硫辛酸衍生物的制備與活性研究進(jìn)展

孫騰 徐劉佳 鄭明明

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所 油料脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)湖北省重點實驗室 油料油脂加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室 農(nóng)業(yè)部油料作物 生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，武漢 430062）

α-硫辛酸（Lipoic acid，LA），一種具有生物活性的天然產(chǎn)物，屬于B 族維生素。在動物腎臟和肝臟中含量較高［1］。α-硫辛酸為封閉的二硫五元環(huán)結(jié)構(gòu)，電子云密度較大，使其具有很強(qiáng)的抗氧化性。此外，硫辛酸還具有抗糖化，強(qiáng)化肝，抗衰老等功能［2-4］，具有較高的醫(yī)用價值和保健功能［5-6］。硫辛酸具有光熱不穩(wěn)定性，常溫下易分解，且在油、水中溶解度不高的特點［7］，導(dǎo)致其生物利用度低，限制了其在食品等行業(yè)的應(yīng)用。通過大量的研究發(fā)現(xiàn)，硫辛酸經(jīng)過分子改造可以解決溶解性和生物利用率低的問題，且獲得的硫辛酸衍生物有著比硫辛酸更強(qiáng)的生理活性，因此利用一些具有生物活性的化合物對硫辛酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾成為一種趨勢（圖1）［8］。

目前有關(guān)硫辛酸的綜述，更多集中于α-硫辛酸自身的合成及應(yīng)用［9-10］，有關(guān)硫辛酸衍生物的合成及其活性方面的報道較少，基于以上原因，本文將對近幾年國內(nèi)外有關(guān)硫辛酸衍生物的生物和化學(xué)合成及其活性的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，對拓展硫辛酸衍生物的應(yīng)用領(lǐng)域提供理論指導(dǎo)。

圖1 硫辛酸及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)［11-15］

1 硫辛酸衍生物的制備方法

1.1 生物轉(zhuǎn)化法

生物轉(zhuǎn)化是指利用生物有機(jī)體（組織、細(xì)胞、細(xì)胞器）或酶作為催化劑對外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾生成有價值產(chǎn)物的過程，也稱為生物催化［16］。利用生物轉(zhuǎn)化法對硫辛酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾合成具有多種功能特性的新化合物，可以避免有機(jī)合成中對保護(hù)基的使用，降低反應(yīng)成本，提高產(chǎn)物的收率，現(xiàn)已成為開發(fā)硫辛酸衍生物的有效途徑。研究者們利用生物酶法制備出了多種新型硫辛酸結(jié)構(gòu)酯，通過結(jié)構(gòu)改造可以解決由于硫辛酸化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的生物利用度低的問題。

1.1.1 米黑根毛霉脂肪酶 Lipozyme RMIM 為來源于米黑根毛霉脂肪酶固定化在陰離子交換樹脂上的固定化脂肪酶。Kaki 等［11］以摩爾比為1∶30 的1，2-二油酰基-sn-丙三基-3-膽堿磷和硫辛酸作為底物，來自熱霉菌（Lipozyme TLIM）、南極洲假絲酵母（CALB）和根莖霉（Lipozyme RMIM）的固定化脂肪酶為催化劑，含5%半胱氨酸的甲苯為溶劑，在受控的水活度下通過酯交換反應(yīng)，進(jìn)行新型化合物的合成。反應(yīng)在熱振蕩器（650 r/min，25℃）上進(jìn)行，用柱色譜對粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到的白色固體，即為新化合物1-硫酰基-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿（LPPC）。在所有被測脂肪酶中，RMIM 表現(xiàn)出最好的催化選擇性和催化活性。反應(yīng)在酶濃度為75 mg/mL，水活度為0.11 的條件下反應(yīng)96 h，實現(xiàn)97%的原料轉(zhuǎn)化，

形成73%的目標(biāo)產(chǎn)物（LPPC）和24%的次產(chǎn)物（lyso PC）。LPPC 是兩種生物活性分子的智能組合，在營養(yǎng)保健品、化妝品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有潛在的 應(yīng)用。

1.1.2 褶皺假絲酵母脂肪酶 Wang 等［12］以硫辛酸和植物甾醇為底物，固定化于大孔丙烯酸樹脂的南極洲假絲酵母脂肪酶B，固定在二氧化硅顆粒上的米曲霉脂肪酶TLIM，固定化在陰離子交換樹脂上的米黑根毛霉脂肪酶RMIM，褶皺假絲酵母脂肪酶CRL 為催化劑，2-甲基-2-丁醇/正己烷為反應(yīng)溶劑，首次成功建立了植物甾醇硫辛酸酯的酶法制備方法。其中，CRL 具有較高的催化能力，在植物甾醇占比150 mmol/L，硫辛酸甾醇比2.5∶1，酶的添加量60 g/L 的條件下，96h達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率71.2%。通過質(zhì)譜（MS），傅立葉變換紅外（FTIR）和核磁共振（NMR）確定了最終產(chǎn)物豆甾醇硫辛酸酯的結(jié)構(gòu)。

1.1.3 南極假絲酵母脂肪酶 Novozym 435 是來源南極假絲酵母B（Candida Antarctica B）的固定化脂肪酶。Hsieh 等［17］成功篩選出Nov435 作為合成海藻糖酯的最佳生物催化劑。在底物摩爾比1∶4（海藻糖∶硫辛酸），硫辛酸（0.03 mmol/d），反應(yīng)溫度40℃，總酶活性3 000 PLU（月桂酸丙酯單位）和共溶劑比4∶1（二甲基亞砜∶2-甲基-2-丁醇）的條件下反應(yīng)4 d，海藻糖硫辛酸酯的轉(zhuǎn)化率達(dá)到75.9±1.9%。分離純化后，用核磁共振法確定了硫辛酸的羧基與海藻糖C6羥基的連接。生成的海藻糖硫辛酸酯具有比硫辛酸高2.5 倍的抗氧化活性，在未來治療神經(jīng)損傷疾病或營養(yǎng)應(yīng)用方面，可能比硫辛酸具有更大的應(yīng)用潛力；Kontham 等［18］以硫辛酸和不同的醇（十八醇、肉豆蔻醇、油醇、3，5，5-三甲基己醇、1，8-丙二醇、1，10-癸二醇）為底物，二氯甲烷為溶劑，Nov435（15%基于底物的總重量）為催化劑，加入半胱氨酸（0.5%）抑制硫辛酸的聚合。將反應(yīng)混合物在25℃的氮氣氣氛下攪拌12 h。粗品經(jīng)正己烷∶乙酸乙酯（90∶10，V/V）硅膠柱層析純化得到相應(yīng)的硫辛酸酯（收率范圍90%-95%）。合成路線溫和高效，收率高（表1）。

表1 酶法修飾的主要條件參數(shù)

1.2 化學(xué)合成法

1.2.1 4-二甲氨基吡啶（DMAP）催化酯化法 DM- AP（4-二甲氨基吡啶）結(jié)構(gòu)上給電子的二甲氨基基團(tuán)與作為母環(huán)的吡啶環(huán)之間產(chǎn)生共軛作用，能激活環(huán)上的氮原子進(jìn)行親核取代，從而顯著地加速一些高位阻化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)程［22］，近幾年廣泛用作化學(xué)合成的新型催化劑。Madawala 等［23］以DMAP 為催化劑，EDCI 為縮合劑，在0℃下將摩爾比為1∶1 的甘油二酯和硫辛酸溶解在二氯甲烷中，室溫下攪拌過夜。隨后，將反應(yīng)混合物萃取干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，通過色譜法純化，得到產(chǎn)率80%的1，3-二油酰基-2-硫辛?；?sn-甘油和產(chǎn)率70%的1，3-二油酰基-2-二氫硫辛?；?sn-甘油。RP-HPLC-MS-APCI 分析顯示不同組分之間具有良好的分離；Madawala 等［24］又以DMAP 為催化劑，EDCI 為縮合劑，二氯甲烷為溶劑，在室溫的條件下將摩爾比為1∶1.2 的植物甾醇和硫辛酸在氮氣氣氛下攪拌溶解，混合物與鹽酸酸化后，用二氯甲烷萃取得到硫辛酸甾醇酯，采用薄層色譜法對產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化，分別得到收率為60%的硫辛酸甾醇酯和80%的二氫硫辛酸酯；段良興等［25］以α-硫辛酸和氨基丁苯酞為原料，EDCI和DMAP 為催化劑，在二氯甲烷介質(zhì)中反應(yīng)4-10 h，經(jīng)無水硫酸鎂干燥后得到了10 個硫辛酸類衍生物，收率均在77%以上。

1.2.2 二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）催化縮合法 DCC在化學(xué)反應(yīng)中常被用作偶聯(lián)試劑?？梢詰?yīng)用于酰胺和酯化反應(yīng)中。DCC 加速酯化反應(yīng)的機(jī)制是硫辛酸羧基結(jié)構(gòu)上的氧原子進(jìn)攻DCC 分子中間的碳原子，使DCC 結(jié)合在羧基上，進(jìn)而形成一種活性酯結(jié)構(gòu)，這使得醇或酚上羥基的親核進(jìn)攻變得較為容易進(jìn)行。DCC 催化反應(yīng)的成本低且產(chǎn)率高，但產(chǎn)生的副產(chǎn)物難以除去，限制了它的應(yīng)用［26］。Melagraki 等［13］以香豆素和硫辛酸為底物，N-羥基苯并三唑（HOBt）和N，N 二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）為縮合劑，進(jìn)行官能化衍生物的構(gòu)建。使用n-羥基琥珀酰亞胺和DCC 對外消旋的硫辛酸在二氯甲烷中進(jìn)行活化，得到N-（脂氧基）-琥珀酰亞胺酯。將摩爾比為1∶1的香豆素-3-氨基碳酰亞胺和N-（脂氧基）-琥珀酰亞胺酯混合于二氯甲烷中，滴加二甲基甲酰胺促進(jìn)反應(yīng)物溶解。將混合物于避光條件下攪拌過夜。然后加入水、二氯甲烷萃取，將有機(jī)萃取物用硫酸鈉進(jìn)行干燥，在真空環(huán)境下濃縮，得到新型香豆素硫辛酸酯，其最高產(chǎn)率達(dá)到79%。Lahiani 等［14］以DCC 為脫水劑，二氯甲烷為溶劑，α-硫辛酸和4-羥基2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基為底物，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌48 h。采用真空過濾去除沉淀的副產(chǎn)物DCU，減壓蒸發(fā)溶劑。將固體溶解在熱乙醇中，在4℃下放置24 h。得到產(chǎn)率為73%的硫辛酸衍生物（表2）。

表2 化學(xué)法修飾的主要條件參數(shù)

2 生物活性

2.1 抗氧化活性

硫辛酸結(jié)構(gòu)中的二硫五元環(huán)是活性區(qū)域，電荷密度大，可以螯合金屬離子，二硫鍵較長且解離焓和電離勢小，可以與自由基反應(yīng)形成陽離子自由基，從而發(fā)揮抗氧化作用。硫辛酸進(jìn)入細(xì)胞后，其二硫鍵可以被多種酶還原生成二氫硫辛酸，兩者可以共同發(fā)揮抗氧化作用［1，31］。研究表明，對α-硫辛酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，不僅可以解決其生物利用度低的問題，反應(yīng)生成的衍生物還具有良好的抗氧化活性。

2.1.1 清除自由基活性 張露云等［32］以硫辛酸為原料，DCC 和DMAP 為縮合劑合成了23 個硫辛酸酯類衍生物。生物活性測試結(jié)果表明，大部分衍生物對丙烯醛、1，1-二苯基-2-苦肼基和羥基自由基等均具有良好的抑制作用。其中硫辛酸丙酯3h對丙烯醛的清除率達(dá)到96.6%，清除活性高于對照品肌肽，硫辛酸己酯對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的清除率達(dá)到64.9%，清除活性接近于對照品喹諾二甲基丙烯酸酯和維生素 C，對羥基自由基的清除率達(dá)到99.9%，清除活性高于對照品維生素E 水溶性類似物（Trolox）。Wang 等［12］采用化學(xué)法合成了植物甾醇硫辛酸酯，評估了植物油脂中植物甾醇硫辛酸酯的溶解度和抗氧化能力等物理化學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，二氫硫辛酸甾醇酯（EC50=0.43）的抗氧化作用與阿魏酸相似（EC50=0.43），但低于抗壞血酸（EC50=0.27）和α-生育酚（EC50=0.25）。Madawala 等［23］首次規(guī)模合成1，3-二油?；?2-硫辛?；?sn-甘油（產(chǎn)率80%）和1，3-二油?；?2-二氫硫辛酰基-sn-甘油（產(chǎn)率70%）。DPPH 自由基清除實驗表明，硫辛酸與DPPH 在摩爾比為8 的條件下，DPPH 自由基剩余率達(dá)到98.2%。同樣的實驗條件下，1，3-二油?；?2-硫辛酰基-sn-甘油（DHLA）與DPPH 摩爾比為1 的情況下，DPPH 殘留率僅為14.4%，而1，3-二油?；?2 二氫硫辛酰基-sn-甘油（DODHLA）僅為6.4%。結(jié)果顯示出1，3-二油?；?2-二氫硫辛?；?sn-甘油（EC50=0.21 mol/L）具有非常高的體外自由基清除能力。

2.1.2 抗脂質(zhì)過氧化 Kaki 等［20］采用化學(xué)-酶法，以6 種天然酚醛樹脂和α-硫辛酸為底物，合成了6種具有潛在生物活性的新型酯。新型酯的分子量較低，氫鍵受體，氫鍵供體，羥基和甲氧基的數(shù)量較少，表明分子具有良好的吸收和滲透性以及較高的生物利用度。對合成的化合物進(jìn)行了抗氧化活性評價。分別用DPPH 法和TBARS 測定了新型酯和商業(yè)抗氧化劑（作為對照）的自由基清除活性和在魚油乳液體系中的抗氧化活性。兩個方法結(jié)果均顯示化合物2-（3，4-二羥基苯基乙基）-5-（1，2-二硫雜環(huán)戊烷-3-基）戊酸酯表現(xiàn)出最高活性，其自由基清除活性（90.92±0.08）和脂質(zhì)過氧化抑制活性（57.08±3.83）與生育酚（91.11±0.07，57.28±0.84）相當(dāng)且優(yōu)于商業(yè)抗氧化劑BHT（86.37±0.08，54.50±0.28）。Kontham 等［18］用硫辛酸與不同的醇進(jìn)行酯化得到相應(yīng)的硫辛酸酯并對其熱穩(wěn)定性、抗磨性（AW）、極壓（EP）和抗氧化（AO）性能進(jìn)行了測定。在合成基液中的摩擦學(xué)試驗表明，所合成的化合物均為抗磨極壓添加劑。與工業(yè)抗氧化劑BHT（氧化起始溫度：221℃，分解溫度：230℃）相比，所有制備的酯具有良好的熱穩(wěn)定性和優(yōu)異的抗氧化性能。其中癸烷-1，10-雙二烷基（5-（1，2-二硫戊環(huán)-3-亞基））戊酸酯表現(xiàn)出最好的熱穩(wěn)定和抗氧化特性。氧化起始溫度和分解溫度分別達(dá)到295℃和320℃。

2.2 抗癌活性

α-硫辛酸是一種天然存在的輔酶因子，存在于多種調(diào)節(jié)代謝的多酶復(fù)合物中，具有抗癌抗腫瘤活性［33-34］。研究表明，對α-硫辛酸分子改性后獲得的衍生物仍然具有顯著的抗腫瘤抗癌活性。

2.2.1 抑制癌細(xì)胞活性 徐廟軍等［35］通過綠色環(huán)保的四步一鍋法合成α-硫辛酸，并進(jìn)一步通過酯化、肼化和腙化得到不同的硫辛酸酰肼衍生物。采用四氮唑鹽還原法（MTT 法）對衍生物進(jìn)行了抗腫瘤活性測試，結(jié)果表明，α-硫辛酸的衍生物均具有顯著的抗腫瘤活性，尤其是衍生物1-（4-羥基苯基亞甲基）-2-（1，2-二硫雜環(huán)戊烷-3-基）戊酰肼，其IC50值達(dá)到3.69 μg/mL，具有相當(dāng)于抗癌藥物順鉑（IC50=2.62μg/mL）的抑制腫瘤活性；李珊珊［36］將替拉扎明和色氨酸衍生物分別與外消旋的或光學(xué)純的硫辛酸進(jìn)行酰胺縮合制得目標(biāo)縮合物。采用MTT比色法考察目標(biāo)縮合物的體外抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)其對人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562、人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞ES-2、人前列腺癌細(xì)胞PC-3、人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 和人肺癌細(xì)胞A549 均具有一定的

抑制活性。其中，化合物N-（2，7，8-苯并三唑-2，7-二氮氧化物）硫辛酰胺的活性最高，對5 種被測細(xì)胞株的IC50值均能控制在10 μmol/L 以內(nèi)。

2.2.2 抑制細(xì)胞遷移 Olejarz 等［15］以硫辛酸與別黃木素為底物進(jìn)行酯化反應(yīng)生成新的化合物硫辛酸別黃木素酯（LAA），并對其進(jìn)行了抗癌活性評價。結(jié)果表明，LAA 對人正常皮膚細(xì)胞HaCaT（IC50=55.5μmol/L）的毒性低于對癌細(xì)胞系HTB-140（IC50=34.1 μmol/L）和A549 細(xì)胞（IC50=37.2 μmol/L）的毒性。此外，LAA 可顯著（P＜0.001）抑制細(xì)胞遷移，濃度為20 μmol/L 時，LAA 抑制A549 細(xì)胞遷移39.5%，HTB-140 細(xì)胞47.9%，HaCaT 細(xì)胞35.7%。當(dāng)濃度為40 μmol/L 時，A549 細(xì)胞遷移被抑制49.2%，HTB-140 細(xì)胞56.4%，HaCaT 細(xì)胞遷移被抑制47.9%。

3 結(jié)論與展望

本文對近年來硫辛酸衍生物的化學(xué)和生物轉(zhuǎn)化法合成情況及其抗氧化活性和抑制癌細(xì)胞活性研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，彌補(bǔ)了現(xiàn)階段關(guān)于硫辛酸衍生物的合成與活性研究進(jìn)展總結(jié)不足的缺陷?，F(xiàn)階段對于硫辛酸衍生物的制備及其活性評價主要存在下列問題：（1）目前國內(nèi)外關(guān)于生物轉(zhuǎn)化制備硫辛酸衍生物的研究報道不多，廣大研究學(xué)者還需拓寬思路，盡可能引入更多的活性基團(tuán)及適當(dāng)?shù)拇呋瘎?，進(jìn)一步豐富硫辛酸衍生物的種類及其功能特性，提高產(chǎn)率，縮短反應(yīng)時間，是現(xiàn)階段待解決的問題。（2）現(xiàn)在絕大部分與生物轉(zhuǎn)化在天然產(chǎn)物化學(xué)中應(yīng)用的相關(guān)研究工作仍停留在酶的篩選、反應(yīng)條件的優(yōu)化水平上，對生物轉(zhuǎn)化規(guī)律的歸納、生物催化機(jī)制的研究相對薄弱，尤其從分子水平對酶的三維結(jié)構(gòu)與其立體選擇性的關(guān)系及其底物與酶的結(jié)合位點和親和力等方面的研究更少。（3）硫辛酸衍生物的抗氧化機(jī)理、抗癌機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系尚不清楚。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，相信生物轉(zhuǎn)化將會被更好地應(yīng)用到天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)修飾上來，更多不同種類的硫辛酸酯類衍生物將被合成，其抗氧化、抗癌、抗衰老等多方面的活性會被不斷發(fā)掘，抗氧化機(jī)理和抗癌機(jī)制會得到深入的研究。我們有理由相信未來硫辛酸及其衍生物將會被更好的應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。