蠟切片腹膜組織，脫蠟入水，用天青石溶液對細(xì)胞核進(jìn)行20 min染色，Masson紅染液10 min，后水洗，10 mL醋酸水溶液1 min，5 g／L亮綠，鏡下變綠后以較快的速度脫水、透明、封片。

1.3觀察指標(biāo)觀察兩組手術(shù)后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h的Sp1活性，Sp1抑制性競爭實驗，腹膜組織的膠原纖維變化。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，計量資料 （±s）采用t檢驗，計數(shù)資料 （%）采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組腹膜組織中Sp1活性比較創(chuàng)傷腹膜組手術(shù)后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h的Sp1活性逐漸升高 （P＜0.05），且均顯著高于正常腹膜組 （P＜0.05）。見表1。

表1 兩組腹膜組織中Sp1活性比較 （±s）

表1 兩組腹膜組織中Sp1活性比較 （±s）

注：與正常腹膜組比較，*P＜0.05。

手術(shù)后3 h指標(biāo)手術(shù)后3 0 m i n手術(shù)后1 h手術(shù)后2 h創(chuàng)傷腹膜組 （n=5 4） 正常腹膜組（n=5 4）手術(shù)后4 h S p 1 活性 6 1.1±1 1.5*8 8.3±1 5.7*1 0 4.5±1 5.2*1 2 2.3±2 7.0*1 3 4.5±1 8.3*3 1.1±5.2

2.2 Sp1抑制性競爭實驗50倍未標(biāo)記特異寡核苷酸完全抑制第3泳道，無條帶；50倍未標(biāo)記變異寡核苷酸未抑制第4泳道，較第1泳道、第2泳道有結(jié)合的特異性 （圖1）。

圖1 Sp1抑制性競爭實驗

2.3 腹膜組織的膠原纖維變化轉(zhuǎn)錄因子Sp1隨著手術(shù)創(chuàng)傷時間的延長被活化，手術(shù)后30 min腹膜組織中具有較厚的膠原層、較為粗大的纖維細(xì)胞、紊亂的排列，膠原纖維增生 （圖2）。

3 討論

Sp1歸屬于 Sp特異性蛋白／Kr-uppel樣因子 （Sp／SKLF）轉(zhuǎn)錄因子家族，在所有被克隆因子中被克隆時間最早，形成途徑為3個保守Cys2His2鋅指特異結(jié)合［4］。轉(zhuǎn)錄因子DNA連接區(qū)域在3個鋅指的作用下形成，臨床普遍認(rèn)為，Sp1對所有基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行控制的途徑為通過GT或GC盒調(diào)節(jié)［5］。相關(guān)抑制腹膜粘連形成的研究［6］中，運用凝膠電泳遷移率改變分析法對人腹膜組織中手術(shù)創(chuàng)傷后不同時間的Sp1表達(dá)水平進(jìn)行了測定，以期為Sp1的特異性調(diào)控提供一定的理論依據(jù)，發(fā)現(xiàn)腹膜粘連形成一定程度上受到核轉(zhuǎn)錄因子Sp1活化的影響。

圖2 腹膜組織膠原Masson染色 （×200）

本研究結(jié)果顯示，創(chuàng)傷腹膜組手術(shù)后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h的Sp1活性逐漸升高 （P＜0.05），且均顯著高于正常腹膜組 （P＜0.05）。50倍未標(biāo)記特異寡核苷酸完全抑制第3泳道，無條帶；50倍未標(biāo)記變異寡核苷酸未抑制第4泳道，較第1泳道、第2泳道有結(jié)合的特異性。本結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子Sp1隨著手術(shù)創(chuàng)傷時間的延長被活化，手術(shù)后30 min腹膜組織中具有較厚的膠原層、較為粗大的纖維細(xì)胞、紊亂的排列，膠原纖維增生，與上述研究［6］結(jié)果一致。

綜上所述，核轉(zhuǎn)錄因子Sp1在手術(shù)創(chuàng)傷后腹膜組織中的活化會在一定程度上引發(fā)腹膜粘連形成，值得臨床充分重視。